The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Reino Unido Home Office ea Universidade de Edimburgo Serviços Veterinários. 1. infecção de camundongos por sonda <ol><li> Loja larvas Heligmosomoides polygyrus L3 em água destilada por até seis meses a 4 ° C. </li><li> Antes da utilização, lavar larvas L3 três vezes em água destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (com freio), mas remover todos os 500 ul de água (para evitar larvas L3 perturbador peletizada) e ressuspender o sedimento de cada vez. </li><li> Para a terceira lavagem, adicionar água a um volume exato (normalmente 40 ml) e aspirado de 20 l com uma ponta de corte de 200 mL de alargar a sua abertura. Colocar duas amostras de 20 ul sobre a superfície de um prato de cultura de 60 mm e contar as larvas L3 (geralmente móvel, e melhor visualizado sob 50X de ampliação com um microscópio de dissecção). Ressuspender o sedimento final em água destilada a uma Concentraçãn de 2.000 larvas L3 por ml. </li><li> Para a produção de ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratos oito semanas de idade, com 400 H. polygyrus larvas L3 em 200 mL de água destilada por sonda oral (ratos conter na posição vertical pela nuca do pescoço e passar suavemente a agulha de gavagem romba através da boca e do esófago para o estômago). Agitar bem antes de cada infecção (larvas resolver rapidamente em água) e 200 ul de aspirado numa seringa de 1 ml; utilizar uma agulha de gavagem dedicado com uma extremidade arredondada. Para a infecção experimental de ratos mais jovens (6-8 semanas de idade), ou outras estirpes puras (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC), infectar ratinhos com 200 larvas L3. </li></ol> 2. Propagação e Manutenção de H. polygyrus <ol><li> Coloque carvão no centro de uma grande banheira de plástico e deixe a água fria da torneira a correr sobre ele para um mínimo de 30 min (carvão ativado unwashed é tóxica para as larvas L3). Escorra a água da banheira e coloque o carvão vegetal em two camadas de papel absorvente, deixando-o exposto ao ar ambiente até ficar completamente seca. </li><li> Se forem necessários ovos, raspar fezes primeiro fora do cólon com uma pinça e tesouras (se necessário). Se for necessário um grande número de larvas L3, colocar em ratinhos uma grelha de arame e recolher partículas fecais ao longo de vários dias. </li><li> Misturar as fezes com carvão granulado numa proporção de pelo menos 1: 1, para atingir uma consistência suficiente para amortecer apenas aderir a papel de filtro. Espalhar uma camada fina sobre o centro de algum papel de filtro umedecido em uma placa de Petri e colocar isso em uma caixa úmido (adicione um pouco de toalha de papel úmido e um prato de água) no escuro durante 12-14 dias. </li><li> Remover larvas L3 a partir do dia 7 em diante, e recolhê-las em pelo menos duas ocasiões antes do papel ser descartado. As larvas formar um anel em torno da borda do papel de filtro; levantar o papel de filtro para fora do prato de petri e enxaguar as larvas que estão à esquerda da placa (usando uma pipeta, 5 ml de água estéril por placa) para um tubo de 50 ml. </li><li> Elevadorfora do papel de filtro e colher as larvas restante deixado na placa com água destilada para um tubo de 50 ml. Centrifuga-se a solução efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar as larvas três vezes com água destilada e, em seguida, armazenar a 4 ° C no máximo de 50 ml de água destilada, até ser necessário. NOTA: As larvas permanecem viáveis ​​e infectantes por pelo menos 6 meses. </li></ol> 3. Cobrança de Adulto H. polygyrus Worms <ol><li> Prepare o Aparelho de Baermann modificado com antecedência como mostrado na Figura 1. </li><li> Cull ratinhos 14 dias após a infecção. </li><li> Lavar o abdómen com etanol a 70%. Corte a pele sobre o abdômen e puxar para trás para revelar a parede abdominal anterior. Fazer incisão na linha média para entrar na cavidade peritoneal. </li><li> Remover todo o intestino delgado e grande (a partir de duodeno proximal para distal recto). Colocar num prato de Petri e seco. </li><li> Endireitar o intestino ao longo de todo o seu comprimento; excisar o cólon fezes contendo; colocar isso em um prato separado para ovos preparações posteriores. </li><li> Extirpar o proximais 20 cm de intestino delgado que contém os vermes adultos -identified pela parede relativamente espessa do duodeno e muitas vezes uma aparência vermelho devido aos vermes intra-luminais. Colocar em um (100 mm de diâmetro) caixa de Petri com 5 ml de solução de Hanks, aquecido a 37 ° C (dois espécimes por prato). </li><li> Abra a porção proximal do intestino cheio de verme longitudinalmente com a tesoura (tesoura redondas-ended são os melhores para isso), e raspar para baixo dentro do intestino alinhando com duas lâminas de vidro para remover os vermes. Em seguida, descartar a parede do intestino limpo. </li><li> Dica vermes em pequenos sacos de musselina, grampo fechado e seguro, com clipes de papel ao redor da borda do funil de vidro (Figura 1). </li><li> Preencha funil com solução de Hanks e adicionar cerca de 4 placas de Petri de vermes em cada funil. </li><li> Local aparelho em 37 ° C incubadora durante 1-2 horas, agitando suavemente a meio para desalojardetritos a partir da preparação do intestino que podem ocluir o filtro de musselina. Tome cuidado para evitar o derramamento de detritos fora do saco de musselina - isso fará com que a contaminação da preparação final HES. Os vermes adultos deveria ter migrado lentamente através do pano de musselina e estabeleceu-se na parte inferior do tubo de ensaio de vidro. Retirar cuidadosamente o tubo de ensaio da mangueira de borracha que liga em cima da pia (tendo o cuidado de evitar a perda de vermes neste momento). </li><li> Usando uma pipeta de plástico, transferir os vermes em um tubo de 50 ml e lavar seis vezes com Hanks Solution (permitir vermes de se contentar com a gravidade, ao remover a mídia com um stripette, adicione 40 ml de Hanks Solution e repita cinco vezes). NOTA: cultura verme deve ser mantido estéril a partir deste ponto em diante. <ol><li> Mover para uma câmara de fluxo laminar e lavar mais seis vezes em solução estéril de Hank suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, pronto para a cultura in vitro. </li></ol></li><li> Contar overmes adultos recuperados por tomar duas amostras de 20 l retomado com um corte de ponta amarela de alargar a sua abertura; esperar que aproximadamente 50% da quantidade de larvas inoculadas. </li></ol> 4. Configurando culturas para HES: Preparação Médio, lavagem vermes adultos <ol><li> Embeber os vermes de 3,11 em cerca de 10 ml de RPMI suplementado com 10% de gentamicina durante 20 min, deixando o tubo de repouso em um ângulo para assegurar vermes são totalmente cobertas. </li><li> Executar esta numa câmara de fluxo laminar: lavar novamente seis vezes com a solução de Hanks (suplementado com 5 U / ml de penicilina e 5 ug / ml de estreptomicina). </li><li> Prepare H. media polygrus. </li><li> A manutenção de esterilidade numa capela de fluxo laminar, para 500 ml de RPMI 1640, adicionar 11,1 mL de 45% de glucose (concentração final 1,2% em RPMI1640 contém 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-Estreptomicina (concentração final de 5 U / ml de penicilina, 5 ug / ml de estreptomicina), 5 mL de L-glutamina (concentração final 2 mM), e5 ml de gentamicina (concentração final de 1%). Não adicione FCS. </li><li> Vermes alíquotas em frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 vermes em 15 ml H. polygyrus media por frasco, e coloque na posição vertical em 37 ° C incubadora (5% de CO 2) por 3 semanas. </li></ol> 5. Preparação de HES <ol><li> Recolha HES contendo meio de cultura a partir de culturas em intervalos de não mais do que duas vezes por semana, deixando de lado a primeira coleção após 24 horas de cultura (devido aos altos níveis de contaminação LPS e proteínas do hospedeiro - podem ser processados ​​separadamente ou descartados). Mantenha cada recolha selectiva e claramente marcado com a data e número do lote. Substitua-o por um volume igual de H. polygyrus media em cada ocasião. </li><li> Centrífuga-HES contendo meio a 400 x g durante 5 min. Em seguida, filtrar esterilizar através 0,2 mm filtros de baixa proteína de ligação em tubos de 50 ml. Loja no freezer -20 ° C claramente identificada com data de verme colheita e data de HES collection. </li><li> Após 21 dias de coleta de HES de cultura, descarte worms. </li><li> Piscina 500-1000 ml de HES sobrenadante (geralmente a partir de estoque congelado, e não incluindo a recolha hr primeiro 24) e se concentram sobre um filtro 3000 MWCO no dispositivo de ultrafiltração sob pressão de azoto. NOTA: Tenha muito cuidado para não deixar a corrida filtro seco. <ol><li> Para configurar o dispositivo de filtro, primeiro lave 3 membrana kDa lado do brilhante para baixo num copo de 1 litro com água destilada por 3 x 20 min com agitação. Monte o dispositivo de ultrafiltração, conforme as instruções do fabricante, com membrana de filtro lado brilhante para cima. Em lugar do armário, a 4 ° C e passar 50 ml de água destilada através antes de começar a concentrar HES reunidas. </li><li> Adicionar a cada tubo de HES no dispositivo de filtração, conforme necessário (100-140 mL por dia), até que o volume é concentrada até 2-5 ml. </li></ol></li><li> A fim de remover os contaminantes do meio de cultura contendo HES, adicionar 50 ml de pirogénio-PBS livre para o dispositivo de filtração e, em seguida, concentrar e para baixo a cerca de 2 ml. Repetir este passo duas vezes (150 ml de PBS no total). Transferir HES em um tubo de 15 ml, esterilizar filtro (com um filtro de 0,2 um) numa câmara de fluxo laminar e medir a concentração de proteína usando um espectrofotómetro (E 280 = 10) ou pelo ensaio de Bradford. </li><li> Aliquota, a etiqueta com o número de lote e data, e congelamento a -80 ° C. </li><li> Realizar um ensaio de LAL cromogénico de acordo com os protocolos do fabricante em cada lote de HES antes da utilização. Se os níveis de LPS são maiores do que 1 U LPS por 1 mg de proteína, considere não usar este lote para experimentos in vivo ou em culturas in vitro. </li><li> Processar os HES recolhidos às 24 h separadamente da mesma maneira; ele conterá LPS e algumas proteínas do hospedeiro e, enquanto não é adequado para experiências funcionais, é uma fonte útil de moléculas individuais que podem ser isolados por purificação de afinidade de anticorpo monoclonal. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

O ciclo de vida de H. polygyrus procede de maneira consistente com fiabilidade. Após a ingestão singular ou gavagem oral de larvas L3 no dia 0, começam a formar cistos sob a serosa duodenal por dia 5, progredindo para moults larvais e, em seguida, como vermes adultos emergentes para o lúmen do intestino desde o dia 10, os ovos podem ser vista nas fezes, a partir de dia 14 e granulomas são visíveis na superfície serosa do duodeno a partir do dia 21. O protocolo descrito acima (e resumidos na Figura 6) permite a produção de elevado rendimento de H. polygyrus produtos de excreção e secreção (HES), além de recuperação de confiança de larvas L3 viável para futuras infecções experimentais e de ciclo de vida. Infecção polygyrus H. demonstrou ser protectora em modelos de asma dependentes OVA ou Der p 1 (Casa alérgeno dos ácaros do pó) 14. Além disso, a supressão da inflamação das vias aéreas pode ser transferido com CD4 + CD25 + </sup&gt; células T reguladoras 14 ou CD19 + CD23 hi células B reguladoras 24 de não-sensibilizados, H. polygyrus ratinhos infectados. Em modelos de auto-imunidade, H. polygyrus infecção tem sido mostrado para ser supressiva no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) de esclerose múltipla 9 e supressão pode ser transferido com a utilização de células CD4 + T ou células B CD19 + a partir de ratinhos infectados 24. Heligmosomoides polygyrus produtos de excreção e secreção (HES) modulam a resposta imune do hospedeiro e suprimir a inflamação mediada por Th2 por um número de mecanismos (esboçado na Figura 7), incluindo: a) A inibição da capacidade de resposta à estimulação de células dendríticas 25, b) indução de células T CD4 + Foxp3 + células T reguladoras 18. e c) o bloqueio da produção de IL-33 20. HES tem sido mostrado para ser protectora quando administrada umat sensibilização ou desafio no modelo OVA-alum de asma 19 e também quando administrado por via intranasal com extrato de Alternaria alérgeno 20, através da supressão de início de IL-33 release. Evitar a contaminação LPS de HES é muitas vezes crucial para o sucesso de futuras experiências imunológicas. No protocolo descrito aqui, os passos críticos para atingir este são para garantir que os detritos contidos dentro dos sacos de musselina do aparelho Baermann não entra na preparação HES final (ver 2.10) e deixar de lado solução ES a partir da primeira 24 horas de cultura (ver 5.1). Nos últimos anos, HES foi completamente caracterizado a nível da proteômica com mais de 370 proteínas distintas identificadas 26,27. Além disso, as larvas de ES fase 4 foi submetida a análise proteómica 28. Os trabalhos em curso inclui a caracterização dos principais componentes de glicanos de HES, conhecido por ser fortemente imunogênica 3, e secretada micro-RNComo que são encapsulados em 50-100 vesículas nm ou exossomos (Buck et al., Submetido para publicação). Com o estabelecimento de protocolos reprodutíveis para a recolha de ES a partir deste parasita altamente imunomodulador, e com grande quantidade de dados de proteômica que identificam os componentes moleculares do HES, o palco já está definido para a identificação e teste terapêutico de moléculas individuais de H. polygyrus que podem mediar os efeitos principais sobre o sistema imunitário do hospedeiro.

Heligmosomoides polygyrus é um helminto gastrointestinal murino natural que está intimamente relacionado com altamente prevalentes nematóides parasitos humanos 1. Em contraste com outros modelos de nematóides tais como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus consistentemente estabelece a infecção crônica em camundongos como um resultado direto de múltiplos mecanismos poderosos imunomoduladores que emprega para suprimir a resposta imune do hospedeiro 2. H. polygyrus tem um ciclo de vida direto: larvas L3 infectantes são ingeridos por transmissão FECO-oral (ou administrada por sonda oral no ambiente de laboratório), após o que eles migram para a camada subserosal do duodeno e enquistam antes de voltar para o lúmen intestinal como vermes adultos cerca de oito dias após a infecção inicial. Acasalamento e produção de ovos ocorre no dia 10 e é possível colher vermes adultos para a cultura e recolha de produtos de excreção e secreção de Day 14 em diante 3. H. polygyrus também interage com a microflora comensal, com aumento lactobacilos presentes em camundongos susceptíveis infectados 4-6, e aumento dos níveis de H. polygyrus infecção após a exposição de ratos para Lactobacilli 6. Infecção ativa com H. polygyrus tem demonstrado proteger contra a imunopatologia em diversos modelos animais de autoimunidade 7-10, colite 11,12 alergia e 13-16. Houve, consequentemente, grande interesse no potencial de moléculas de excreção e secreção de este parasita (&quot;HES&quot;) para down-modular patologia in vivo 17,18. De fato, os efeitos protetores são vistos após o tratamento de camundongos com produtos HES 19 através de vias que estão agora a ser identificados 18,20. Aqui nós descrevemos um protocolo para a produção confiável de Heligmosomoides polygyrus e recuperação de seus produtos secretadosque pode ainda ser utilizada para uma série de investigações bioquímicas e imunológicas funcionais.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conhecido como Nematospiroides dubius, e também conhecido por alguns como H. bakeri) é um helminto gastrointestinal que emprega vários mecanismos imunomoduladores para estabelecer infecção crônica em camundongos e se assemelha infecções por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus tem sido extensivamente estudado na área de regulação imune derivada-helmíntico e foi encontrado para suprimir potentemente modelos experimentais de autoimunidade e alergia (ambos com infecção activa e produtos secretados isolado). O protocolo descrito no presente documento descreve gestão do H. ciclo de vida polygyrus para uma produção consistente de larvas L3, recuperação de parasitas adultos e coleta de seus produtos de excreção e secreção (HES).

A susceptibilidade à infecção por H. polygyrus é controlada em grande medida pelo fundo genético da estirpe de ratinho (Tabela 1); Camundongos C57BL / 6 e CBA são altamente suscetíveis 21,22. Para a manutenção do ciclo de vida do parasita, o híbrido F1 entre estas duas estirpes foi escolhido pela sua capacidade para suportar carga parasitária muito mais elevadas, sem morbidez (dano epitelial intestinal excessiva) em comparação com as estirpes parentais. Gavagem oral de 400 larvas L3 é usado para manter o ciclo de vida em ratinhos F1 (resultando em fardos de vermes adultos, mostrados na Figura 2), enquanto que uma dose de 200 larvas L3 é geralmente utilizado para experiências em estirpes puras homozigóticas (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC). No entanto, esta dose pode ter de ser reduzida de acordo com os co-factores ambientais que podem diferir entre as instalações de animais, tais como variações na flora intestinal. Os lotes de HES provaram efi reprodutívelcácia em ensaios funcionais e na composição das proteínas; Além disso, quando foram analisados ​​os sobrenadantes de cada semana sucessiva de cultura, até um total de 4 semanas, os perfis de proteínas foram encontrados para ser muito semelhante (Figura 3). Quando a concentração de HES é medida pelo ensaio de Bradford (ver 5.5), o total proteína é geralmente cerca de 1 mg / mL (Figura 4). Um método alternativo de se concentrar HES é com um concentrador centrífugo (por exemplo, 3-kDa membrana de corte Vivaspin), em que as amostras são centrifugadas a até 4.000 g numa centrifugadora de rotor basculante para fora, remoção de sais do tampão e os componentes de baixo peso molecular. Concentração centrífuga é o mais adequado para processamento de volumes pequenos (1-10 ml) e são limitados a um máximo factor de concentração de aproximadamente 30x. Ao coletar HES, prevenção da contaminação é crítica. Para evitar a contaminação com moléculas do hospedeiro, descartamos HES-containing meios de cultura a partir do primeiro de 24 horas após a colheita verme adulto a partir do intestino mouse. Nós também quantificar o nível de contaminação por LPS em cada lote de HES com um ensaio cromogénico de LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS e níveis abaixo desta são consideradas insignificantes 23. Em nossas mãos, a maioria dos lotes de HES são significativamente abaixo deste limite, a concentração média de LPS em HES sendo 0,23 U / g (Figura 5). Os efeitos de LPS em modelos in vivo de patologia (por exemplo, a supressão de respostas asmáticas) requer, pelo menos, 10 ng de LPS 23. Daí a administração in vivo de 5 ug HES de um lote com 100 pg LPS / ug HES vai incluir 500 LPS pg, bem abaixo da concentração eficaz onde LPS se torna um problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Aparelho de Baermann Baerconfiguração Aparelho mann para a coleta de adulto H. polygyrus (como descrito na seção 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: A média de Worm Burden 14 dias após a infecção com 400 L3 Larvas Média verme pesa 14 dias após a infecção com 400 larvas L3. Os pontos de dados mostrados são de 19 rodadas separadas de infecção de camundongos C57BL / 6xCBA. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: Perfis de proteínas de HES de semanas sucessivas em cultura perfil de SDS-PAGE de proteínas de HES recolhidos em semanas sucessivas de cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Quantidade final de HES a partir de 500 ml contendo meio de ES-Rendimento de proteína a partir de HES 11 lotes diferentes derivadas de cerca de 500 ml de sobrenadante da cultura. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: Níveis de contaminação por LPS de HES de contaminação por LPS em 41 lotes de HES medidos pelo ensaio de Limulus ameobocyte. Concentração de LPS Média = 86 U por mg de HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animated esquemática do H. polygyrus Ciclo de Vida Resumo das principais fases do ciclo de vida de sonda oral de larvas L3, através da recuperação de larvas e vermes adultos para isolamento de HES. Figura 7: Animated esquemática do HES e suas funções efeitos imunomoduladores chave de mediadores solúveis e exosomes contidos HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genótipo (e fundo tensão) </td><td> Fenótipo Infecção Primária </td><td> Referência </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Linhagens puras </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 e C57BL / 10 </td><td> Suscetível </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermediário </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Baixa susceptibilidade </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para citocinas ou receptores de citocinas </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Menos suscetível (a); nenhuma mudança na susceptibilidade mas aumentou granulomas (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rp transgénico (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (ratinhos C57BL / 6 ou BALB / c) </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (ratinho BALB / c ou C57BL / 6) </td><td> Altamente resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgénico(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiência de Th2, diminuiu granuloma gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Nenhuma mudança na susceptibilidade </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, aumento da susceptibilidade </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para marcadores de células T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Marginalmente maior fecundidade </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Higher &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para loci imune inata </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 do receptor de interferão (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Fecundidade mais elevada, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Mais resistentes, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: As infecções primárias com H. polygyrus em geneticamente diferentes e gene-targetted linhagens de camundongos.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

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Vídeo: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of several pathogens. Efforts have been dedicated to the cattle tick control to diminish its deleterious effects, with focus on the discovery of vaccine candidates, such as BM86, located on the surface of the tick gut epithelial cells. Current research focuses upon the utilization of cDNA and genomic libraries, to screen for other vaccine candidates. The isolation of tick gut cells constitutes an important advantage in investigating the composition of surface proteins upon the tick gut cells membrane. This paper constitutes a novel and feasible method for the isolation of epithelial cells, from the tick gut contents of semi-engorged R. microplus. This protocol utilizes TCEP and EDTA to release the epithelial cells from the subepithelial support tissues and a discontinuous density centrifugation gradient to separate epithelial cells from other cell types. Cell surface proteins were biotinylated and isolated from the tick gut epithelial cells, using streptavidin-linked magnetic beads allowing for downstream applications in FACS or LC-MS/MS-analysis.

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A modified density centrifugation gradient-based methodology was utilized to isolate epithelial cells from Rhipicephalus microplus gut tissue. Surface-bound proteins were biotinylated and purified through streptavidin magnetic beads for utilization in downstream applications.

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Bioquímica

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

Transdução Transitória das Formas Estrofes estropidas de Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genética

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Alta resolução de Microscopia Eletrônica da<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Imunologia e Infecção

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean termites are dependent on protozoa in the hindguts of workers to efficiently digest wood. Lytic peptides have been shown to kill a variety of protozoan parasites (Mutwiri et al. 2000) and also protozoa in the gut of the Formosan subterranean termite, Coptotermes formosanus (Husseneder and Collier 2009). Lytic peptides are part of the nonspecific immune system of eukaryotes, and destroy the membranes of microorganisms (Leuschner and Hansel 2004). Most lytic peptides are not likely to harm higher eukaryotes, because they do not affect the electrically neutral cholesterol-containing cell membranes of higher eukaryotes (Javadpour et al. 1996). Lytic peptide action can be targeted to specific cell types by the addition of a ligand. For example, Hansel et al. (2007) reported that lytic peptides conjugated with cancer cell membrane receptor ligands could be used to destroy breast cancer cells, while lytic peptides alone or conjugated with non-specific peptides were not effective. Lytic peptides also have been conjugated to human hormones that bind to receptors on tumor cells for targeted destruction of prostate and testicular cancer cells (Leuschner and Hansel 2004).
In this article we present techniques used to demonstrate the protozoacidal activity of a lytic peptide (Hecate) coupled to a heptapeptide ligand that binds to the surface membrane of protozoa from the gut of the Formosan subterranean termite. These techniques include extirpation of the gut from termite workers, anaerobic culture of gut protozoa (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), microscopic confirmation that the ligand marked with a fluorescent dye binds to the termite gut protozoa and other free-living protozoa but not to bacteria or gut tissue. We also demonstrate that the same ligand coupled to a lytic peptide efficiently kills termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into hindgut of workers), but is less bacteriacidal than the lytic peptide alone. The loss of protozoa leads to the death of the termites in less than two weeks.
In the future, we will genetically engineer microorganisms that can survive in the termite hindgut and spread through a termite colony as "Trojan Horses" to express ligand-lytic peptides that would kill the protozoa in the termite gut and subsequently kill the termites in the colony. Ligand-lytic peptides also could be useful for drug development against protozoan parasites.

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

We present procedures for demonstrating that ligands bind to the surface membrane of the cellulose-digesting protozoa in the gut of Formosan subterranean termites using fluorescent microscopy and that ligands coupled with lytic peptides kill these protozoa in vitro (anaerobic protozoa culture) and in vivo (injection into the termite hindgut).

Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

Biologia

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Estabelecendo Culturas Binárias Estáveis de Saccharibacterias simbióticas da Cavidade Oral

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Cultivo de

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