Name: protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats
Uploaded: 2015-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats at JoVE.com

Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pela Subcomissão de Investigação Animal Care, que serve como Cuidado e Uso Comitê de animal Institucional (IACUC) para o Hospital Geral de Massachusetts, e estão de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde. 1. animal Habitação e Procedimento Handling <ol><li> Após a chegada, os ratos fêmeas casa adulto Sprague Dawley cerca de 8-10 semanas de idade (pesando 200-225 g) em grupos de caixas de plástico 3-4 polegadas com cama de lascas de madeira. Mantê-los em uma dieta de acesso ad libitum à comida e água e um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz. Deixar ratos para se aclimatar às condições de habitação e de animais facilidade para um mínimo de 1 semana. NOTA: Todos os procedimentos deste manuscrito são realizados durante o ciclo de luz. </li><li> Após este período de aclimatação, lidar com todos os animais durante 5 min cada, para 2-3 dias. Adequadamente pegar a ratos, uma de cada vez (suportado pelo tronco e não pela cauda),mantê-los de forma segura, e acariciá-los durante este tempo. Lidar com os animais que aparecem mais estressado, nervoso ou ansioso por longos períodos de tempo. Faça isso para minimizar a lidar com o estresse, o que pode afetar os seguintes passos neste protocolo. NOTA: O número de dias e quantidade de tempo lidar com os animais pode variar entre diferentes laboratórios; no entanto, estes devem ser coerentes entre os experimentos dentro do mesmo laboratório. </li></ol> 2. Monitorização do ciclo estral: Vaginal Swab Manchas e Procedimento de coloração <ol><li> Adicione solução salina a 0,9% (cloreto de sódio dissolvido em água destilada). Umedeça um aplicador com ponta de algodão nesta solução. Blot a ponta usando uma toalha de papel para evitar a saturação excessiva, o que poderia levar a coleta de amostra insuficiente ou perda de células. Segurando a cauda para cima longe da abertura vaginal, insira suavemente a ponta de algodão dentro do canal vaginal e rolar em torno das paredes para capturar células vaginais soltos. </li><li> Se o animal urina na camaponta ton, substitua-o por um novo, como a contaminação da urina irá tornar mais difícil para a identificação de fase. Tenha muito cuidado para não causar sofrimento ao animal durante este procedimento, porque a exposição ao estresse vai interromper o ciclo estral. Ao recolher amostras, visam alcançar uma inserção rápida e retirada que não é muito profundo como para minimizar o estímulo extra para o colo do útero, o que pode induzir a pseudociese. NOTA: pseudogestação pode ser identificado como um ciclo estral acíclicos que tipicamente dura cerca de 12 dias, isto é, dias consecutivos de diestro 25. </li><li> Retire com cuidado a ponta do aplicador e enrolá-lo sobre uma lâmina de microscópio pré-rotulados. Evite pressioná muito difícil como muito líquido no slide pode fazer identificação de fase difícil, uma vez seco. NOTA: Um slide pode conter vários dias para cada animal, embora isso possa ser feito de acordo com as preferências individuais. </li><li> Certifique-se que as transferências de amostra para o slide. Coleta de amostras para Several dias consecutivos em uma lâmina para ser capaz de melhor acompanhar e identificar fases estral diárias alterações. NOTA: Se possível, também é ideal se as pessoas que coletam amostras de continuar a ser a mesma para todos os animais. </li><li> Uma vez que a lâmina é seco, comece o protocolo de coloração para a identificação da fase. Usando o kit de coloração (ver Tabela de Materiais), mergulhar slides de 10 vezes no fixador (azul claro), 10 vezes em solução corante (cor de rosa), e 5 vezes em solução counterstain (roxo). Lavar as lâminas com cuidado em água corrente. Vamos lâminas completamente ar seco antes de ver ao microscópio. NOTA: O longo ciclo estral tipicamente 4-5 dias consiste de (nesta ordem): estro (E), metaestro (M), diestro (D), e proestro 26 (P). O estro é caracterizado por células azuis, cornificado, metaestro por leucócitos e uma combinação de células cornificadas e nucleadas, diestro é semelhante ao metaestro na presença de tipos de células excepto eles são muito escassos, e por agregados proestro roxo-coradascélulas de nucleadas (Figura 1). Existem vários procedimentos de coloração, em adição às descritas acima, que são igualmente eficazes para citologia vaginal esfregaço. </li><li> Recolha de amostras para, pelo menos, dois ciclos completos (~ 8-10 dias), a fim de controlar com precisão as fases antes da experimentação. Seja consistente com a hora do dia da colheita de amostras. Coletar amostras de esfregaço vaginal diariamente durante e até o final do experimento. </li></ol> 3. Pré-exposição <ol><li> Antes do início do experimento, pré-expor os animais ao condicionamento câmaras que os animais possam se adaptar ao contexto (câmaras de condicionamento) antes de qualquer teste comportamental. <ol><li> Pré-expor as fêmeas para as câmaras de condicionamento (localizados em caixas atenuantes de sons), com as luzes da casa por 20-30 min por dia durante 3 dias antes de qualquer experimentação. Atribuir a caixa eles são pré-expostos a como a sua câmara para o estudo. Limpe bem tele caixas (paredes e bandejas) entre as sessões e animais para remover os odores, pois podem afetar o comportamento e ciclo estral. </li></ol></li></ol> 4. Dia 1: Habituação / Medo Condicionado <ol><li> Uma vez que os animais tenham sido verificada na fase do estro dos seus ciclos estrais, começar a fase de habituação / condicionamento da experiência de 3 dias. <ol><li> Tome pré-tom medidas iniciais de congelamento prévio para o estímulo condicionado primeiro tom (CS) apresentações em cada dia do experimento. Faça isso por meio da aquisição pontuações por cento de congelamento (calculado dividindo o segundos gastos imóvel pela duração do julgamento, multiplicado por 100) durante o intervalo de tempo de estímulo ausente no início do primeiro julgamento CS-alone antes do início CS. NOTA: Estas medidas podem ser usados ​​para avaliar e comparar os níveis de congelamento da linha de base com aquelas durante habituação, condicionado, extinção, e recall. </li><li> Para realizar o treinamento extinção durante a fase de metaestro,condicionar os ratos no seu último dia de estro. Swab e identificar fase de estro (passo 2) todos os dias antes de iniciar o protocolo experimental (condicionado / extinção / chamada). Como a fase do cio pode durar mais de um dia, o uso história ciclo de prever duração das fases para determinar quando os animais estão prontos para começar a treinar. </li></ol></li><li> Nas câmaras condicionado, ligue o chão grade pé-choque para um gerador de estimulação elétrica. Usar um nível de estimulação de 0,5-0,6 mA como o estímulo não condicionado (US). Use um kHz 4, 80 dB tom como o estímulo condicionado (CS). NOTA: Estes parâmetros podem variar entre laboratórios e podem ser modificados para o condicionamento ideal. <ol><li> Se o programa de análise de congelação requer sinais visuais (em oposição a temporal), co-activar uma luz LED com o tom. Posicionar a luz do lado de fora da câmara operante, dentro do quadro de vídeo. No início de cada ensaio, activar o diodo emissor de luz iluminada e mantê-lo até que a extremidade do the julgamento. NOTA: Esta luz não é visível pelo animal e serve apenas como um marcador para o início e final do julgamento dentro dos arquivos de vídeo gravados (a ser usado para medir o comportamento de congelamento). </li></ol></li><li> Coloque os animais para dentro das câmaras de condicionamento para 5 ensaios CS-alone de habituação. Imediatamente após a sessão de habituação, executar 7 ensaios CS-americanas de medo condicionado emparelhados. Certifique-se de que o tom CS tem a duração de 30 segundos e coterminates com o choque sec US 0,5. Ensaios são executados em todas as sessões (habituação, condicionado, extinção, e de recall), com um intervalo entre variável média de 3 minutos. </li><li> No fim da sessão de condicionamento, os animais regressar às suas gaiolas de alojamento e à instalação para animais até ao dia seguinte. </li></ol> 5. Dia 2: Estradiol Preparação <ol><li> Swab e identificar a fase de estro para todos os animais que foram submetidos Dia 1 do presente protocolo. Prepare o estradiol (também conhecida como E2, 17beta-estradiol, oubeta-estradiol) para a 15 ug / kg de dose de injecção subcutânea utilizando óleo de sésamo ou de 0,9% solução salina como veículo. </li><li> Para calcular a quantidade de estradiol para se preparar para injeções, use os pesos corporais de todos os animais, que foram medidos e registados quando eles foram condicionados no dia 1 deste protocolo. </li><li> Faça os cálculos para padronizar o volume administrado de estradiol (ou seja, 0,2 ml) por rato. Dado que o estradiol é de difícil dissolução, devido à sua insolubilidade em água e requer um grande volume de solvente para a dose pequena, preparar uma solução de reserva por mistura de estradiol em óleo de sésamo sobre o calor até se dissolver. A solução pode então ser passada através de um filtro de 0,22 um, para remover contaminantes. Por exemplo, adicionar um volume calculado de a / 1 ml de solução de óleo de sésamo 3,000 ug de estradiol para o volume total necessário de óleo de sésamo, a fim de atingir um 15 ug / kg num volume de 0,2 ml injecção por animal. NOTA: Como alternativa, utilizar outras formas de estrogênio tha<html> t são solúveis em água e mais fácil de dissolver. </li></ol> 6. Dia 2: Administração Estradiol / Formação Extinction <ol><li> Administrar o estradiol subcutaneamente. Levante a pele solta entre a escápula pelo pescoço em uma pitada suave e inserir a agulha da seringa no triângulo que é formada pelas dobras. </li><li> 30 minutos após as injecções subcutâneas de estradiol, colocar os animais nas câmaras de condicionamento e de novo começar a formação de extinção. Nesta sessão extinção, realizar 20 CS-alone ensaios, com cada ensaio que consiste em um 30 seg, 4 kHz, 80 tom dB, apresentado em um intervalo entre variável média de 3 min. NOTA: O efeito do estradiol na recordação ocorre quando o estradiol é administrado antes da formação extinção ou imediatamente após a extinção. O efeito não é observado 4 horas após a extinção, por isso é recomendado para injetar próximo da hora de início ou no final da sessão de treinamento 15. </li></ol>. le &quot;&gt; 7 Day 3: Extinction recall <ol><li> 24 horas após o treinamento extinção, pincelar os animais que Dia 1 e 2 do presente protocolo concluídas. </li><li> Coloque os animais em suas câmaras de condicionamento atribuídos (o mesmo que o dia 1 e 2). Inicie a sessão recordação extinção, apresentando 3 CS-alone ensaios (os três ensaios de recordação extinção), que consiste de apenas 3,80 dB CS-alone ensaios com intervalos entre tentativas semelhantes às 20 ensaios administrados para o treinamento extinção como descrito no passo 6.2. </li><li> Após a conclusão da sessão de recall, retornar os animais para suas gaiolas. </li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Adquirir dados comportamentais através de vídeo e analisá-los utilizando programas de computador. NOTA: Congelamento pontuações também podem ser contadas manualmente por um experimentador que é cego para o tratamento medicamentoso cronometrando episódios de congelamento durante a apresentação CS de cada julgamento, expresso em percentagem do tempo gasto congelamento durante o tom. O congelamento édefinido pela completa falta de movimento, com excepção da respiração durante os ensaios 30 sec CS-americanos. Calcule por cento congelamento dividindo os segundos gastos congelamento (imóvel) por 30 segundos (duração do julgamento) multiplicado por 100. </li></ol>

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Os autores deste manuscrito não tem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.

Extinção do medo tem sido extensivamente estudada em ratos machos com os mecanismos neurais que medeiam extinção medo condicionado identificados e avaliados sob várias manipulações. Relativamente poucos estudos analisaram ratas ou o papel das hormonas sexuais na extinção do medo. Para estudar especificamente os efeitos do estrogénio sobre a extinção do medo, naturalmente ciclagem ratas são submetidos a um paradigma comportamental de três dias. Este procedimento consiste em fases habituação / condicionado...

Diferenças sexuais inerentes são observados em vários comportamentos cognitivos e paradigmas de aprendizagem em humanos e roedores. Por exemplo, foi relatado que as mulheres geralmente têm habilidades verbais e orientada para o detalhe mais fortes, enquanto os homens têm melhores habilidades espaciais 1-3. Estas diferenças entre os sexos pode ser em parte devido à influência dos hormônios sexuais. Altos níveis de estradiol melhorar o desempenho em tarefas em que as mulheres são melhores, mas pioram o desempenho em tarefas que os homens geralmente fazem bem 4-6. Embora esta evidência é convincente, a capacidade limitada de controlar completamente ambientes experimentais em estudos humanos torna difícil determinar se esses efeitos sobre o comportamento pode ser atribuído especificamente aos hormônios. Os estudos em animais, em contraste, permite a circunstâncias totalmente controladas. Embora os mecanismos neurais básicos de extinção do medo, foram identificados e são bem estudada em machos, não é claro seestes sistemas são os mesmos em fêmeas ou como eles mudam ao longo do ciclo estral. O condicionamento do medo e extinção são amplamente utilizados paradigmas comportamentais em roedores e humanos para realizar estudos relacionados a transtornos de ansiedade. Dado que as mulheres têm um maior risco de transtornos de ansiedade, bem como a duração dos sintomas e a gravidade maior 7-13, é crítico para incluir fêmeas nestes estudos. A sub-representação das mulheres na pesquisa pode ser atribuída aos desafios de monitoramento fase de estro e contábil para os efeitos comportamentais de hormônios sexuais. Laboratórios que fazem examinar fêmeas nesta problemas encontro em conta que muitas vezes passam não declarada ou não estão descritos nos métodos para seus estudos. Emergentes evidência em roedores sugere que as diferenças sexuais em extinção do medo são modulados por hormonas sexuais 14-18. Com medo condicionado, os animais são treinados para temer um estímulo particular. Depois de uma série de apresentações de unreinforcedo estímulo, os animais aprendem a não temer a sugestão, um processo chamado de extinção. Como bem o animal aprende e consolida a memória de aprender esta tarefa pode ser observado durante um teste de recordação extinção dado algum tempo após o treinamento extinção. Menos expressão medo durante a chamada extinção demonstra boa consolidação da memória extinção. Descobertas recentes de nosso laboratório sugerem que o estrogênio pode modular a consolidação da memória de extinção do medo e melhorar a recordação extinção. Especificamente, os ratos fêmeas que são extintas em proestro, a fase do ciclo estral, durante o qual os níveis circulantes de estrogênio pico, apresentam uma melhor retenção de memória extinção. Em contraste, as mulheres que se extinguem no visor fase metaestro baixo estrogênio relativamente pobre recordação extinção, o que pode ser melhorado com a administração de estradiol exógeno antes ou imediatamente após o treino extinção 15,16. Os mecanismos neurais da extinção consolidação da memória (including o papel dos hormônios sexuais) em fêmeas não são claras. Em animais de laboratório, o papel dos hormônios pode ser investigado utilizando procedimentos de remoção cirúrgicos invasivos, como a castração e ooforectomia. Após a recuperação da cirurgia, os hormônios sexuais são frequentemente exogenamente manipulada durante a realização de uma tarefa comportamental 19. Esta abordagem tem fornecido informações importantes sobre os hormônios sexuais e é útil porque permite manipulações bem controlados de hormônios sexuais (em termos de tempo e dose) 20-23. Esta abordagem, no entanto, não se avaliar a influência das flutuações naturais que ocorrem em todo o ciclo estral nem representam animais &quot;normais&quot;, limitando assim o potencial de translação para estudos em seres humanos. Tem sido bem documentado que os níveis das hormonas sexuais femininas pico e declínio em fases específicas do ciclo estral, e as alterações de expressão de receptor de estrogénio no ciclo, ae 24 após a ovariectomia. Assim, existe a necessidade de realizar estudos sobre as fêmeas com gônadas intactas e refinar modelos experimentais para estudar com segurança os efeitos que os estados altos e baixos de estrogênio pode ter sobre as mulheres ao longo da sua vida útil. Este protocolo incide sobre o efeito do estrogênio sobre os sistemas neurobiológicos envolvidos na extinção do medo. Ele descreve como: 1) monitorar cuidadosamente o ciclo estral, 2) preparar as doses eficazes de estradiol para administração sistêmica, e 3) seguem um paradigma comportamental que inclui o condicionamento do medo, extinção, e recordar na naturalmente ciclismo ratas. Este protocolo pode ser modificado com outras manipulações farmacológicas e ferramentas celulares e moleculares para auxiliar estudos para compreender melhor as diferenças de sexo que são observados no medo condicionado comportamento extinção. Note-se que os procedimentos descritos abaixo são aqueles utilizados no nosso laboratório, e existe uma série de variações destes procedimentos in literatura.

<table><tbody><tr><td>Fear conditioning chamber</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphic State</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sound-attenuating box</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>NIR-022MD</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1024</td><td>In sesame oil for subcutaneous injection</td></tr><tr><td>Sesame oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Freezescan</td><td>Cleversys, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dip quick stain</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc.</td><td>J0322A1, J0322A2, J0322A3</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>6-inch, sterile</td></tr><tr><td>0.9% saline</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC23460-2</td><td>Sodium chloride w/v</td></tr><tr><td>Selectfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Virex II 256</td><td>Diversey, Inc.</td><td>5019317</td><td>Dilute 1:256 with water</td></tr><tr><td>Luer-Lok Tip 1ml Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic disposable needles</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26402</td><td>26-gauge</td></tr></tbody></table>

protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats

A extinção do medo condicionado tem sido extensivamente estudada em roedores machos. Recentemente, tem havido um número crescente de estudos que indicam que os mecanismos neurais para certas tarefas comportamentais e comportamentos de resposta são diferentes em fêmeas e machos. Usando fêmeas em estudos de pesquisa pode representar um desafio por causa da variação de hormônios sexuais durante o ciclo estral. Este protocolo descreve procedimentos bem estabelecidos que são úteis para investigar o papel do estrogénio na extinção medo a consolidação da memória em ratos fêmeas. Fase do ciclo estral e administração de estrogênio exógeno antes do treino extinção pode influenciar recordação extinção 24 horas mais tarde. A técnica de swab vaginal para identificação fase de estro descrito aqui ajuda o exame e manipulação de ciclismo naturalmente hormônios sexuais. O uso deste modelo básico roedor pode delimitar melhor os mecanismos pelos quais o estrogênio podem modular memória extinção do medo emfêmeas.

Neste protocolo recordação extinção do medo, por cento congelamento foi medida como um indicador do medo. Animais que extinguiu bem e retidos a memória da formação extinção exibiu baixa medo no último dia do teste comportamental durante a chamada extinção. Ratos machos e fêmeas não apresentam diferenças significativas na expressão de medo condicionado durante o condicionamento, extinção, e recordar as fases (Figura 2). No entanto, a diferença entre os sexos se torna evidente quando os...

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Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Protocolo de Estudos de Extinção do medo condicionado em Naturally Ciclismo ratas

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

13.3K visualizações.  Massachusetts General Hospital. Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

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Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Traçar medo condicionado em ratos

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

Comportamento

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats 

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Um Procedimento para o Estudo do Reintegração Footshock Induzida de cocaína Buscando em ratos de laboratório

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Neurociência

Quantifying Cognitive Decrements Caused by Cranial Radiotherapy

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For many patients afflicted with CNS and non-CNS malignancies, radiotherapy and chemotherapy offer the best options for disease control. These treatments however come at a cost, and nearly all cancer survivors (~11 million in the US alone as of 2006) incur some risk for developing cognitive dysfunction, with the most severe cases found in patients subjected to cranial radiotherapy (~200,000/yr) for the control of primary and metastatic brain tumors1. Particularly problematic are pediatric cases, whose long-term survival plagued with marked cognitive decrements results in significant socioeconomic burdens2. To date, there are still no satisfactory solutions to this significant clinical problem.
We have addressed this serious health concern using transplanted stem cells to combat radiation-induced cognitive decline in athymic rats subjected to cranial irradiation3. Details of the stereotaxic irradiation and the in vitro culturing and transplantation of human neural stem cells (hNSCs) can be found in our companion paper (Acharya et al., JoVE reference). Following irradiation and transplantation surgery, rats are then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. To critically evaluate the success or failure of any potential intervention designed to ameliorate radiation-induced cognitive sequelae, a rigorous series of quantitative cognitive tasks must be performed. To accomplish this, we subject our animals to a suite of cognitive testing paradigms including novel place recognition, water maze, elevated plus maze and fear conditioning, in order to quantify hippocampal and non-hippocampal learning and memory. We have demonstrated the utility of these tests for quantifying specific types of cognitive decrements in irradiated animals, and used them to show that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function3.
The cognitive benefits derived from engrafted human stem cells suggest that similar strategies may one day provide much needed clinical recourse to cancer survivors suffering from impaired cognition. Accordingly, we have provided written and visual documentation of the critical steps used in our cognitive testing paradigms to facilitate the translation of our promising results into the clinic.

Cognitive impairment resulting from the radiotherapeutic management of brain tumors represents a clinically intractable condition that adversely impacts quality of life. The capability to critically evaluate potential interventions for ameliorating radiation-induced cognitive decrements ultimately depends on the capability to undertake rigorous quantitative assessments of cognition.

Diminui quantificar cognitivos causados ​​pela radioterapia craniana

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For ...

Medicina

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formação extinção durante a janela de reconsolidação impede a recuperação do Medo

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Stress-Enhanced Fear Learning, a Robust Rodent Model of Post-Traumatic Stress Disorder

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders such as post-traumatic stress disorder (PTSD). To understand the biological mechanisms of fear dysregulation in PTSD, it is important to start with a valid animal model of the disorder. This protocol describes the methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of PTSD, in both rats and mice. SEFL was developed to recapitulate critical aspects of PTSD, including long-term sensitization of fear learning caused by an acute stressor. SEFL uses aspects of Pavlovian fear conditioning but produces a distinct and robust sensitized fear response far greater than normal conditional fear responses. The trauma procedure involves placing a rodent in a conditioning chamber and administering 15 unsignaled shocks randomly distributed over 90 minutes (for rat experiments; for mouse experiments, 10 unsignaled shocks randomly distributed over 60 minutes are used). On day 2, rodents are placed in a novel conditioning context where they receive a single shock; then, on day 3 they are placed back in the same context as on day 2 and tested for changes in freezing levels. Rodents that previously received the trauma display enhanced levels of freezing on the test day compared to those that received no shocks on the first day. Thus, with this model, a single highly stressful experience (the trauma) produces extreme fear of the stimuli associated with the traumatic event.

Here we describe the detailed methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of post-traumatic stress disorder, in both rats and mice. The model utilizes aspects of Pavlovian fear conditioning and freezing as an index of enhanced fear in rodents.

Aprendizagem avançada stress medo, um modelo robusto de roedor do transtorno de estresse pós-traumático

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders ...

Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the relationships between aversive events and otherwise neutral stimuli. The most-widely utilized procedures for studying emotional memories entail fear conditioning in rats. In these tasks, the unconditioned stimulus (US) is a footshock presented once or several times across single or several sessions, and the conditioned response (CR) is freezing. In a version of these procedures, called cued fear conditioning, a tone (conditioned stimulus, CS) is paired with footshocks (US) during the training phase. During the first test, animals are exposed to the same context in which training took place, and freezing responses are tested in the absence of footshocks and tones (i.e., a context test). During the second test, freezing is measured when the context is changed (e.g., by manipulating the smell and walls of the experimental chamber) and the tone is presented in the absence of footshocks (i.e., a cue test). Most cued fear conditioning procedures entail few tone-shock pairings (e.g., 1-3 trials in a single session). There is a growing interest in less common versions involving an extensive number of pairings (i.e., overtraining) related to the long-lasting effect called fear incubation (i.e., fear responses increase over time without further exposure to aversive events or conditioned stimuli). Extended fear-conditioning tasks have been key to the understanding of fear incubation&#8217;s behavioral and neurobiological aspects, including its relationship with other psychological phenomena (e.g., post-traumatic stress disorder). Here, we describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

We describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

Incubação do medo usando um protocolo estendido de condicionamento do medo para ratos

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the ...

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat are characteristic of various anxiety disorders, which are the most prevalent form of mental illness in the United States. Discovering the neurobiological mechanisms responsible for defensive behaviors will aid in the development of novel therapeutic interventions. Pavlovian fear conditioning is a widely used laboratory paradigm to study fear-related learning and memory. A major limitation of traditional Pavlovian fear conditioning paradigms is that freezing is the only defensive behavior monitored. We recently developed a modified Pavlovian fear conditioning paradigm that allows us to study both conditioned freezing and flight (also known as escape) behavior within individual subjects. This model employs higher intensity footshocks and a greater number of pairings between the conditioned stimulus and unconditioned stimulus. Additionally, this conditioned flight paradigm utilizes serial presentation of pure tone and white noise auditory stimuli as the conditioned stimulus. Following conditioning in this paradigm, mice exhibit freezing behavior in response to the tone stimulus, and flight responses during the white noise. This conditioning model can be applied to the study of rapid and flexible transitions between behavioral responses necessary for survival.

Defensive behavioral responses are contingent upon threat intensity, proximity, and context of exposure. Based on these factors, we developed a classical conditioning paradigm that elicits clear transitions between conditioned freezing and flight behavior within individual subjects. This model is crucial for the understanding the pathologies involved in anxiety, panic, and post-traumatic stress disorders.

Um novo paradigma de condicionamento do medo pavloviano para estudar o congelamento e o comportamento de voo

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

An Inescapable Cat Odor Exposure Protocol for Studying Innate and Contextual Threat Conditioning in Rats

Animals respond to threatening situations by exhibiting a number of defensive behaviors, including avoidance, freezing, and risk assessment. An animal model with an ethological approach offers a deeper insight into the biological mechanisms underlying threat responses. This paper describes a methodology to measure defensive behaviors toward both innate and learned aversive stimuli in rats. Animals were individually exposed to predator odor in an inescapable chamber to elicit a measurable, sustained, defensive state. The experimental design involved placing a rat in a familiar chamber for 10 min followed by exposure to cat odor for another 10 min in the same context. The next day, the rats were re-exposed for 10 min to the same context chamber where cat odor exposure occurred. Sessions were video-recorded and defensive behaviors were assessed on both days. 
The behavioral test was coupled with reversible functional inactivation and c-Fos immunohistochemistry techniques to determine the role of the interoceptive cortex in threat responses. Rats exposed to cat odor on the first day and re-exposed to the context chamber on the second day displayed higher levels of defensive behaviors, and that cat odor elicited a robust increase in the neural activity of the interoceptive cortex. Moreover, muscimol inactivation of the interoceptive cortex reduced the expression of defensive behaviors in response to cat odor and impaired contextual threat memory. These results show that this behavioral assay is a useful tool for studying neural mechanisms of defensive behaviors and may offer insight into mechanisms that mediate fear in humans and its related disorders.

Cat skin/fur odor exposure provides a reliable method to investigate neural circuits and mechanisms of defensive responses in rodents and may offer insight into mechanisms that mediate fear in humans. Here, we describe a protocol for investigating the role of the interoceptive cortex in threat responses in rats.

Animals respond to threatening situations by exhibiting a number of defensive behaviors, including avoidance, freezing, and risk assessment. An animal ...

Estudando Comportamentos Defensivos Ativos em Camundongos com Condicionamento de Medo Modificado

Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

Autor em destaque: Explorando correlatos neurais de comportamentos defensivos na aprendizagem e extinção do medo

To study flight behaviors in a fearful context, we introduce a modified fear conditioning protocol. This protocol ensures that mice consistently exhibit flight behaviors during cue presentation in the fear conditioning.

Condicionamento de medo modificado para induzir comportamentos de voo em camundongos

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active ...

Protocolo de Estudos de Extinção do medo condicionado em Naturally Ciclismo ratas

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Traçar medo condicionado em ratos

Um Procedimento para o Estudo do Reintegração Footshock Induzida de cocaína Buscando em ratos de laboratório

Diminui quantificar cognitivos causados pela radioterapia craniana

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

Formação extinção durante a janela de reconsolidação impede a recuperação do Medo

Aprendizagem avançada stress medo, um modelo robusto de roedor do transtorno de estresse pós-traumático

Incubação do medo usando um protocolo estendido de condicionamento do medo para ratos

Um novo paradigma de condicionamento do medo pavloviano para estudar o congelamento e o comportamento de voo

An Inescapable Cat Odor Exposure Protocol for Studying Innate and Contextual Threat Conditioning in Rats

Condicionamento de medo modificado para induzir comportamentos de voo em camundongos

Protocolo de Estudos de Extinção do medo condicionado em Naturally Ciclismo ratas

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Traçar medo condicionado em ratos

Um Procedimento para o Estudo do Reintegração Footshock Induzida de cocaína Buscando em ratos de laboratório

Diminui quantificar cognitivos causados ​​pela radioterapia craniana

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

Formação extinção durante a janela de reconsolidação impede a recuperação do Medo

Aprendizagem avançada stress medo, um modelo robusto de roedor do transtorno de estresse pós-traumático

Incubação do medo usando um protocolo estendido de condicionamento do medo para ratos

Um novo paradigma de condicionamento do medo pavloviano para estudar o congelamento e o comportamento de voo

An Inescapable Cat Odor Exposure Protocol for Studying Innate and Contextual Threat Conditioning in Rats

Condicionamento de medo modificado para induzir comportamentos de voo em camundongos

Diminui quantificar cognitivos causados pela radioterapia craniana