The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

1. הכנת כלי הזכוכית ותרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתמשיך עם הניסוי הזה, להכין אגר 5 כבשים% דם (SBA) צלחות לגידול MRSA. דגירה צלחות SBA למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרק זמן זה, מושבות אחת, מבודדות היטב צריכה להיות נוכחת כדי לשמש לחיסונים שלאחר מכן לתקשורת נוזלית. חנות מפוספסת צלחות SBA עם מושבות אחת בC ° 4 ל1-2 חודשים. הערה: הצלחות אגר דם של הכבשים באות בחבילות שהוכנו מראש, המכילות בין 20 - 25 צלחות המבוססות על היצרן, ובדרך כלל מורכבת מבסיס אגר סויה tryptic עם התוספת של 5% w / דם הכבשים v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר של מרק tryptic סויה (TSB) בתוספת גלוקוז 1% ו -0.1% NaCl. אחרי זה, לאסוף ולנקות 2 מבחנות זכוכית. אם עפעפי autoclavable שאינם זמינים למבחנות, להשתמש בנייר אלומיניום ככובע. החיטוי TSB ומבחנות יחד עם קופסא הטיפים פיפטה 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ממשלת בטיחות ביולוגית או בסמוך ללחמניות<html> en מבער, פיפטה 5 מיליליטר של העבר autoclaved TSB למבחנות autoclaved. להיות זהיר כדי להבטיח שמספיק זמן ניתנה כדי לאפשר לTSB ומבחנות להתקרר לטמפרטורת חדר. מצלחת 5% SBA מפוספס בעבר, לחסן מושבה אחת ל -6 מיליליטר מרק TSB. אחד יכיל MRSA, והמבחנה השנייה תשמש כביקורת שלילית על מנת להבטיח סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מבחנות TSB מחוסנות ולמקם אותם בחממה הדדית למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס וב 200 סל&quot;ד. לאחר פרק זמן זה התפתחותם של חיידקים צריכה להיות ברורה במבחנת MRSA ואילו צמיחה לא הייתה צריכה להתרחש במבחנת שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מיליליטר מתרבות 24 שעות ופיפטה לתוך 6 מיליליטר של TSB הטרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מיליליטר של תת-תרבות 6 שעות לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 850 x גרם. להסיר supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של H 2 O. deionized צנטריפוגה, לחזור, ומחדש להשעות. </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 2. ניקוי וההרכבה של פלדת אל-חלד ומצעי זהב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח נירוסטה ודיסקי מדגם AFM הזהב (20 מ&quot;מ ו -10 מ&quot;מ בקטרים ​​בהתאמה) ולנקות כל צד עם 5 מיליליטר של H 2 O. deionized להחזיק דיסקי מדגם ביד הדומיננטית עם מלקחיים ולהשתמש סובדומיננטה היד לפיפטה 5 מ&quot;ל בכל צד של דיסק המדגם. לאחר שטיפת שני הצדדים, דיסקי מדגם המקום בכוס המכילה 20 מיליליטר של H 2 O deionized ואחריו sonication דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מלקחיים שימוש sonication להסיר דיסקי מדגם מהכוס. הנח את הדיסקים, כך שהם מתכופפים בזווית 60 מעלות כנגד הקצה של צלחת פטרי פתוחה על מגבת נייר. השתמש המכסה של צלחת פטרי כדי לכסות את דיסקי הייבוש. בואו דיסקים להתייבש לחלוטין לפני שימשיכו. זמן הייבוש יכול להשתנות בין 4-8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יבש, להשתמש במלקחיים כדי למקם את דיסקי מדגם לתוך צלחת פטרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, functionalize המשטחים של דיסקי מדגם עם כל חומר (למשל, קולגן, hyaluronan, ננו-חלקיקי כסף, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי זה, להשתמש בפולי-L ליזין למעייל פני המצע. לפולי-L ליזין functionalization, פיפטה 200-400 μl של 0.1% פולי-L ליזין (בH 2 O) על גבי דיסקי מדגם, ולתת דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את דיסק המדגם, ולשטוף עם 1 מיליליטר של H 2 O. deionized בואו יבש על מגבות נייר כמתואר בשלב 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2x מחדש מושעה תאים נשטפו וצלחת 200-400 μl על דיסקי מדגם בתוך ארון בטיחות ביולוגי. אם דיסקי מדגם מצופים בpoly-L- ליזין, דגירה של 0.5 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של תאים על דיסקי מדגם, לשטוף דיסקי מדגם בעדינות עם 1 מיליליטר של H 2 O. deionized בואו דיסקי ייבוש למשך הלילה לפני ההדמיה. </li></ol> 3. KPFM הדמיה הערה: לצורך ניסוי זה,להשתמש סדרת Agilent 5500 ILM-AFM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל AFM, להפעיל יחידת מחשב יחד עם בקר HEB וMAC III של AFM. תוכנת הדמיה AFM הפתוח (לדוגמא, PicoView של Agilent). הקפד תחילה כדי לבחור ACAFM או לפי הייעוד הנכון הוא על AFM הדמיה במצב לסירוגין-קשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המלקחיים AFM ביד הדומיננטית, ומחזיק את בעל קליפ קפיץ פתוח עם סובדומיננטה היד, למקם שלוחה KPFM לראש-חתיכה. היזהר בעת טיפול והעברת הראש-חתיכת AFM לAFM כיחידה זו (לפחות על 5500 ILM-AFM) מכילה יחידת גביש piezo השבירה ששולטת X, Y, Z וdirectionalities סריקה. הערה: זיזי KPFM משמשים במקרה זה היו DPE מוליך Mikromasch זיזים (רעש נמוך) עם תדר תהודה ממוצע של 80 קבועי kHz והאביב של 2.7 N / m. זיזים עם תדרי תהודה אלה וקבועים קפיץ נבחרו בשל קלות שימוש שלהם.גם זיזים עם קבועי קפיץ גדולים יותר ותדר תהודה גבוה יותר יכולים לשמש להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון בזהירות את הראש-פיסה לAFM ולחבר את החוטים המתאימים (במקרה זה שני חוטים צריכים להיות מחוברים לחשמל ב: אור הלייזר ומנוע מעלית שלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הלייזר על הקצה של שלוחה. יחידות מסוימות מכילות פונקציונלי מצלמה המאפשרת ליישור קל. אם פונקציונלי מצלמה הוא לא מקיים בAFM, ליישר על קצה שלוחה כמתואר הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הכפתור בכיוון השעון קדימה ואחורה כדי להעביר את לייזר overtop שבב שלוחה. כאשר הלייזר מגיע לשבב זה יהיה חסום ולא יהיה עוד לעין. לפנות רק את הידית כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית הקדמית אל הגב נגד כיוון השעון עד לנקודת הלייזר מופיעה שוב. הלייזר הוא עכשיו על הקצה של השבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית מהשמאל לימין כדי למקם את הלייזר על שלוחה. כמו הלייזר עובר על שלוחתו תיעלם ותופיע מחדש iרצף מהיר n. כתם הלייזר צריך להיות גלוי בכיסוי הזכוכית החלבית שבו יחידת photodiode מאוחר יותר לשבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הכפתור אל הגב מול נגד כיוון השעון כדי להעביר את הנקודה במורד שלוחה לכיוון הקצה עד הנקודה על הזכוכית החלבית נעלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל כפתור בכיוון השעון אל הגב מול רק מעט על מנת למצב את הלייזר כך שהוא פשוט יושב על קצה שלוחה. כתם הלייזר יופיע מחדש בזכוכית החלבית. הערה: זוהי שיטת מיצוב הלייזר לזיזי קרש הקפיצה. לזיזים משולשים, תהליך היישור שונה במקצת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהליזר מיושר, להחזיק את מנוע מעלית שלב במצב &quot;הפתוח&quot; במשך 10 שניות כדי להבטיח מספיק מקום בין שלוחה והמדגם בעת צירוף המדגם לAFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מדגם על הבמה מדגם KPFM. קרקע המדגם באמצעות חוטי נחושת. חבר את החוטים המתאימים מAFM לבמה המדגם. חבר שלכאחוז לAFM. ברוב המקרים השלב מוחזק במקום באמצעות מגנטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת AFM, מנגינת שלוחה ולאחר מכן להתחיל גישה של קצה שלוחה למדגם. ודא שזמן ההסדרה מוגדר על לא יותר מ 10 אלפיות שני, וכי מהירויות גישה לא יעלו על 2.0 מיקרומטר / sec כדי למנוע נזק קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שקצה שלוחה הוא על פני השטח המדגם, בחר גודל חלון הדמיה ואזור הדמיה אידיאלי. לייעל רווחים אני וP יחד עם הנקודה להגדיר שלוחה כך שהדמיה טופוגרפית היא מותאמת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדמיה טופוגרפית היא מותאמת, להפעיל מודול KPFM (או FM או AM מצב; כאן, להשתמש במצב FM). יש לציין כי ההדמיה KPFM היא מאוד מאתגרת מחוץ לחלון ההדמיה x 5 מיקרומטר 5 מיקרומטר. כמו כן, להדמית KPFM אופטימלית, להשתמש ברזולוציה 512 x 512 עם מהירויות איטיות סריקה (0.02-0.05 קווים / sec). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדרות FM-KPFM (לא ACAFM הגדרות), להגדיר את כונן אחוזים בין 5 - 10%. הגדר את fr שלוחהequency בין 1-5 kHz עם רוחב פס של 2 קילו-הרץ. הגדר אני ורווחי P להגדרות FM-KPFM 0.3%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתנות רוחב פס של אות ואני ורווחי P בין משטחי מדגם. כדי לייעל את ההדמיה SP, נוסף להתאים רוחב פס של אות ואני ורווחים P כדי להשיג תמונות אופטימליות. הטווח המומלץ של רווחים אני וP הם 0.22-0.35%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד וניתוח תמונות שנאסף KPFM באמצעות תוכנת עיבוד תמונת פוסט-לאסוף נתונים SP. </li></ol>

<ol>
	<li>Seth, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modeling+of+biofilm-infected+wounds:+a+review.">In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review.</a> J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).</li><li>Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+and+chronic+infections.">Biofilms and chronic infections.</a> JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).</li><li>Hoiby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+impact+of+bacterial+biofilms.">The clinical impact of bacterial biofilms.</a> Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).</li><li>Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impacts+of+hematite+nanoparticle+exposure+on+biomechanical,+adhesive,+and+surface+electrical+properties+of+E.+coli+cells.">Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).</li><li>Lorite, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+physicochemical+properties+at+the+micro+and+nano+length+scales:+role+on+bacterial+adhesion+and+Xylella+fastidiosa+biofilm+development.">Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+surface+potential+microscopy+of+spore+adhesion+on+surfaces.">Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces.</a> Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).</li><li>Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+surface+potential+of+PC12+cells+as+measured+by+Kelvin+probe+force+microscopy.">Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+the+positively+charged+bacterium+Strenotrophomonas+(Xanthomonas)+maltophilia+70401+to+glass+and+Teflon.">Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon.</a> J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).</li><li>Soon, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+surface+charge+of+colistin-susceptible+and+-resistant+Acinetobacter+baumannii+cells+measured+with+zeta+potential+as+a+function+of+growth+phase+and+colistin+treatment.">Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment.</a> J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).</li><li>Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Link+between+culture+zeta+potential+homogeneity+and+Ebp+in+Enterococcus+faecalis.">Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).</li><li>Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeta+potential+as+a+measure+of+the+surface+charge+of+mycobacterial+cells.">Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells.</a> Ann Microbiol. , (2013).</li><li>Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+biological+samples.">Atomic force microscopy of biological samples.</a> Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).</li><li>Lindsay, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+tunneling+microscopy+and+atomic+force+microscopy+studies+of+biomaterials+at+a+liquid-solid+interface.">Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface.</a> J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).</li><li>Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kelvin+probe+force+microscopy+in+application+to+biomolecular+films:+frequency+modulation,+amplitude+modulation,+and+lift+mode.">Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode.</a> Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).</li><li>Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probe+force+microscopy+and+its+application.">probe force microscopy and its application.</a> Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).</li><li>Loppacher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+demodulated+Kelvin+probe+force+microscopy+for+surface+photovoltage+tracking.">FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking.</a> Nanotechnology. 16 (3), (2005).</li><li>Domanski, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kelvin+probe+force+microscopy+in+nonpolar+liquids.">Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids.</a> Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).</li><li>Collins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+harmonic+Kelvin+probe+force+microscopy+at+the+graphene-liquid+interface.">Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface.</a> Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).</li><li>Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+potential+measurements+in+liquid+by+frequency+modulation+atomic+force+microscopy.">Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instru. 81, (2010).</li><li>Collins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+charge+screening+dynamics+and+electrochemical+processes+at+the+solid-liquid+interface+with+electrochemical+force+microscopy.">Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy.</a> Nature Comm. 5, 2871 (2014).</li><li>Pastar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+methicillin+resistant+Staphylococcus+aureus+USA300+and+Pseudomonas+aeruginosa+in+polymicrobial+wound+infection.">Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection.</a> PLoS One. 8 (2), (2013).</li><li>Brien, D. J., Gould, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+vancomycin+have+a+future+in+the+treatment+of+skin+infections.">Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections.</a> Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).</li><li>Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+surface+potential:+dual+effects+upon+ion+uptake+and.">Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and.</a> 155 (2), 808-820 (2011).</li><li>Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+teichoic+acid+net+charge+in+Staphylococcus+aureus+colonization+of+artificial+surfaces.">Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces.</a> Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).</li><li>Sinensky, A. M., Belcher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+high-resolution+protein/DNA+nanoarray+analysis+using+Kelvin+probe+force+microscopy.">Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+of+biomolecular+interaction+via+kelvin+probe+force+microscopy.">Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy.</a> ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

KPFM הועסק כטכניקה חדשנית לקבלת נתונים חשמליים פני השטח. זה בדרך כלל נעשה שימוש כאמצעי לבחינת חלוקת תשלום בכימיה וברק לאחרונה החל להיות מיושם לחקר מערכות ביולוגיות במייקרו וננו-מאזניים. מהנתונים שנאספו מצאנו כי חיידקים לא הופיעו לצרף בקלות לניקוי משטחי נירוסטה וזהב, ?...

Biofilms מיוצר על משטחי ציוד ובפצעי cutaneous מהווה בעיה עבור התעשייה הרפואית כbiofilms הוא סרבנים להסרת ויכול להוביל לעלייה בשיעור של העברת מחלות והתנגדות נגד חיידקים. קובץ מצורף הוא הצעד הראשון בהיווצרות biofilm והוא השלב הקריטי ביותר בשל ההפיכות שלה 1-3. מאפייני פני השטח מצע לשחק תפקיד מכריע בקובץ מצורף חיידקים. גורמים כגון קשיחות משטח, נקבוביות, חספוס, והידרופוביות הוכחו להשפיע קובץ מצורף חיידקים; עם זאת, מחקר קטן שבחן את תפקידו של פוטנציאל פני המצע (SP) על הידבקות של חיידקים נעשה 4,5. משטחים טעונים שלילי למנוע ההתקשרות של נבגי thuringiensis Bacillus ליציץ, סיליקון, וזהב 6. שינויים בפוטנציאל הממברנה סלולארי מעידים על שינויים בקובץ מצורף סלולארי ו5,7 תנועתיות. זה נצפה כי Hom חשמלימשטחי ogeneous יותר בקלות לקדם את ההידבקות של חיידקי 5. המאפיין את הפוטנציאל של חיידקי פני השטח בקנה המידה ננומטרי יכול לספק דרך רומן להבין קינטיקה ההידבקות של חיידקים למשטחים שונים, ובכך יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות אנטי-biofouling. בניגוד לשיטות אחרות המשמשות לאפיון קינטיקה אלקטרו של חיידקים, כגון פיזור electrophoretic אור, פוטנציאל זטה, ונחישות נקודת isoelectric, מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) מאפשרת הבדיקה של תאים בודדים במקום תרבויות שלמות 8-11. זה מועיל כאשר רוצה להשוות תאי תאים או biofilm מאפיינים חשמליים ברמת דיוק גבוהה ודיוק. KPFM הוא מודול של מיקרוסקופיה כוח האטומית (AFM). AFM פותח כתוצאה ישירה של מיקרוסקופ מנהור הסורק (STM) 12. התמונות הראשונות שפורסמו באמצעות STM נעשו על ידי גרד ביניג והיינריך Rorhrer בשנת 1982 12 </sup&gt;. ההמצאה שלהם הייתה מסוגלת לפתור מבנים אטומיים על ידי סריקה סריקת קצה מוליך חד מעל פני השטח מוליך באוויר. ההשלכות של השגת תמונות ברזולוציה גבוהה נרגשות ביולוגים שניסו במהירות כדי להשתמש STM לדגימות תמונה מיובשות של DNA, חלבונים, ווירוסים 12. יכול להיעשות גם STM בנוזלים באמצעות טיפים בדיקה מיוחדים 13. זה הוצג על ידי לינדזי et al., שהשתמש בSTM וAFM למולקולות DNA תמונה ב 10 מ&quot;מ 4 HClO ובמים, על אלקטרודות זהב 13. KPFM הודגם בקביעת פוטנציאל Surface של ניתוח דנ&quot;א וחלבון 25 ומולקולות ביולוגיות אינטראקציה עם ligands 26. KPFM פועל על ידי מדידת הבדל המגע הפוטנציאלי (CPD) בין קצה AFM מוליך שלוחה ומדגם באופן אידיאלי מוליך (איור 1, i) 14,15. דוגמאות לא בהכרח חייבות להיות (כלומר, sampl ביולוגי מוליךes). הדמיה יכולה להתבצע על נציץ, זכוכית, וכל עוד המשטח שאינו מוליך הוא דק ויש חומר מוליך בסיסי 6,7 משטחי סיליקון (שאינם מוליכים). CPD הוא שווה ערך למתח פוטנציאל פני השטח וניתן לתאר את ההבדל בפונקציות העבודה בין הקצה (קצה φ) ומדגם (מדגם φ), מחולק בתשלום האלקטרונים השלילי (- ה). כאשר קצה AFM מוליך הוא הביא קרוב למשטח מדגם (מופרד על ידי מרחק d), כוח אלקטרוסטטי (es F) נוצר כתוצאה מההבדל באנרגיות פרמי (איור 1, ii,) 15. בשלב זה, את האנרגיות של הוואקום (v E) וקצה המדגם נמצאות בשיווי משקל ותואם. על הבאת הקצה קרוב יותר אל פני השטח המדגם, משטח הקצה והמדגם בא במגע חשמלי ולפעול כקבלים מקבילים צלחת (איור 1, ii, b </stronז&gt;) 14,15. בנקודה, אנרגיות פרמי של פני השטח וקצה המדגם הופכות מיושרות, והגיעו לשיווי משקל מתמיד (איור 1, ii, ב). משטח הקצה ומדגם יחויב וCPD V יהווה בשל הבדל בפונקציות של v ועבודת E. מעשי es F באזור המגע החשמלי בשל CPD V נוצר. כוח זה בטל לאחר מכן באמצעות היישום של DC V חיצוני לקצה שיש את אותו גודל כמו CPD V נוצר (איור 1, ii, ג). זה מיושם מתח DC מבטל תשלום פני השטח באזור המגע חשמלי, והסכום של V DC הצורך לחסל את es F של CPD V הוא שווה להפרש בפונקציות העבודה בין saמשטח mple וקצה 15. יש לציין שפונקצית העבודה של הקצה ידועה והוא מסופק על ידי יצרנים. בכל שיטות KPFM, מתח AC (V AC, כ 100-500 mV) חל גם על הקצה על מנת ליצור כוחות חשמליים נעים בין הקצה והמדגם 14. זה מספק רזולוציה טובה יותר כאשר מודד שינויים בCPD V ו / או es F. בהקשר זה, שינויים בתדירות או משרעת תנודה חשמלית ניתן לתקן על ידי V DC, ועל פני השטח יכולות להיות שנוצרו מפות פוטנציאליות. נתונים מאזורים ספציפיים של מפות אלה ניתן לנתח נוספים על מנת לספק מידע על תכונות חשמליים טופוגרפיות ספציפיות. יכול להיות מופעל KPFM בשלושה מצבים: (1) מצב מעלית, (2) מצב אפנון משרעת (AM), ו- (3) מצב 14,16 אפנון תדר (FM). מצב מעלית היה inc הראשוניarnation של KPFM. מצב Lift מסתמך על שיטת שתי עוקפת שבקצה נע נגרר על פני לקבל תמונה טופוגרפית. למעבר שני הקצה מורם מרחק קבוע מראש מעל המדגם (10 - 100 ננומטר) וסרק בחזרה אל מעבר לאותו אזור. בשל שיטה זו שתי עוקפת, מצב מעלית, בהשוואה לאמנון וFM-KPFM, לוקח את הזמן הארוך ביותר לרכישת תמונה. העלאת הקצה מהמשטח מבטיחה כי es F רק ארוך טווח נמדד. כמו כן, לדבר לחצות בין מדידות פוטנציאל טופוגרפיה ופני שטח decoupled על חשבון הרזולוציה רוחב מוגבר ורגישות. AM-KPFM משפר רזולוציה רוחב ורגישות באמצעות דו-תדרים למדוד טופוגרפיה מדגם ופוטנציאל פני השטח (סריקה חד-פס) 14 בו-זמנית. במצב AM, השלוחה נעה מכאנית, בדרך כלל 5% מתחת לתדר התהודה הראשון שלה (ו 0), ונע חשמלי (through V AC) בתדר התהודה השני שלה (ו 1). שינויים במשרעת של f ליתרון 0 לדור של נתונים טופוגרפיים, ואילו שינויים במשרעת של f 1, כתוצאה משינויים בes F וCPD V, לתת נתוני מדידת פוטנציאל פני השטח. f 0 וf 1 של שלוחה מופרדים על ידי תדרים משמעותיים ואנרגיות שלאותת הצטלבות ממוזערת 14. האלקטרוניקה ראש התיבה (HEB) של AFM מפרידה את שני האותות לתת שני טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו-זמנית בסריקה אחת. FM-KPFM משפר רזולוציה עוד יותר מאשר AM-KPFM על משטחים ביולוגיים 14. FM-KPFM פועל בצורה שונה מאשר AM-KPFM בכך שהיא מודדת את השינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי ולא בכוח אלקטרוסטטי (es F) 15. כמו מצב בבוקר, מצב FM מנצל כפולים תדרים וSinglמנגנון סריקת דואר לעבור כדי להשיג טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו זמנית 14. במצב FM, השלוחה נעה מכאנית בf 0 ונעה חשמלי בתדר שונה נמוך (ו mod, 1 בדרך כלל - 5 kHz). על אינטראקציות אלקטרוסטטיות, f 0 וf תערובת mod לייצר להקות צד f mod ו 0 ±. sidebands אלה רגישים מאוד לשינויים בכוח אלקטרוסטטי, ויכול להיות מופרד מf 0 דרך HEB של AFM. מאז FM-KPFM מודד שינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי, צורת שיא הטיפים והתחזוקה / שלמותה לשחק תפקיד קריטי בשטח כולל רזולוציה פוטנציאל 14, 15. במשטח רזולוציה פוטנציאלית באמצעות AM ומצבי FM הם בטווח של 1 ננומטר רוחבי 14 -16. יש לציין כי ההדמיה KPFM ניתן לעשות זאת בנוזלים שאינם קוטביים, ולאחרונה, הוכח להיעשות ב( &lt;10 מ&quot;מ) נוזלי קוטב נמוכים יוניים (במצבים פתוח לולאה KPFM שאינו דורשים משוב הטיה, מייתר את היישום של הטיה DC) כגון מים MilliQ; עם זאת, ההדמיה KPFM טרם נעשתה על תאי חיים בפתרונות קוטביים 17-20. אתגרים נוספים הקשורים להדמית SP בנוזל הוא שפתרונות נפוצים לתאי שמירה (כלומר, שנאגרו מלוח פוספט) יש ריכוז גבוה של יונים ניידים, מה שיוביל לתגובות Faradaic, דינמיקת מטען נובע מהטיה, ודיפוזיה יון / חלוקה מחדש 20. כך, לניסוי זה, מדידות נלקחו מתאי MRSA מיובשים ומתים על משטחי poly-L ליזין פונקציונליות נירוסטה וזהב בתנאי סביבה. הדמיה יכולה להתבצע בתנאי אוויר או ואקום על דגימות ביולוגיות שכבר מיובש או משותקת על משטחים 20 בעבר. תנאי לחות גם הוכחו להשפיע הדמיה KPFM של משטחים 6. במחקר זה, אנחנו עובדים FM-KPFMוAFM כדי לבחון את התפקיד של SP על הקובץ המצורף של methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) למשטחי נירוסטה וזהב פונקציונליות poly-L- ליזין. MRSA לאחרונה צבר מעמד רב-סמים (MDR) &quot;superbug&quot; עמיד בשל התנגדות טבעית שנבחרה לאנטיביוטיקה β-לקטם רב וcephalosporins 21. זיהומי MRSA הם עכשיו יותר מאתגר, קשים, ואימתניים לטיפול, שהובילו לשימוש באנטיביוטיקה חריפה יותר כגון vancomycin או oxazolidinones שיש רמות גבוהות יותר רעילות בבני אדם, ולכן אינו יכול לשמש כטיפול לטווח ארוך 22. נירוסטה נבחרה בשל הרלוונטיות רפואיות שלה ושימוש נפוץ כחומר במחטים תת עורי, סירי לילה, ידיות דלתות, כיורים, וכו &#39;הזהב שימש כמתכת השוואתית. FM-KPFM נוצל כדי לבחון אם SP קרום חיידקים משתנה על קובץ מצורף למצעים.

<table><tbody><tr><td>5500ILM Atomic Force Microscope</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16219</td><td>Stainless steel sample discs</td></tr><tr><td>DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td><td>Mikromasch</td><td>#HQ:DPE-XSC11</td><td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.</td></tr><tr><td>PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>Gold sample discs</td></tr><tr><td>PicoView Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797B</td><td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td></tr><tr><td>Pico Image Software (Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>Pre-made plates</td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD</td><td>#257107</td><td>Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.</td></tr></tbody></table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

פוטנציאל פני השטח הוא מאפיין פיזי נפוץ להתעלם שמשחק תפקיד דומיננטי בהידבקות של מיקרואורגניזמים למצע משטחים. מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) היא מודול של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המודד את הפרש פוטנציאל קשר בין משטחים בקנה מידת ננו. השילוב של KPFM עם AFM מאפשר לדור בו זמני של פוטנציאל פני השטח ומפות טופוגרפיות של דגימות ביולוגיות כגון תאי חיידקים. כאן, אנו מעסיקים KPFM לבחון את ההשפעות של פוטנציאל פני השטח על הידבקות של חיידקים למשטחים רלוונטיים מבחינה רפואית כגון נירוסטה וזהב. מפות פוטנציאל פני השטח נמצאו הבדלים בפוטנציאל פני השטח לממברנות של חיידקים על מצעי חומר שונים. גרף צעד-גובה נוצר כדי להראות את ההבדל בפוטנציאל פני השטח באזור גבול בין פני המצע ומיקרואורגניזמים. שינויים בפוטנציאל פני השטח קרום תא נקשרו עם שינויים בחילוף חומרים ותנועתיות סלולריים. לכן, KPFM מייצג כלי רב עוצמה שיכול להיות מנוצל כדי לבחון את השינויים של פוטנציאל שטח קרום חיידקים על הידבקות למשטחי מצע שונים. במחקר זה, אנחנו מדגימים את ההליך כדי לאפיין את הפוטנציאל של תאי Staphylococcus aureus USA100 methicillin-עמיד בודדים משטח על נירוסטה וזהב באמצעות KPFM.

היכולת למדוד SP באמצעות KPFM מסתמכת על העיקרון ששני פני השטח המדגם וקצה שלוחה הם מוליך במידה מסוימת. נירוסטה וזהב פעלו משטחים מוליכים כמו שאליה צורפו MRSA. תמונות KPFM נלקחו 15 תאי MRSA על שני המשטחים עם 512 x 512 החלטות, ועם אזורי סריקה נעים בין 5 x 5 מיקרומטר עד 10 x 10 מיקרומטר. הסריקה ...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy at JoVE.com

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

surface-potential-measurement-bacteria-using-kelvin-probe-force

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.7K Views.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

Video: Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Scanning-probe Single-electron Capacitance Spectroscopy

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the electronic quantum structure of small systems - including individual atomic dopants in semiconductors. Here we present a capacitance-based method, known as Subsurface Charge Accumulation (SCA) imaging, which is capable of resolving single-electron charging while achieving sufficient spatial resolution to image individual atomic dopants. The use of a capacitance technique enables observation of subsurface features, such as dopants buried many nanometers beneath the surface of a semiconductor material1,2,3. In principle, this technique can be applied to any system to resolve electron motion below an insulating surface.
As in other electric-field-sensitive scanned-probe techniques4, the lateral spatial resolution of the measurement depends in part on the radius of curvature of the probe tip. Using tips with a small radius of curvature can enable spatial resolution of a few tens of nanometers. This fine spatial resolution allows investigations of small numbers (down to one) of subsurface dopants1,2. The charge resolution depends greatly on the sensitivity of the charge detection circuitry; using high electron mobility transistors (HEMT) in such circuits at cryogenic temperatures enables a sensitivity of approximately 0.01 electrons/Hz&frac12; at 0.3 K 5.

Scanning-probe single-electron capacitance spectroscopy facilitates the study of single-electron motion in localized subsurface regions. A sensitive charge-detection circuit is incorporated into a cryogenic scanning probe microscope to investigate small systems of dopant atoms beneath the surface of semiconductor samples.

ספקטרוסקופיה קיבוליות חד אלקטרונים סורקות-בדיקה

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the ...

Engineering

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Environment

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר<em&gt; באתר</em&gt; 3D מיפוי של תכונות פיסיקליות biofilm חיידקים

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and chemical composition of sample with nanoscale resolution. By combining AFM with IR, the spatial resolution limitation of conventional IR is overcome, enabling a resolution of 20&#8211;100 nm to be achieved. This opens the door for a broad array of new applications of IR toward probing samples smaller than several micrometers, previously unachievable by means of conventional IR microscopy. AFM-IR is eminently suited for bacterial research, providing both spectral and spatial information at the single cell and intracellular level. The increasing global health concerns and unfavorable future prediction regarding bacterial infections, and especially, rapid development of antimicrobial resistance, has created an urgent need for a research tool capable of phenotypic probing at the single cell and subcellular level. AFM-IR offers the potential to address this need, by enabling detail characterization of chemical composition of a single bacterium. Here, we provide a complete protocol for sample preparation and data acquisition of single spectra and mapping modality, for the application of AFM-IR toward bacterial studies.

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) provides a powerful platform for bacterial studies, enabling to achieve nanoscale resolution. Both, mapping of subcellular changes (e.g., upon cell division) as well as comparative studies of chemical composition (e.g., arising from drug resistance) can be conducted at a single cell level in bacteria.

מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Chemistry

Co-localizing Kelvin Probe Force Microscopy with Other Microscopies and Spectroscopies: Selected Applications in Corrosion Characterization of Alloys

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin probe, both of which measure the Volta potential difference (VPD) between an oscillating probe tip and a sample surface by applying a nulling voltage equal in magnitude but opposite in sign to the tip-sample potential difference. By scanning a conductive KPFM probe over a sample surface, nanoscale variations in surface topography and potential can be mapped, identifying likely anodic and cathodic regions, as well as quantifying the inherent material driving force for galvanic corrosion.
Subsequent co-localization of KPFM Volta potential maps with advanced scanning electron microscopy (SEM) techniques, including back scattered electron (BSE) images, energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental composition maps, and electron backscattered diffraction (EBSD) inverse pole figures can provide further insight into structure-property-performance relationships. Here, the results of several studies co-localizing KPFM with SEM on a wide variety of alloys of technological interest are presented, demonstrating the utility of combining these techniques at the nanoscale to elucidate corrosion initiation and propagation.
Important points to consider and potential pitfalls to avoid in such investigations are also highlighted: in particular, probe calibration and the potential confounding effects on the measured VPDs of the testing environment and sample surface, including ambient humidity (i.e., adsorbed water), surface reactions/oxidation, and polishing debris or other contaminants. Additionally, an example is provided of co-localizing a third technique, scanning confocal Raman microscopy, to demonstrate the general applicability and utility of the co-localization method to provide further structural insight beyond that afforded by electron microscopy-based techniques.

Kelvin probe force microscopy (KPFM) measures surface topography and differences in surface potential, while scanning electron microscopy (SEM) and associated spectroscopies can elucidate surface morphology, composition, crystallinity, and crystallographic orientation. Accordingly, the co-localization of SEM with KPFM can provide insight into the effects of nanoscale composition and surface structure on corrosion.

לוקליזציה משותפת של מיקרוסקופיית כוח הגשושית קלווין עם מיקרוסקופיות וספקטרוסקופיות אחרות: יישומים נבחרים באפיון קורוזיה של סגסוגות

Kelvin probe force microscopy (KPFM), sometimes referred to as surface potential microscopy, is the nanoscale version of the venerable scanning Kelvin ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Biology

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...