The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Reino Unido Home Office ea Universidade de Edimburgo Serviços Veterinários. 1. infecção de camundongos por sonda <ol><li> Loja larvas Heligmosomoides polygyrus L3 em água destilada por até seis meses a 4 ° C. </li><li> Antes da utilização, lavar larvas L3 três vezes em água destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (com freio), mas remover todos os 500 ul de água (para evitar larvas L3 perturbador peletizada) e ressuspender o sedimento de cada vez. </li><li> Para a terceira lavagem, adicionar água a um volume exato (normalmente 40 ml) e aspirado de 20 l com uma ponta de corte de 200 mL de alargar a sua abertura. Colocar duas amostras de 20 ul sobre a superfície de um prato de cultura de 60 mm e contar as larvas L3 (geralmente móvel, e melhor visualizado sob 50X de ampliação com um microscópio de dissecção). Ressuspender o sedimento final em água destilada a uma Concentraçãn de 2.000 larvas L3 por ml. </li><li> Para a produção de ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratos oito semanas de idade, com 400 H. polygyrus larvas L3 em 200 mL de água destilada por sonda oral (ratos conter na posição vertical pela nuca do pescoço e passar suavemente a agulha de gavagem romba através da boca e do esófago para o estômago). Agitar bem antes de cada infecção (larvas resolver rapidamente em água) e 200 ul de aspirado numa seringa de 1 ml; utilizar uma agulha de gavagem dedicado com uma extremidade arredondada. Para a infecção experimental de ratos mais jovens (6-8 semanas de idade), ou outras estirpes puras (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC), infectar ratinhos com 200 larvas L3. </li></ol> 2. Propagação e Manutenção de H. polygyrus <ol><li> Coloque carvão no centro de uma grande banheira de plástico e deixe a água fria da torneira a correr sobre ele para um mínimo de 30 min (carvão ativado unwashed é tóxica para as larvas L3). Escorra a água da banheira e coloque o carvão vegetal em two camadas de papel absorvente, deixando-o exposto ao ar ambiente até ficar completamente seca. </li><li> Se forem necessários ovos, raspar fezes primeiro fora do cólon com uma pinça e tesouras (se necessário). Se for necessário um grande número de larvas L3, colocar em ratinhos uma grelha de arame e recolher partículas fecais ao longo de vários dias. </li><li> Misturar as fezes com carvão granulado numa proporção de pelo menos 1: 1, para atingir uma consistência suficiente para amortecer apenas aderir a papel de filtro. Espalhar uma camada fina sobre o centro de algum papel de filtro umedecido em uma placa de Petri e colocar isso em uma caixa úmido (adicione um pouco de toalha de papel úmido e um prato de água) no escuro durante 12-14 dias. </li><li> Remover larvas L3 a partir do dia 7 em diante, e recolhê-las em pelo menos duas ocasiões antes do papel ser descartado. As larvas formar um anel em torno da borda do papel de filtro; levantar o papel de filtro para fora do prato de petri e enxaguar as larvas que estão à esquerda da placa (usando uma pipeta, 5 ml de água estéril por placa) para um tubo de 50 ml. </li><li> Elevadorfora do papel de filtro e colher as larvas restante deixado na placa com água destilada para um tubo de 50 ml. Centrifuga-se a solução efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar as larvas três vezes com água destilada e, em seguida, armazenar a 4 ° C no máximo de 50 ml de água destilada, até ser necessário. NOTA: As larvas permanecem viáveis ​​e infectantes por pelo menos 6 meses. </li></ol> 3. Cobrança de Adulto H. polygyrus Worms <ol><li> Prepare o Aparelho de Baermann modificado com antecedência como mostrado na Figura 1. </li><li> Cull ratinhos 14 dias após a infecção. </li><li> Lavar o abdómen com etanol a 70%. Corte a pele sobre o abdômen e puxar para trás para revelar a parede abdominal anterior. Fazer incisão na linha média para entrar na cavidade peritoneal. </li><li> Remover todo o intestino delgado e grande (a partir de duodeno proximal para distal recto). Colocar num prato de Petri e seco. </li><li> Endireitar o intestino ao longo de todo o seu comprimento; excisar o cólon fezes contendo; colocar isso em um prato separado para ovos preparações posteriores. </li><li> Extirpar o proximais 20 cm de intestino delgado que contém os vermes adultos -identified pela parede relativamente espessa do duodeno e muitas vezes uma aparência vermelho devido aos vermes intra-luminais. Colocar em um (100 mm de diâmetro) caixa de Petri com 5 ml de solução de Hanks, aquecido a 37 ° C (dois espécimes por prato). </li><li> Abra a porção proximal do intestino cheio de verme longitudinalmente com a tesoura (tesoura redondas-ended são os melhores para isso), e raspar para baixo dentro do intestino alinhando com duas lâminas de vidro para remover os vermes. Em seguida, descartar a parede do intestino limpo. </li><li> Dica vermes em pequenos sacos de musselina, grampo fechado e seguro, com clipes de papel ao redor da borda do funil de vidro (Figura 1). </li><li> Preencha funil com solução de Hanks e adicionar cerca de 4 placas de Petri de vermes em cada funil. </li><li> Local aparelho em 37 ° C incubadora durante 1-2 horas, agitando suavemente a meio para desalojardetritos a partir da preparação do intestino que podem ocluir o filtro de musselina. Tome cuidado para evitar o derramamento de detritos fora do saco de musselina - isso fará com que a contaminação da preparação final HES. Os vermes adultos deveria ter migrado lentamente através do pano de musselina e estabeleceu-se na parte inferior do tubo de ensaio de vidro. Retirar cuidadosamente o tubo de ensaio da mangueira de borracha que liga em cima da pia (tendo o cuidado de evitar a perda de vermes neste momento). </li><li> Usando uma pipeta de plástico, transferir os vermes em um tubo de 50 ml e lavar seis vezes com Hanks Solution (permitir vermes de se contentar com a gravidade, ao remover a mídia com um stripette, adicione 40 ml de Hanks Solution e repita cinco vezes). NOTA: cultura verme deve ser mantido estéril a partir deste ponto em diante. <ol><li> Mover para uma câmara de fluxo laminar e lavar mais seis vezes em solução estéril de Hank suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, pronto para a cultura in vitro. </li></ol></li><li> Contar overmes adultos recuperados por tomar duas amostras de 20 l retomado com um corte de ponta amarela de alargar a sua abertura; esperar que aproximadamente 50% da quantidade de larvas inoculadas. </li></ol> 4. Configurando culturas para HES: Preparação Médio, lavagem vermes adultos <ol><li> Embeber os vermes de 3,11 em cerca de 10 ml de RPMI suplementado com 10% de gentamicina durante 20 min, deixando o tubo de repouso em um ângulo para assegurar vermes são totalmente cobertas. </li><li> Executar esta numa câmara de fluxo laminar: lavar novamente seis vezes com a solução de Hanks (suplementado com 5 U / ml de penicilina e 5 ug / ml de estreptomicina). </li><li> Prepare H. media polygrus. </li><li> A manutenção de esterilidade numa capela de fluxo laminar, para 500 ml de RPMI 1640, adicionar 11,1 mL de 45% de glucose (concentração final 1,2% em RPMI1640 contém 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-Estreptomicina (concentração final de 5 U / ml de penicilina, 5 ug / ml de estreptomicina), 5 mL de L-glutamina (concentração final 2 mM), e5 ml de gentamicina (concentração final de 1%). Não adicione FCS. </li><li> Vermes alíquotas em frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 vermes em 15 ml H. polygyrus media por frasco, e coloque na posição vertical em 37 ° C incubadora (5% de CO 2) por 3 semanas. </li></ol> 5. Preparação de HES <ol><li> Recolha HES contendo meio de cultura a partir de culturas em intervalos de não mais do que duas vezes por semana, deixando de lado a primeira coleção após 24 horas de cultura (devido aos altos níveis de contaminação LPS e proteínas do hospedeiro - podem ser processados ​​separadamente ou descartados). Mantenha cada recolha selectiva e claramente marcado com a data e número do lote. Substitua-o por um volume igual de H. polygyrus media em cada ocasião. </li><li> Centrífuga-HES contendo meio a 400 x g durante 5 min. Em seguida, filtrar esterilizar através 0,2 mm filtros de baixa proteína de ligação em tubos de 50 ml. Loja no freezer -20 ° C claramente identificada com data de verme colheita e data de HES collection. </li><li> Após 21 dias de coleta de HES de cultura, descarte worms. </li><li> Piscina 500-1000 ml de HES sobrenadante (geralmente a partir de estoque congelado, e não incluindo a recolha hr primeiro 24) e se concentram sobre um filtro 3000 MWCO no dispositivo de ultrafiltração sob pressão de azoto. NOTA: Tenha muito cuidado para não deixar a corrida filtro seco. <ol><li> Para configurar o dispositivo de filtro, primeiro lave 3 membrana kDa lado do brilhante para baixo num copo de 1 litro com água destilada por 3 x 20 min com agitação. Monte o dispositivo de ultrafiltração, conforme as instruções do fabricante, com membrana de filtro lado brilhante para cima. Em lugar do armário, a 4 ° C e passar 50 ml de água destilada através antes de começar a concentrar HES reunidas. </li><li> Adicionar a cada tubo de HES no dispositivo de filtração, conforme necessário (100-140 mL por dia), até que o volume é concentrada até 2-5 ml. </li></ol></li><li> A fim de remover os contaminantes do meio de cultura contendo HES, adicionar 50 ml de pirogénio-PBS livre para o dispositivo de filtração e, em seguida, concentrar e para baixo a cerca de 2 ml. Repetir este passo duas vezes (150 ml de PBS no total). Transferir HES em um tubo de 15 ml, esterilizar filtro (com um filtro de 0,2 um) numa câmara de fluxo laminar e medir a concentração de proteína usando um espectrofotómetro (E 280 = 10) ou pelo ensaio de Bradford. </li><li> Aliquota, a etiqueta com o número de lote e data, e congelamento a -80 ° C. </li><li> Realizar um ensaio de LAL cromogénico de acordo com os protocolos do fabricante em cada lote de HES antes da utilização. Se os níveis de LPS são maiores do que 1 U LPS por 1 mg de proteína, considere não usar este lote para experimentos in vivo ou em culturas in vitro. </li><li> Processar os HES recolhidos às 24 h separadamente da mesma maneira; ele conterá LPS e algumas proteínas do hospedeiro e, enquanto não é adequado para experiências funcionais, é uma fonte útil de moléculas individuais que podem ser isolados por purificação de afinidade de anticorpo monoclonal. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

O ciclo de vida de H. polygyrus procede de maneira consistente com fiabilidade. Após a ingestão singular ou gavagem oral de larvas L3 no dia 0, começam a formar cistos sob a serosa duodenal por dia 5, progredindo para moults larvais e, em seguida, como vermes adultos emergentes para o lúmen do intestino desde o dia 10, os ovos podem ser vista nas fezes, a partir de dia 14 e granulomas são visíveis na superfície serosa do duodeno a partir do dia 21. O protocolo descrito acima (e resumidos na Figura 6) permite a produção de elevado rendimento de H. polygyrus produtos de excreção e secreção (HES), além de recuperação de confiança de larvas L3 viável para futuras infecções experimentais e de ciclo de vida. Infecção polygyrus H. demonstrou ser protectora em modelos de asma dependentes OVA ou Der p 1 (Casa alérgeno dos ácaros do pó) 14. Além disso, a supressão da inflamação das vias aéreas pode ser transferido com CD4 + CD25 + </sup&gt; células T reguladoras 14 ou CD19 + CD23 hi células B reguladoras 24 de não-sensibilizados, H. polygyrus ratinhos infectados. Em modelos de auto-imunidade, H. polygyrus infecção tem sido mostrado para ser supressiva no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) de esclerose múltipla 9 e supressão pode ser transferido com a utilização de células CD4 + T ou células B CD19 + a partir de ratinhos infectados 24. Heligmosomoides polygyrus produtos de excreção e secreção (HES) modulam a resposta imune do hospedeiro e suprimir a inflamação mediada por Th2 por um número de mecanismos (esboçado na Figura 7), incluindo: a) A inibição da capacidade de resposta à estimulação de células dendríticas 25, b) indução de células T CD4 + Foxp3 + células T reguladoras 18. e c) o bloqueio da produção de IL-33 20. HES tem sido mostrado para ser protectora quando administrada umat sensibilização ou desafio no modelo OVA-alum de asma 19 e também quando administrado por via intranasal com extrato de Alternaria alérgeno 20, através da supressão de início de IL-33 release. Evitar a contaminação LPS de HES é muitas vezes crucial para o sucesso de futuras experiências imunológicas. No protocolo descrito aqui, os passos críticos para atingir este são para garantir que os detritos contidos dentro dos sacos de musselina do aparelho Baermann não entra na preparação HES final (ver 2.10) e deixar de lado solução ES a partir da primeira 24 horas de cultura (ver 5.1). Nos últimos anos, HES foi completamente caracterizado a nível da proteômica com mais de 370 proteínas distintas identificadas 26,27. Além disso, as larvas de ES fase 4 foi submetida a análise proteómica 28. Os trabalhos em curso inclui a caracterização dos principais componentes de glicanos de HES, conhecido por ser fortemente imunogênica 3, e secretada micro-RNComo que são encapsulados em 50-100 vesículas nm ou exossomos (Buck et al., Submetido para publicação). Com o estabelecimento de protocolos reprodutíveis para a recolha de ES a partir deste parasita altamente imunomodulador, e com grande quantidade de dados de proteômica que identificam os componentes moleculares do HES, o palco já está definido para a identificação e teste terapêutico de moléculas individuais de H. polygyrus que podem mediar os efeitos principais sobre o sistema imunitário do hospedeiro.

Heligmosomoides polygyrus é um helminto gastrointestinal murino natural que está intimamente relacionado com altamente prevalentes nematóides parasitos humanos 1. Em contraste com outros modelos de nematóides tais como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus consistentemente estabelece a infecção crônica em camundongos como um resultado direto de múltiplos mecanismos poderosos imunomoduladores que emprega para suprimir a resposta imune do hospedeiro 2. H. polygyrus tem um ciclo de vida direto: larvas L3 infectantes são ingeridos por transmissão FECO-oral (ou administrada por sonda oral no ambiente de laboratório), após o que eles migram para a camada subserosal do duodeno e enquistam antes de voltar para o lúmen intestinal como vermes adultos cerca de oito dias após a infecção inicial. Acasalamento e produção de ovos ocorre no dia 10 e é possível colher vermes adultos para a cultura e recolha de produtos de excreção e secreção de Day 14 em diante 3. H. polygyrus também interage com a microflora comensal, com aumento lactobacilos presentes em camundongos susceptíveis infectados 4-6, e aumento dos níveis de H. polygyrus infecção após a exposição de ratos para Lactobacilli 6. Infecção ativa com H. polygyrus tem demonstrado proteger contra a imunopatologia em diversos modelos animais de autoimunidade 7-10, colite 11,12 alergia e 13-16. Houve, consequentemente, grande interesse no potencial de moléculas de excreção e secreção de este parasita (&quot;HES&quot;) para down-modular patologia in vivo 17,18. De fato, os efeitos protetores são vistos após o tratamento de camundongos com produtos HES 19 através de vias que estão agora a ser identificados 18,20. Aqui nós descrevemos um protocolo para a produção confiável de Heligmosomoides polygyrus e recuperação de seus produtos secretadosque pode ainda ser utilizada para uma série de investigações bioquímicas e imunológicas funcionais.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conhecido como Nematospiroides dubius, e também conhecido por alguns como H. bakeri) é um helminto gastrointestinal que emprega vários mecanismos imunomoduladores para estabelecer infecção crônica em camundongos e se assemelha infecções por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus tem sido extensivamente estudado na área de regulação imune derivada-helmíntico e foi encontrado para suprimir potentemente modelos experimentais de autoimunidade e alergia (ambos com infecção activa e produtos secretados isolado). O protocolo descrito no presente documento descreve gestão do H. ciclo de vida polygyrus para uma produção consistente de larvas L3, recuperação de parasitas adultos e coleta de seus produtos de excreção e secreção (HES).

A susceptibilidade à infecção por H. polygyrus é controlada em grande medida pelo fundo genético da estirpe de ratinho (Tabela 1); Camundongos C57BL / 6 e CBA são altamente suscetíveis 21,22. Para a manutenção do ciclo de vida do parasita, o híbrido F1 entre estas duas estirpes foi escolhido pela sua capacidade para suportar carga parasitária muito mais elevadas, sem morbidez (dano epitelial intestinal excessiva) em comparação com as estirpes parentais. Gavagem oral de 400 larvas L3 é usado para manter o ciclo de vida em ratinhos F1 (resultando em fardos de vermes adultos, mostrados na Figura 2), enquanto que uma dose de 200 larvas L3 é geralmente utilizado para experiências em estirpes puras homozigóticas (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC). No entanto, esta dose pode ter de ser reduzida de acordo com os co-factores ambientais que podem diferir entre as instalações de animais, tais como variações na flora intestinal. Os lotes de HES provaram efi reprodutívelcácia em ensaios funcionais e na composição das proteínas; Além disso, quando foram analisados ​​os sobrenadantes de cada semana sucessiva de cultura, até um total de 4 semanas, os perfis de proteínas foram encontrados para ser muito semelhante (Figura 3). Quando a concentração de HES é medida pelo ensaio de Bradford (ver 5.5), o total proteína é geralmente cerca de 1 mg / mL (Figura 4). Um método alternativo de se concentrar HES é com um concentrador centrífugo (por exemplo, 3-kDa membrana de corte Vivaspin), em que as amostras são centrifugadas a até 4.000 g numa centrifugadora de rotor basculante para fora, remoção de sais do tampão e os componentes de baixo peso molecular. Concentração centrífuga é o mais adequado para processamento de volumes pequenos (1-10 ml) e são limitados a um máximo factor de concentração de aproximadamente 30x. Ao coletar HES, prevenção da contaminação é crítica. Para evitar a contaminação com moléculas do hospedeiro, descartamos HES-containing meios de cultura a partir do primeiro de 24 horas após a colheita verme adulto a partir do intestino mouse. Nós também quantificar o nível de contaminação por LPS em cada lote de HES com um ensaio cromogénico de LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS e níveis abaixo desta são consideradas insignificantes 23. Em nossas mãos, a maioria dos lotes de HES são significativamente abaixo deste limite, a concentração média de LPS em HES sendo 0,23 U / g (Figura 5). Os efeitos de LPS em modelos in vivo de patologia (por exemplo, a supressão de respostas asmáticas) requer, pelo menos, 10 ng de LPS 23. Daí a administração in vivo de 5 ug HES de um lote com 100 pg LPS / ug HES vai incluir 500 LPS pg, bem abaixo da concentração eficaz onde LPS se torna um problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Aparelho de Baermann Baerconfiguração Aparelho mann para a coleta de adulto H. polygyrus (como descrito na seção 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: A média de Worm Burden 14 dias após a infecção com 400 L3 Larvas Média verme pesa 14 dias após a infecção com 400 larvas L3. Os pontos de dados mostrados são de 19 rodadas separadas de infecção de camundongos C57BL / 6xCBA. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: Perfis de proteínas de HES de semanas sucessivas em cultura perfil de SDS-PAGE de proteínas de HES recolhidos em semanas sucessivas de cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Quantidade final de HES a partir de 500 ml contendo meio de ES-Rendimento de proteína a partir de HES 11 lotes diferentes derivadas de cerca de 500 ml de sobrenadante da cultura. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: Níveis de contaminação por LPS de HES de contaminação por LPS em 41 lotes de HES medidos pelo ensaio de Limulus ameobocyte. Concentração de LPS Média = 86 U por mg de HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animated esquemática do H. polygyrus Ciclo de Vida Resumo das principais fases do ciclo de vida de sonda oral de larvas L3, através da recuperação de larvas e vermes adultos para isolamento de HES. Figura 7: Animated esquemática do HES e suas funções efeitos imunomoduladores chave de mediadores solúveis e exosomes contidos HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genótipo (e fundo tensão) </td><td> Fenótipo Infecção Primária </td><td> Referência </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Linhagens puras </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 e C57BL / 10 </td><td> Suscetível </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermediário </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Baixa susceptibilidade </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para citocinas ou receptores de citocinas </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Menos suscetível (a); nenhuma mudança na susceptibilidade mas aumentou granulomas (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rp transgénico (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (ratinhos C57BL / 6 ou BALB / c) </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (ratinho BALB / c ou C57BL / 6) </td><td> Altamente resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgénico(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiência de Th2, diminuiu granuloma gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Nenhuma mudança na susceptibilidade </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, aumento da susceptibilidade </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para marcadores de células T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Marginalmente maior fecundidade </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Higher &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para loci imune inata </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 do receptor de interferão (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Fecundidade mais elevada, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Mais resistentes, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: As infecções primárias com H. polygyrus em geneticamente diferentes e gene-targetted linhagens de camundongos.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

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Vídeo: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Pesquisa do câncer

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in high demand. With a close genetic and behavioral resemblance to humans, small animals such as the mouse are good candidates for human disease models, through which human-like symptoms and responses can be recapitulated. Further, the mouse genetic background can be altered to accommodate diverse demands. The NOD/SCID/IL2r&#947;null (NSG) mouse is one of the most widely used immunocompromised mouse strains; it allows engraftment with human hematopoietic stem cells and/or human tissues and the subsequent development of a functional human immune system. This is a critical milestone in understanding the prognosis and pathophysiology of human-specific diseases such as HIV/AIDS and aiding the search for a cure. Herein, we report a detailed protocol for generating a humanized NSG mouse model (hu-NSG) by hematopoietic stem cell transplantation into a radiation-conditioned neonatal NSG mouse. The hu-NSG mouse model shows multi-lineage development of transplanted human stem cells and susceptibility to HIV-1 viral infection. It also recapitulates key biological characteristics in response to combinatorial antiretroviral therapy (cART).

This protocol provides a method to establish humanized mice (hu-NSG) via intrahepatic injection of human hematopoietic stem cells into radiation-conditioned neonatal NSG mice. The hu-NSG mouse is susceptible to HIV infection and combinatorial antiretroviral therapy (cART) and serves as a suitable pathophysiological model for HIV replication and latency investigations.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

Uso da tecnologia de MHC única cadeia para investigar Co-Genealogia na ativação de células T humanas CD8 +

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

In Vivo Aumento da Indução de CélulaS T Reguladoras de Gut-Homing

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Cultivo de

Resumo

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