Name: imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Vi presentiamo le procedure dettagliate per l&#39;imaging locali Ca 2+ eventi nelle cellule SH-SY5Y neuroblastoma umano. Tali procedure possono essere adattati a immagine intracellulare Ca 2+ segnali in molti tipi cellulari 8-10. 1. Preparazione di cellule <ol><li> Cultura le cellule per essere ripreso secondo le istruzioni elencate sul sito web del fornitore. </li><li> Pochi giorni prima di imaging, le cellule coltivate raccolto in un pallone di coltura di tessuto utilizzando 1 ml di 0,25% tripsina / EDTA (2-3 min). Dopo il distacco, aggiungere un volume uguale di terreni di coltura per inattivare la tripsina. </li><li> Eseguire un numero di cellule utilizzando un emocitometro e sementi cellule in piatti di imaging con fondo di vetro ad una densità di 3-7 x 10 4 cellule per piatto. Selezionare le celle per esperimenti di imaging quando raggiungono il 60% di confluenza (2-3 giorni). </li></ol> 2. preparazione di soluzioni e reagenti <ol><li> Preparare un Ca 2+ -contenenti HEPES bufferedsoluzione salina (Ca 2+ -HBSS) composto (mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 e 10 HEPES, glucosio; pH = 7,4 a temperatura ambiente (RT) con NaOH. Preparare Ca 2+ -HBSS senza l&#39;aggiunta di glucosio e conservare a 4 ° C; aggiungere alla soluzione di glucosio immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Solubilizzare forme membrana permeanti della fluorescenza Ca 2+ indicatore Cal-520 (1 mM), CI-IP 3 (200 mM), e EGTA (100 mM) in dimetil solfossido (DMSO) contenente il 20% Pluronic F-127. Aliquota questi reagenti in provette Eppendorf e conservare, al riparo dalla luce e dall&#39;umidità, a -20 ° C. </li></ol> 3. celle di carico con membrana permeabile Cal-520, ci-IP 3 e EGTA <ol><li> Preparare il &quot;tampone di caricamento&quot; diluendo soluzioni di riserva di membrana permeabile Cal-520 e ci-IP 3 ad una concentrazione finale di 5 micron e 1 micron, rispettivamente, a Ca 2+ -HBSS. </li><li> Aspirare cusupporti lture e risciacquare cellule sostituendo media con Ca 2+ -HBSS tre volte. </li><li> Rimuovere Ca 2+ -HBSS e incubare cellule in tampone di caricamento per 60 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Rimuovere tampone di caricamento e lavare le cellule sostituendo media con Ca 2+ -HBSS tre volte. <ol><li> Se lo si desidera, in questa fase, celle di carico con EGTA / AM diluendo la soluzione madre di una concentrazione finale di 5 micron di Ca 2+ -HBSS e poi incubare cellule per 30-60 min a RT al buio. A seguito di questa incubazione, lavare le cellule tre volte con Ca 2+ -HBSS prima di procedere alla fase 3.5. </li></ol></li><li> Incubare le cellule a Ca 2+ -HBSS per 30 minuti per consentire la de-esterificazione di reagenti caricati. </li><li> Immediatamente prima di imaging, sostituire Ca 2+ -HBSS con &quot;fresco&quot; Ca 2+ -HBSS per rimuovere il colorante che potrebbe essere fuoriuscito nella vasca durante l&#39;incubazione finale. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Acquisizione Immagine <ol><li> Mettere una piccola goccia di olio per immersione sul &#39;obiettivo 100X APO TIRF (NA 1.49). </li><li> Montare il piatto di imaging sul palco del microscopio invertito e portare le cellule a fuoco con luce trasmessa. È importante proteggere il piatto di imaging per evitare movimenti durante la registrazione. </li><li> Illuminare le cellule con un laser 488 nm per eccitare Cal-520 e raccogliere fluorescenza emessa (λ&gt; 510 nm) utilizzando una fotocamera EMCCD ad alta velocità. NOTA: Il pacchetto software che opera il microscopio consente all&#39;utente di tradurre una lente di focalizzazione consentendo il fascio laser da introdurre sia sul bordo estremo della apertura posteriore dell&#39;obiettivo (per TIRF eccitazione) o più centralmente (per l&#39;eccitazione &quot;WF&quot;). </li><li> Utilizzando il software EMCCD, ridurre il campo dell&#39;imaging dai pieni 512 x 512 pixel per raccogliere dati a risoluzione temporale necessaria per catturare locali Ca 2+ eventi. NOTA: Per esempio, quad centroacquisizione di 256 x 256 pixels accelera il tasso di acquisizione di 66 fps. È anche possibile aumentare ulteriormente la frequenza di quadro della telecamera EMCCD a 500 fps utilizzando una funzione modalità coltura isolata. </li><li> Configurare il software per registrare automaticamente pochi secondi di attività di base, fornire un lampo UV alle cellule e continuare la registrazione per altri 10-30 secondi. NOTA: Un flash UV viene trasportato utilizzando una sorgente di luce ad arco allo xeno introdotto attraverso un UV riflettente specchio dicroico nella porta posteriore del microscopio. La durata e l&#39;intensità del flash UV è regolata empiricamente ad evocare una frequenza desiderata di locali Ca 2+ eventi. </li><li> Salvare i file come immagine pile per l&#39;analisi off-line. </li></ol> 5. Automated Ca 2+ Analysis Immagine NOTA: E &#39;possibile visualizzare, elaborare e analizzare i dati acquisiti utilizzando molti pacchetti software commerciali. Tuttavia, abbiamo sviluppato un algoritmo per automatizzare rapidamente all&#39;identificazione di und analisi dei locali Ca 2+ segnali. Una descrizione dettagliata dei filtri spaziali e temporali utilizzati in questo algoritmo, generazione di Af / F 0 e identificazione / analisi di routine può essere trovato in 11. Questo algoritmo è stato sviluppato per funzionare su piattaforma software Python open-source, e può essere ottenuto, insieme ai campioni di dati sperimentali e istruzioni di utilizzo, inviando l&#39;autore corrispondente (ismith@uci.edu). <ol><li> Convertire i file da importare nella algoritmo personalizzato scritto nel formato di file multi-piano .tiff. </li><li> Individuare la cartella che contiene l&#39;algoritmo di analisi e fare doppio clic run.exe. </li><li> Selezionare il file .tiff da analizzare. </li><li> Scegli parametri di analisi nella finestra di dialogo aperta. Vedi Figura 2A per i parametri di default per i dati di esempio. </li><li> Determinare il livello di nero per essere compensato dalla pila dell&#39;immagine o spostando il cursore su una parte del campo di vista che fa not contengono una cella (Figura 2B) o inserendo manualmente un livello di nero con il prompt &#39;Set Black Level&#39;. </li><li> Osservare quattro finestre sullo schermo seguente analisi dal software (Figura 2C-F). C è una immagine in bianco e nero di riposo di fluorescenza dalle cellule in fase di analisi. Quadrati bianchi sovrapposti su questa immagine sono i luoghi per eventi, determinati come le posizioni baricentro delle funzioni gaussiana bidimensionali dotati di eventi. </li><li> Clicca su ogni luogo dell&#39;evento o premere i tasti cursore per scorrere tra gli eventi. Fatto questo il background-sottratto, gaussiana lisciato cambiamenti rapporto di fluorescenza (Af / F 0) a ciascuno di questi update siti finestra D. NOTA: Red evidenziato eventi sono determinati a provenire da quel particolare sito e non da &#39;sanguinare-through&#39; dall&#39;attività localizzata a siti adiacenti. La traccia blu inferiore indica se il segnale di fluorescenza al sito selezionato superato il rilevamentosoglia, mentre la linea nera identifica eventi provenienti da quel particolare sito (corrispondente al rosso eventi evidenziata). </li><li> Clicca su un rosso evidenziato evento per aggiornare finestra E che mostra l&#39;evoluzione temporale della manifestazione, e finestra F che mostra il profilo spaziale della manifestazione mediata su suo sviluppo nel tempo, insieme con il profilo spaziale della funzione gaussiana attrezzata. </li><li> Rivedere manualmente gli eventi che sono stati identificati in modo che gli artefatti possono essere rifiutati dall&#39;analisi. Eliminare tali eventi facendo clic destro rosso evidenziato eventi. NOTA: Nelle nostre mani, Ca 2+ flusso attraverso i canali singoli IP 3 R evoca segnali con Af / F 0 su 0,11, quindi sono suscettibili di essere falsi positivi eventuali &quot;eventi&quot; rilevati sensibilmente più piccoli di questo. </li><li> Esportazione dei dati selezionando &#39;Salva in Excel&#39; o esportare i dati su una base per cella disegnando intorno alla cella di interesse e selezionare &#39;Salva CellR17 ;. Nota: i dati vengono salvati nella stessa cartella stack immagine originale. </li></ol>

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	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication.">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling.">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li><li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling).">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li><li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate.">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca(2+)+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li><li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Descriviamo qui di protocolli per l&#39;imaging locali Ca 2+ eventi in cellule di mammifero utilizzando fluorescenti Ca 2+ indicatori. Inoltre, descriviamo un algoritmo con un&#39;interfaccia utente intuitiva che consente di automatizzare l&#39;identificazione e l&#39;analisi dei dati acquisiti. La procedura descritta qui utilizzare la fluorescenza Ca 2+ indicatore Cal-520, ma molti altri Ca 2+ coloranti sensibili come Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Oregon verde BAPTA-1 eseguire suf...

Ioni calcio (Ca 2+) regolano ubiquitariamente una vasta gamma di processi biologici, tra cui l&#39;espressione genica, la secrezione e cambiamenti duraturi nella plasticità sinaptica 1. Un modo attraverso il quale Ca 2+ può agire in modo così eterogeneo è attraverso i diversi modelli spaziali e temporali di Ca 2+ segnala una cellula in grado di generare. Ad esempio aumenti globali in citosolico [Ca 2+] contrazione grilletto nel tessuto muscolare liscio 2 mentre più piccola, aumenti transitori localizzati (locali Ca 2+ microdomini) stimolare l&#39;espressione genica indispensabile per l&#39;apprendimento e la memoria 3. Citosolico libero [Ca 2+] viene mantenuta a ~ 100 nm a riposo, ma può rapidamente salire a diversi micro-molare dopo l&#39;afflusso di Ca 2+ nel citoplasma attraverso Ca 2+ canali ionici -permeable situati nella membrana plasmatica e la liberazione di Ca 2+ da s intracellulariTores. Il nostro laboratorio si concentra sulla inositolo 1,4,5-trifosfato recettore (IP 3 R), che forma un canale di rilascio Ca 2+ trova nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER). In seguito al legame di entrambi IP 3 e Ca 2+ al citosolico attivando siti del recettore, il canale IP 3 R apre per liberare Ca 2+ sequestrato nel lume ER. Il rilascio di Ca 2+ può rimanere spazialmente limitata ad un piccolo gruppo di IP 3 Rs per generare un microdomini citosolico locale del Ca 2+ (Ca 2+ sfoglia 4) oppure, a seconda della prossimità del cluster vicini di IP 3 Rs, può propagare una cella con l&#39;assunzione di più siti sfoglia attraverso un processo di Ca 2+ indotta Ca 2+ -release (CICR) 5,6. L&#39;introduzione di piccole molecole fluorescenti Ca 2+ indicatore coloranti sviluppato da Roger Tsien 7, insieme con avanzate di microscopia Imagitecniche ng, ha notevolmente facilitato la nostra comprensione di Ca 2+ segnalazione. I recenti progressi nella telecamere utilizzate per microscopia permettono ora per l&#39;imaging transitori locali Ca 2+ eventi come sbuffi con risoluzione spaziale e temporale senza precedenti. Attualmente disponibili telecamere EMCCD consentono di imaging con 128 x 128 pixel a&gt; 500 fotogrammi sec -1 (fps) e la nuova generazione di complementari a semiconduttore metallo-ossido (CMOS) telecamere forniscono pixel di risoluzione più alta, e la velocità ancora più veloce a scapito della leggermente superiore livelli di rumore. In combinazione con la riflessione interna (TIRF) microscopia totale è ora possibile per singola immagine Ca 2+ eventi di canale 8,9. Questo approccio permette di immagini di centinaia di canali / eventi contemporaneamente, mentre la generazione di grandi quantità di dati (circa 1Gb al minuto) che rendono l&#39;elaborazione manuale, identificazione visiva e l&#39;analisi impraticabile e pongono un onere per lo sviluppo di algoritmi automatizzati. 2+ segnali nelle cellule di mammifero intatte utilizzando fluorescenti Ca 2+ indicatori. Dimostriamo inoltre un algoritmo sviluppato in ambiente Python open-source che automatizza l&#39;identificazione e l&#39;analisi dei locali Ca 2+ eventi immaginati sia TIRF e convenzionale ampio campo epi-fluorescenza (WF) microscopia. Anche se descriviamo questi approcci nel contesto di IP 3 -Generata Ca 2+ segnali, essi sono facilmente suscettibili di studiare i cambiamenti locali in citosolico [Ca 2+] provenienti da una varietà di Ca 2+ canali ionici -permeable situate sia in superficie membrana o organelli intracellulari 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Isopropylidene-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom imaging dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Ca citosolico 2 + ioni regolano numerosi aspetti della attività cellulare in quasi tutti i tipi di cellule, il controllo dei processi più ampio respiro, come la trascrizione genica, eccitabilità elettrica e la proliferazione cellulare. La diversità e la specificità di Ca 2+ segnale deriva da meccanismi con cui Ca 2+ segnali vengono generati ad agire su diversi temporali e spaziali scale, che vanno da oscillazioni e onde a livello delle cellule che si verificano durante i periodi di minuti per locali transitorie Ca 2+ microdomini (Ca 2+) sbuffi millisecondi duraturi. I recenti progressi nella elettroni moltiplicati CCD (EMCCD) telecamere ora consente l&#39;imaging di locali Ca 2+ segnali con una risoluzione spaziale 128 x 128 pixel a velocità&gt; 500 fotogrammi sec -1 (fps). Questo approccio è altamente parallelo e consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di canali o siti sfoglia in un singolo esperimento. Tuttavia, la grande quantità di dati generati (ca. 1 pe Gbr min) rendono identificazione visiva e l&#39;analisi di Ca 2+ locale eventi impraticabile. Qui si descrivono e dimostrare le procedure per l&#39;acquisizione, la rilevazione e l&#39;analisi di IP locale 3 mediata Ca 2+ segnali nelle cellule dei mammiferi intatte cariche di Ca 2+ indicatori utilizzando sia a livello di campo epi-fluorescenza (WF) e la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Inoltre, descriviamo un algoritmo sviluppato all&#39;interno del software dell&#39;ambiente Python open-source che automatizza l&#39;identificazione e l&#39;analisi di questi locali Ca 2+ segnali. L&#39;algoritmo localizza i siti di rilascio di Ca 2+ con una risoluzione sub-pixel; permette recensione dei dati; e uscite sequenze temporali di segnali rapporto di fluorescenza con ampiezza e dati cinetici in una tabella compatibile con Excel.

La figura 1A mostra un&#39;immagine WF di riposo Cal-520 di fluorescenza in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y umani anche carichi di ci-IP 3. L&#39;esposizione di queste cellule di un lampo di 100 msec UV per foto-release i-IP 3 suscitato transitori Ca 2+ sbuffi in siti discreti (rilevate dai cerchi bianchi in Figura 1A). Tracce di fluorescenza misurati a questi siti hanno mostrato una rapida fase di lievitazione causa aperture transitori di IP 3</su...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K Views.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

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Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

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Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

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Biologia dello sviluppo

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Dissezione del locale Ca2 + segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca2 + indicatori

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Imaging del calcio di monostrati di organoidi intestinali umani infetti da virus

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autore in primo piano: Indagine sull'interruzione virale della segnalazione epiteliale intestinale - Approfondimenti di ricerca e direzioni future 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Immunologia e infezioni

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

Visualizzazione dei cambiamenti sul circuito Neuron-Glia con la tecnica di imaging del calcio

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

<meta charset="utf8"></head><body>Tecnica di imaging ad alta risoluzione per la rilevazione di microdomini Ca2+ nelle cellule T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Svelare l'attivazione iniziale della risposta immunitaria adattativa per l'intervento terapeutico

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Imaging locale Ca

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Dissezione del locale Ca^{2 +} segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca^{2 +} indicatori

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Visualizzazione dei cambiamenti sul circuito Neuron-Glia con la tecnica di imaging del calcio

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie