This work was supported by the Ogelbay fund.

1. cultivar as plantas <ol><li> 6 semanas antes da imersão, encher vasos de 5 polegadas com o solo e semear sementes de linho ¼ polegada de profundidade no solo (4 sementes por vaso). Certifique-se de firmar o solo sobre as sementes. Regue as plantas regularmente e mantê-los em tempo de verão (luz 14 horas e 10 horas escuro). </li><li> Verifique plantas regularmente para inflorescências primárias (clusters de órgãos das flores). As plantas estão prontas para transformação, quando os botões são visíveis e têm apenas formada na inflorescência (Figura 1 e 2). Para ver os gomos, cortar as folhas em torno dele, se necessário. NOTA: Usando a melhor fase da flor é crítica e está detalhado na discussão. <ol><li> Use o principal ramo da planta para o tratamento experimental, uma vez que produz mais flores do que os ramos laterais. Use os ramos laterais ou como controles (não deve ser mergulhado) ou para outros tratamentos experimentais. </li><li> Como alternativa, use os principais e secundários ramos damesma planta para o tratamento experimental e usar outra planta como um controle ou para outros tratamentos experimentais. Use etiquetas para marcar ramos individuais e flores individuais com a data e tipo de tratamento. </li></ol></li></ol> 2. Clonagem e transformação em Escherichia coli (E. coli) Células <ol><li> Clonar o fragmento / gene de interesse no local de clonagem múltipla de um vector binário vegetal albergando o ADN-T. <ol><li> Realizar a clonagem em uma etapa ou duas etapas. <ol><li> Diretamente clonar pequenas inserções neste protocolo (~ 500 pb) no vetor binário planta. Neste protocolo, utilize o vetor binário planta (PRI909). Caso contrário, use quaisquer outros vetores binários de plantas em uma estratégia similar. </li><li> Alternativamente, clonar grandes inserções (≥6.5 kb) em duas etapas: primeiro, utilizando um kit de clonagem comercial geral (não específico da instalação), então subclonar dentro do binário vector planta. </li></ol></li></ol></li><li> Configurar uma reac PCRção para amplificar o gene de interesse. Desenhar os iniciadores com locais de restrição na extremidade 5 &#39;(de acordo com o local de clonagem múltipla do vector binário vegetal em uso). <ol><li> Realizar um padrão de PCR utilizando ADN genómico de linho com as seguintes condições de ciclo: uma espera inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 94 ° C, seguido de 30 ciclos de 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, e 72 ° C durante 2 min. Realizar uma etapa de extensão final a 72 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C. </li><li> Os produtos de PCR separados de 1% de Tris / borato / EDTA (TBE) de gel de agarose, correr o gel a 100 V durante 1 h. Purificar os produtos a partir do gel e quantificar via Nanodrop. </li></ol></li><li> Configure a mistura de ligação para clonar o produto de PCR no vetor de clonagem comercial. Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Transformar a mistura de ligação em E. quimicamente competente células de E. coli como se segue. <ol><li> Adicione 2 mL da mistura de ligação em um frasco de chE. emically competente células de E. coli. Incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C (tempo de choque de calor e a temperatura depende do tipo de células utilizado). </li><li> Incubar em gelo e adicione 250 mL de caldo de super RT ideal com catabolite repressão (SOC) médio. </li><li> Tapar o tubo e incubar num agitador orbital a 200 rpm a 37 ° C durante uma hora. </li><li> Espalhe 10 - 50 ul de cada transformação sobre uma placa pré-aquecida LB (pré-aquecido a 37 ° C) + antibiótico selectivo apropriado (determinar o antibiótico selectivo de acordo com o tipo de vector de clonagem comercial utilizado). Incubar as placas a 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Escolha ~ 10 colônias para mini purificação prep plasmídeo, utilizando um kit comercial. Mini-prep de purificação de plasmídeo é geralmente realizada como se segue. NOTA: Os nomes de buffer são específicos para o kit comercial utilizado, mas as suas funções gerais são semelhantes. <ol><li> Inocular as colónias individuais em 2- 5 ml de meio LB contendo o antibiótico selectivo apropriado (determinado com base no tipo de vector utilizado comercial). </li><li> Incubar durante cerca de 8 horas a 37 ° C com agitação vigorosa (~ 300 rpm). </li><li> Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em tampão de ressuspensão a 250 ul. Misture e vortex para dispersar completamente o sedimento. </li><li> Lise das células bacterianas através da adição de 250 ul de tampão de lise, misturar bem, invertendo os tubos 4 - 6 vezes. </li><li> Neutraliza-se o lisado em tampão de neutralização e a inverter 4 - 6 vezes para misturar. Centrífuga por 10 min a ~ 17.900 xg em um microcentrifuge table-top. </li><li> Transfira os sobrenadantes a partir do passo anterior a uma coluna de centrifugação. Centrifugar novamente a ~ 17.900 xg por 30 - 60 seg. </li><li> Lava-se a coluna de centrifugação por adição de tampão de lavagem de 0,75 ml e centrifugar por 30 - 60 seg. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Centrífuga para um adicional de 1 min a remove tampão de lavagem residual. Coloque a coluna de rotação em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo. Para eluir o ADN, adicionar 50 ul de água para o centro de cada coluna. Deixe descansar por 1 min, e centrifugar por 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Analisar o Purificada plasmídeos para a presença de Insert <ol><li> Restrição Digest: <ol><li> Defina-se uma digestão de restrição para determinar a presença da inserção por digestão do plasmídeo com as enzimas de restrição utilizados para clonar o inserto. Uma restrição típico digestão dupla reacção da seguinte forma: 1 ug de plasmídeo purificado, 1 ul de cada uma das enzimas de restrição, 2 ul de 10x tampão de digestão de restrição + 2 ul de BSA (se aplicável), X ul de água (para um total de 20 ul) </li><li> Misturar suavemente e incuba-se à temperatura recomendada (varia de uma enzima para o outro). </li><li> Analisar a digestão de restrição de reacção em 1% de gel de agarose TBE, executar a 100 V durante 1 h e procurar o abandono de tamanho apropriado. </li></ol></li><li> A análise de PCR: <ol><li> Defina-se uma PCR com o plasmídeo purificado, utilizando iniciadores da região vector comercial para amplificar interior da inserção ou junção entre o vector e da inserção. Primers comuns são M13 frente e verso, e primers T3 / T7. </li><li> Neste protocolo, utilizar as seguintes condições de ciclos de PCR: uma espera inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 94 ° C, seguido de 18 ciclos a 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, e 72 ° C durante 2 min. Realizar uma etapa de extensão final a 72 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C. </li><li> Produtos de Carga de PCR em um 1% TBE em gel de agarose e correr para 100-120 V durante 1 hora. </li></ol></li><li> Sequencing: <ol><li> Enviar o plasmídeo purificado para um serviço de sequenciação comercial para analisar e confirmar a presença do inserto. </li><li> Uma vez que a construção correcta é obtida, utilizá-lo para a segunda etapa de clonagem (na planta vector binário). NOTA: As etapas 2,3-3,3pode ser eliminado se a conclusão da clonagem em uma etapa. </li></ol></li></ol> 4. Clonagem no Binary Vector Vegetal (PRI909) e E. coli Transformation <ol><li> Defina-se uma digestão dupla reacções de restrição para linearizar o vector binário vegetal e isolar o inserto clonado anteriormente usando os mesmos locais de enzimas de restrição que foram adicionados aos iniciadores (passo 2.2). </li><li> Analisar as digestões de restrição usando electroforese em gel, executar a 100 V durante 1 - 2 h. Cortar a inserção e o vector binário vegetal linearizado a partir do gel. </li><li> Use um kit comercial para purificar os produtos em gel. Consulte o manual do fabricante. </li><li> Configurar uma reacção de ligação para ligar a inserção no vetor binário planta. O inserto para vector proporção depende do tamanho do inserto e o vector binário vegetal. Neste protocolo a inserção LIS1 foi de 6,5 kb e a planta vetor binário foi de 9 kb. Portanto, utilizar uma mistura 1: 2 de inserção relação vector. </li><li&gt; Repita os passos de 2,4-3 para a transformação de bactérias, purificação de plasmídeo e análise. Uma vez que a construção correcta (insert + planta vetor binário) é obtido, prossiga para a eletroporação na etapa 5. </li></ol> 5. A electroporação para Agrobacterium tumefaciens células eletro-competentes <ol><li> Descongelar um frasco de Agrobacterium tumefaciens células eletricamente competentes no gelo. </li><li> Adicionar 1 ng de ADN do vector plasmídico binário de 20 ul de células competentes, em gelo, e misturar suavemente. </li><li> Refrigere a eletroporação tina 0,1 centímetros no gelo. </li><li> Transferir a mistura de célula / DNA competente às cuvetes de electroporação, e toque para recolher a mistura na parte inferior. Coloque a cuvete na máquina electroporador e pulso (condições de tensão e de tempo depende do tamanho de cuvete e o electroporador utilizado). </li><li> Adicionar 1 ml de meio SOC e as células de transferência para um tubo de 15 ml. </li><li> Incubar durante 1 hora a 28-30° C, agitação a 100 rpm. Placa 50 - 100 ul de células em agar LB + antibiótico selectivo apropriado (dependem do plasmídeo binário planta e a estirpe de Agrobacterium utilizada Neste protocolo de utilização de 50 ug / ml de canamicina e 100 ug / ml de estreptomicina.). </li><li> Incubar as placas até 48 horas a 28 - 30 ° C. </li><li> Repita o passo 2.5 para seleção colônia e purificação plasmídeo. </li><li> Repetir o passo 3 para analisar o plasmídeo e para verificar a integridade da inserção do T-DNA e antes utilizando a construção para floral-imersão. Repita o passo 3.2, utilizando vários iniciadores de PCR em toda a região de inserção inteiro e em todas as regiões de T-DNA e por seqüenciamento como no passo 3.3. NOTA: Neste protocolo de 4 diferentes iniciadores foram desenhados através do T-DNA e 10 iniciadores em todo o inserto. </li><li> Uma vez que a presença da planta plasmídeo binário na colônia Agrobacterium selecionado for confirmada, células lugar que eun 50% de glicerol e armazenar a -80 ° C. Loja restantes colónias na placa a 4 ° C, se eles são para ser usado dentro de uma semana 7. </li></ol> 6. Floral-dipping NOTA: 2 dias antes do floral-dipping: <ol><li> Cultivar células de Agrobacterium para a fase estacionária (OD 600 entre 0,5-1 é aceitável) em LB + antibióticos adequados no meio líquido. NOTA: Estes são os mesmos antibióticos como na etapa 5.6, com base no vector binário vegetal e o tipo de estirpe de Agrobacterium utilizada. </li><li> Iniciar a cultura com 1: 100 de um diluições saturado (5 ml) O / N e a cultura crescer durante 24-48 horas a 28-30 ° C, agitando a 150 rpm. A cultura deve ter alcançado a fase midlogarithmic e mais provável será que se aproxima ou na fase estacionária 1. OD de aproximadamente 0,8 (novamente OD entre 0,5 a 1 são aceitáveis) 8. Recolher as células por centrifugação a 5.000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em meio de infiltração (5,0% de sacarose + 0,05-0,003% de Silwet L-77). Para a primeira rodada do descenso, use 0,05% Silwet-77. Para a segunda e terceira rondas, para reduzir a concentração de 0,03% (em Discussão detalhada). </li><li> Prossiga com o passo floral-dip. Coloque a planta em seu lado e mergulhar apenas os botões visíveis no meio de infiltração para 1-2 min. Deixe a planta do seu lado e cubra-a com filme plástico para manter a umidade alta na cúpula (Figura 3). </li><li> No dia seguinte, colocar a planta em posição vertical e manter normalmente. </li><li> Quando o broto cresce maior (geralmente depois de cerca de 10-14 dias), repita os passos de 6,1-6,4. Reduzir o tempo de imersão de 30-60 seg e Silwet-77 concentração de 0,003%. </li><li> Manter as plantas normalmente até que suas sementes são maduros e prontos para serem recolhidos (Figura 4). </li></ol> 7. Seleção de Tra Positivensformants com PCR direto <ol><li> Semear as sementes T1 no solo como no passo 1.1. <ol><li> Como alternativa, fazer Murashige e Skoog sal basal (meio MS), adicionando 2,2 g de MS médio + 4 g de ágar-ágar em 500 ml de água. Autoclave e despeje em pequenos vasos de plantas. Mantenha a 4 ° C até ser utilizado. </li><li> Semear a semente, colocando-os no meio MS solidificado. Manter sob longo luz do dia (14 horas de luz e 10 horas de escuro). As sementes germinaram em cerca de 4-6 dias (Figura 5). </li><li> Use uma semente de cada flor como um ponto de partida. Se não transformante positivo é obtido, repita este passo, escolhendo outra semente da flor. Nota: Teste diferentes sementes das mesmas flores, porque em alguns casos nem todas as sementes de uma flor será transformado. A seleção de sementes adicionais de flores experimentais às vezes é necessário. </li></ol></li><li> Confira nas plântulas regularmente. Em cerca de 10 - 14 dias após a germinação, quando verdadeirodeixa desenvolver, testar as plantas com PCR direto. </li><li> Prepare o extrato de folha de DNA por corte 2-3 folhas (5-10 mg de peso) de cada muda e colocá-los em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 180 ul de NaOH 50 mM a cada tubo, e incubar durante 10 min a 95 ° C. </li><li> Neutraliza-se o extracto por adição de 20 ul de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0). </li><li> Use 1 ul do extracto na reacção directa de PCR, utilizando primers desenhados em todo o T-DNA ou a insero (Figura 7), para seleccionar transformantes positivos. <ol><li> Neste protocolo, utilizar PCR directo, com uma fixação inicial de 24 ° C, depois 2 minutos a 98 ° C, seguido de 40 ciclos de (98 ° C durante 10 segundos, o passo de recozimento durante 15 segundos, e um passo de extensão a 68 ° C). Execução de uma etapa de extensão final a 68 ° C durante 5 min, seguido por uma espera indefinida a 4 ° C. (Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre primers, temperaturas de recozimento e tempos de extensão para os ciclos). </li></ol></li><li> Identificar transformantes positivos e cultivá-las até o vencimento. Se as sementes foram germinadas em meio MS, transplante para o solo em um vaso maior (Figura 5). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Em algumas espécies de plantas, tais como fibras de linho (Linum usitatissimum), a transformação de plantas de sucesso tem sido limitado. Anteriormente, a transformação do linho requerida uma infecção por Agrobacterium e ferindo o co-cultivo, aplicando partículas biolística ou sonicação usando ultra-sons, seguido de regeneração; um processo que é tanto tempo e propenso a ser acompanhados por muitos eventos mutacionais. Além disso, o processo de selecção destas técnicas exige a utilização de marcadores seleccionáveis ​​de antibióticos tais como a canamicina. No entanto, constatou-se na literatura que este método de selecção produz muitos falsos positivos, como o linho tende a escapar altas concentrações de antibióticos 6,9,14. Outra desvantagem das técnicas anteriores na transformação de linho tem sido as baixas taxas de transformação 2,6. No protocolo descrito aqui, Agrobacterium transformação de plantas mediada por via floral-dipping foi mostradodar origem a uma elevada taxa de transformação para o linho (50 - 60%). Transformantes foram obtidos a partir de flores de cruzamento e recolhidos de ramos principais e secundários. Selecção dos transformantes positivos foi feita simplesmente por crescimento das plantas T1 no solo e as folhas de triagem logo após eles germinadas, não passa pelo uso de selecção antibiótico, um passo utilizado anteriormente como uma norma em floral por imersão para outras espécies de plantas. Através da realização de um ensaio directo de PCR de folhas, e utilizando os iniciadores de ADN-T adequadas, os transformantes positivos podem ser rapidamente seleccionados. Esta técnica é simples, barato e fácil de realizar, mas resulta numa taxa de transformação muito mais elevado que aqueles descritos anteriormente para Arabidopsis e de outras espécies de plantas utilizando este método 1,10,12. É também a maior taxa de transformação relatado para o linho. No entanto, há passos críticos nos procedimentos, incluindo a selecção da melhor fase flor e a melhor concentração de tensioactivo, a fim de queo Agrobacterium pode penetrar nas células da planta sem matar os órgãos florais. Se uma fase de botão início é usado (Figura 2A) com elevada concentração de Silwet-77 de mais do que 0,05%, a flor não desenvolveu nem formar sementes. Se o estágio final de enxertia é utilizado (Figura 2C), embora a transformação pode funcionar, ela irá ocorrer a uma taxa muito inferior. Resultados semelhantes foram obtidos com a transformação Arabidopsis dip floral 1,4. Para este protocolo, todos os estádios florais foram testados com diferentes concentrações de Silwet-77 e a melhor fase foi determinada como sendo a fase de botão do meio (Figura 2C) com Silwet-77 a 0,05% para a primeira imersão, seguido por uma segunda imersão em a fase final de bud (Figura 2C), com uma ligeira redução concentração Silwet-77 de 0,03%. A transformação também funcionou bem usando a fase de botão precoce (Figura 2A), com um baixo Silwet-77 concentração de 0,003%, seguido poruma segunda fase de botão de imersão com meio (Figura 2B), a maior concentração de 0,05% de Silwet-77. Neste protocolo, alguns outros parâmetros foram tentadas para otimizar a taxa de transformação, mas verificou-se que não há efeitos sobre o resultado final. Exemplos incluem o alargamento do tempo após o mergulho que as plantas estava do seu lado e coberto de plástico de um dia para dois dias; usando uma DO de mais do que 1 para a cultura de Agrobacterium, em vez de 0,5-1; aumentando o tempo de imersão para 5 - 15 min em vez de 1 - 2 minutos. Mais uma vez, não ter notado qualquer efeito sobre a taxa de transformação usando essas estratégias. Os fatores mais eficazes, no entanto, foram encontrados para ser o uso de plantas saudáveis ​​nas fases de flores corretas, e usando a melhor concentração Silwet-77. Percebemos que dois intervalos de imersão, de alguma forma funciona melhor do que uma vez, mesmo que um mergulho tempo também funciona. Modificação para este protocolo pode ser alcançado por reducing a concentração de Silwet-77 para tão pouco quanto 0,003% na segunda ou terceira imersão. Uma vez que o Silwet-77 é tóxico, uma concentração demasiadamente elevada resultados nas flores em desenvolvimento mal, resultando na ausência de produção de sementes. A frequência de imersão pode ser reduzido a um, com o segundo ou terceiro eventos eliminados se as plantas não estão com aspecto saudável e os botões não estão se desenvolvendo bem. Uma grande limitação desta técnica é o baixo número de flores produzidas por o linho, o número limitado de sementes obtidas a partir de cada flor, e o ciclo de vida longo de linho. Leva 6 - 8 semanas depois da sementeira de sementes para que as gemas primárias imediata para a primeira imersão e um adicional 8 - 10 semanas após a imersão para chegar à geração T1. No total, uma gama de 5 - 6 meses, é necessário para obter a geração T1. Ao contrário de outras espécies de plantas, que florescem em qualquer altura do ano, alguma flor variedades de linho melhor em momentos específicos do ano. Planejamento tão bem planejadas para esta técnica é importante. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Em resumo, os resultados de nossas dip floral com duas variedades de linho diferentes: o linho têxtil, Stormont Cirrus (plástico sensível e), eo linho óleo, Bethune (estável e não-responsivos), mostram que Agrobacterium - a transformação de plantas mediada através floral por imersão é um método aplicável e eficiente para a transformação de linho e pode ser usado para substituir as técnicas utilizadas anteriormente para a transformação de linho. As modificações do método floral-dip neste protocolo será aplicável para uso com quaisquer outras espécies de plantas e não se limitando a linho.

Linho (Linum usitatissimum) é uma importante cultura amplamente cultivada para suas fibras e óleos. Transformação do genoma de linho é possível com as técnicas tais como o ferimento, infecção por Agrobacterium, e a co-cultura em cultura de tecidos, a aplicação de partículas biolística de ultra-som ou sonicação seguido por regeneração. No entanto, estas técnicas têm muitas desvantagens, incluindo a tendência para muitos eventos mutacionais e um tempo prolongado para obter as linhas transgénicas. Alguns destes métodos também podem ser caros e requerem manipulação hábil e eficiente dos instrumentos, o que resulta em baixos mudas de recuperação. Mais importante ainda, estes técnica muitas vezes resultam em baixas taxas de transformação 2,6. Agrobacterium mediada transformação de plantas via floral-dip é uma abordagem simples e eficiente para gerar plantas transgênicas. Tem sido rotineiramente utilizada com sucesso para muitas espécies de plantas, tais como Arabidopsis Thalianum grupo 1,4, Medicago truncatula 11, 12, tomate, trigo e milho 13 10. No entanto, não tem sido pensado como uma técnica viável para a transformação de linho, devido a vários factores, tais como o baixo número de flores produzidas por linho, número limitado de sementes obtidas a partir de cada flor, o grande tamanho da semente, e o revestimento de espessura, que também poderia ser problemático para tal processo de transformação genética. Além disso, o segmento de seleção da técnica floral-dip requer germinação de sementes transformadas em uma mídia de plantas contendo um antibiótico, com progênies transformadas distinguidos com base em sua capacidade de germinação e ficar verde, enquanto progênies não transformada ou não germinam ou germinar mas lixívia rapidamente e morrer. Na literatura corrente, constatou-se que o tipo selvagem linho tende a escapar alta concentração de selecções antibióticos, produzindo resultados falsos positivos, e fazendo a selecção de progênies T1 baseadosobre a resistência aos antibióticos mais difícil 6,14. Além disso, quando uma alta concentração do antibiótico foi adicionado ao meio de selecção, a taxa de transformação observada caiu dramaticamente 9. Neste protocolo, foi utilizado Agrobacterium e o método floral por imersão para transformar uma linha de fibra de linho, Stormont cirro (responsivo e plástico), que tem sido mostrado para responder a pressões do meio ambiente por alterar o seu genoma 3,5. Para superar o problema de fuga antibiótico, optamos por fazer o teste direto PCR de DNA a partir de folhas T1, em vez de selecção através da adição do antibiótico para a mídia planta. Nós aproveitou a simples anatomia de linho para acompanhar flores específicas no momento do tratamento. Este sistema de rastreio permitiu a seleção de sementes a partir de flores e específicos de germinação no solo, sem a adição de antibióticos. Transformantes positivos foram simplesmente identificados por testes de DNA obtido a partir de folhas, utilizando o método rápido e eficiente of PCR direto. Os nossos resultados demonstram que o método de mergulho floral-funcionou muito bem nesta linha de linho e surpreendentemente resultou em uma taxa muito elevada de transformação (50 - 60%), mais elevada do que a observada anteriormente para Arabidopsis thaliana, que foi relatada como sendo 0,1-1 1%, e também mais elevada do que outras espécies de plantas 10,12. Testamos também uma outra variedade de sementes de linho (linhaça óleo), Bethune (estável e não-responsivos), e os nossos dados preliminares indicam que floral-dip também funciona para essa variedade de linho. O objetivo deste protocolo é para mostrar que Agrobacterium e floral-dip pode ser usado para gerar linho transgênico. Mostra-se que esta técnica é simples, barato e rápido do que outros métodos de transformação de linho. Mais importante ainda, resulta em uma taxa de transformação muito maior do que os outros métodos de transformação de linho 2,6. A anatomia da Arabidopsis thaliana, que tem muitos ramos e flores, makes difícil distinguir cruzamento e flores não mergulhou na mesma planta. Por isso, um grande número de sementes, cerca de 20.000 sementes por planta, têm de ser pesquisados ​​para identificar os transformantes positivos 8. Linho, por outro lado, tem menos ramos (um ramo principal e alguns ramos laterais) e menos flores, produzindo cerca de 100 sementes por planta, o que torna possível rastrear flores individuais e selecionar sementes específicas durante o processo de triagem. Propomos que floral-dip é um método aplicável para transformar qualquer espécie relacionados de linho, um gênero de cerca de 200 espécies. Este método dá a taxa de transformação muito mais elevada do que outros métodos de transformação de linho. Também estamos propondo que o rastreio direto PCR de T1 folha DNA é uma maneira eficiente de superar o problema da fuga de resistência a antibióticos, que muitas vezes produz muitos falsos positivos. Rastreio directo de PCR pode ser aplicada a quaisquer outras espécies de plantas, e não está limitado to linho. A técnica de seguimento de sementes simples empregue neste protocolo pode ser aplicado a quaisquer outras espécies de plantas com ramificação semelhante à anatomia linho.

<table><tbody><tr><td>Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&quot; pots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potting soil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greenhouse with appropriate light setting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electropheresis equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital imaging setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>LEHLE SEEDS</td><td>VIS-01</td><td>Toxic, wear gloves</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>Part# 9PIM712</td><td></td></tr><tr><td>Terra PCR Direct Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639270</td><td></td></tr><tr><td>Binary vector PRI 909</td><td>Takara</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td><td>Takara</td><td>9115</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA cloning kit</td><td>Invitrogen</td><td>K4595-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator and cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2092</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic wrap and aluminum foil wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>speedSTAR DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>RR070A/B</td><td></td></tr><tr><td>QlAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN plasmid mini kit</td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligation kit</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr></tbody></table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

Agrobacterium para transformação de plantas mediada por via floral por imersão é uma técnica largamente utilizada no domínio da transformação de plantas e tem sido relatada como sendo bem sucedida para muitas espécies de plantas. No entanto, não foi reportado linho (Linum usitatissimum) transformação por floral por imersão. O objectivo do presente protocolo é estabelecer que Agrobacterium e o método floral por imersão podem ser utilizados para gerar linho transgénico. Mostra-se que esta técnica é simples, de baixo custo, eficiente, e, mais importante, dá uma taxa de transformação maior do que os actuais métodos de transformação disponíveis linho. Em resumo, inflorescências de linho foram mergulhadas em uma solução de Agrobacterium transportando um plasmídeo vector binário (fragmento de T-DNA além do Inserção Sequência Linum, LIS-1) para 1 - 2 min. As plantas foram deitadas ao seu lado durante 24 horas. Em seguida, as plantas foram mantidas em condições normais de crescimento até o próximo tratamento. Os process do descenso foi repetido 2-3 vezes, com cerca de 10-14 dias de intervalo entre imersão. As sementes T1 foram colhidas e germinadas em solo. Após aproximadamente duas semanas, progênies tratadas foram testadas por PCR directa; 2 - 3 foram usadas folhas por planta, mais os iniciadores de ADN-T adequadas. Os transformantes positivos foram seleccionados e cultivadas até à maturidade. A taxa de transformação foi inesperadamente alta, com 50 - 60% das sementes de plantas tratadas serem transformantes positivos. Esta é uma taxa de transformação superiores aos relatados para Arabidopsis thaliana e outras espécies de plantas, usando transformação floral-dip. É também o mais elevado, o que tem sido relatada até agora, para a transformação do linho utilizando outros métodos de transformação.

Figura 1 - 4 ilustram alguns dos passos dentro do protocolo. Nas Figuras 1 e 2, as folhas em torno dos gomos inflorescência são cortados para expor-los para as células de Agrobacterium e as diferentes fases do botão que foram usados ​​para desenvolver o protocolo. A Figura 3 mostra o processo de linho floral por imersão. Figura 4, mostra um exemplo de como os principais ramos laterais e pode ser marcado e como flores indivíduo pode ser rastreados e identificados. A Figura 5 mostra como as progênies T1 pode ser germinadas em meio MS das plantas e, em seguida transplantadas para o solo para a maturidade. A Figura 6 ilustra como wild- Tipo de linho pode escapar altas concentrações de canamicina, confirmando resultados anteriores na literatura 6,9,14. A Figura 7 mostra um exemplo de amplificação directa por PCR a partir de transformantes positivos T1. As flores T1 foram coletadas a partir do main e laterais brotos de uma única planta T0. Como pode ser visto a partir da PCR directo, 8/12 plantas T1 testaram positivo por PCR e ampliaram as diferentes regiões de todo o T-DNA. Nossos primers também foram projetadas entre os LIS-1 de inserção e os múltiplos locais de clonagem (Figura 7b e C). Foram utilizados iniciadores adicionais a partir do vector binário vegetal para amplificar diferentes segmentos de T-DNA, tais como a fronteira esquerda e o terminador NOS (dados não mostrados) ou o bordo direito e o local de clonagem múltipla (Figura 7D). Os iniciadores específicos para o LIS-1 inserto também foram utilizados neste protocolo (dados não mostrados). Uma lista de iniciadores é fornecida na Tabela 1. No entanto, as sequências destes iniciadores depende da sequência do vector binário vegetal T-DNA e o inserto utilizado para o floral-mergulho. Observamos, também, que não houve diferença significativa na taxa de transformação entre flores recolhidas a partir dos principais e secundários ramos. Figura 1. Corte as folhas em volta dos botões inflorescência primárias para expô-los às células Agrobacterim. (A) Os botões são cobertos por folhas. (B) folhas foram cortadas em torno dos botões para expô-los. (C) imagem ampliada a partir de planta em (A) após o corte para expor gemas. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> Figura 2. As diferentes fases bud que foram utilizados neste protocolo para determinar o melhor palco para usar para o mergulho floral. (A) A fase de botão precoce é approxima<html> tely 2 mm. (B) O broto estágio médio é de aproximadamente 5 mm. (C) O broto fase tardia é de cerca de cerca de 1 cm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> Figura 3. O processo de linho floral-imersão. (A) As inflorescências primárias são mergulhados na mídia de infiltração contendo as células de Agrobacterium. (B) ampliada a partir de (A). (C) As plantas são mergulhados na horizontal até o dia seguinte, e os ramos de cruzamento são cobertos com plástico para manter alta umidade. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> jove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . Figura 4. O processo de coletas de rastreamento de flores e sementes, a partir das plantas T0 tratado (A) Um exemplo de toda a planta com o ramo principal (o ramo mais alto do centro) eo lado ramos (B - D). Um . exemplo das flores de diferentes ramos (E) Um exemplo das sementes coletadas a partir de flores individuais (rotulado a - k). do ramo principal <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> Figura 5. As plântulas T1 são crescidas sem selecção de antibiótico. (A) sementes são T1germinadas na mídia de MS da planta. (B) transformantes positivos, conforme determinado pela PCR direta, são transplantadas para o solo e cresceu para a maturidade. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> Figura 6. fuga Antibiótico, um problema para a seleção T1, é superada pela triagem PCR direto. (A) do tipo selvagem de linho sementes germinadas em meios MS planta sem antibiótico. (B) do tipo selvagem sementes de linho germinadas em MS media de plantas + concentrações crescentes de canamicina (200 ng / ml, 600 ug / ml, 1 mg / mL). (C) do tipo selvagem de linho sementes germinadas em meios MS planta com 2 mg / ml de canamicina. (D) por PCR a partir do tipo selvagem de linho e T1 mudas, utilizando iniciadores de canamicina, todos amplified os genes canamicina (lendas: EZ1: marcadores de DNA, FlaxS, do tipo selvagem flaxS, C: controlar ramo não-mergulhado, Ma: T1 progênie de flor &quot;a&quot; recolhidos a partir do ramo principal, Sc, Sd, Se, Sf: progênies T1 de diferentes flores &quot;c, d, e, f&quot; coletados a partir do ramo lateral, W:. no-DNA) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> Figura 7. Um exemplo de amplificações de PCR bem sucedidos de progênies T1, utilizando o método PCR direto. (A) Diagrama do vetor binário Planta + clonado LIS-1 insert. As setas azuis indicam a posição dos iniciadores de PCR utilizados no rastreio de PCR directo (modificado a partir de Takara). (B) por PCR com os iniciadores M13F + 3 &#39;(C) por PCR com os iniciadores M13R + 18a <strong&gt; (D) PCR com primers borda direita (RB) e local de clonagem múltipla (MCS) ** Cada faixa representa T1 de flores individuais coletados a partir de C: ramo controle (não-mergulhado), M: main flor ramo ag, S: lado filial flor bc &#39;. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fonte sequência de iniciador de sentido directo </td><td> sequência 5&#39;-3 &#39; </td><td> Fonte sequência iniciadora reversa </td><td> Sequência 5&#39;-3 &#39; </td><td> O recozimento Temprature (° C) </td><td> Extensão Time (Sec) </td><td> O tamanho esperado (pb) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 insert) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18-A (LIS-1 insert) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Alguns dos iniciadores utilizados para o teste de PCR directo.

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Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Aqui, apresentamos um protocolo de transformar o linho usando Agrobacterium transformação de plantas mediada por via floral-dip. Este protocolo é simples de executar e barato, ainda produz uma taxa de transformação maior do que os actuais métodos disponíveis para transformação de linho.

Floral-Dip Transformação de linho (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Para gerar Transgênicos Progênies com uma alta taxa de Transformação

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.2K visualizações.  Case Western Reserve University.  Aqui, apresentamos um protocolo de transformar o linho usando Agrobacterium transformação de plantas mediada por via floral-dip. Este protocolo é simples de executar e barato, ainda produz uma taxa de transformação maior do que os actuais métodos disponíveis para transformação de linho. 

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Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Genética

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic resources available to study how plants adapt to environmental stresses, its value as a functional genomics model and tool has been limited by the lack of a feasible transformation system. In this protocol, we report how to generate stable transgenic S. parvula lines using an Agrobacterium-mediated floral-dip method. We modified the transformation protocol used for A. thaliana to account for unique traits of S. parvula, such as an indeterminate flowering habit and a high epicuticular wax content on leaves. Briefly, S. parvula seeds were stratified at 4 &#176;C for five days before planting. Plants were grown at a photoperiod of a 14 h light and 10 h dark and a 130 &#181;mol m-2s-1 light intensity, at 22 &#176;C to 24 &#176;C. Eight to nine week-old plants with multiple inflorescences were selected for transformation. These inflorescences were dipped in an infiltration solution of Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying the pMP90RK plasmid. We performed two rounds of flower dipping with an interval of three to four weeks to increase the transformation efficiency. The T1 seeds were collected and dried for four weeks in a container with desiccants before germination to screen for candidate transformed lines. Resistance to BASTA was used to screen T1 plants. We sprayed the BASTA solution three times with an interval of three days starting at two week-old plants to reduce false positives. A BASTA drop test was performed on surviving individual plants to identify true positive transformants. The transformation efficiency was 0.033%, yielding 3&#8211;4 transgenic plants per 10,000 T1 seeds propagated.

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-mediated transformation using a floral-dip method can be successfully employed to create stable transgenic lines of the extremophyte model Schrenkiella parvula. We present a protocol modified from that for Arabidopsis thaliana, considering different growth habits and physiological characteristics of the extremophyte.

Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - um método para modificar geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Imunologia e Infecção

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Química

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an Agrobacterium rhizogenes mediated transformation system on pigeon pea. The stem is infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced callus after 7 days and adventitious roots 14 days later. The generated transgenic hairy root was identified by morphological analysis and a GFP reporter gene.To further illustrate the application range of this system, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) was transformed into pigeon pea using this transformation method. The transgenic plants were treated with jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA), respectively, for the purpose of testing whether CcCIPK14 responds to those hormones. The results demonstrated that (1) exogenous hormones could significantly upregulate the expression levelof CcCIPK14, especially in CcCIPK14 over-expression (OE) plants; (2) the content of Genistein in CcCIPK14-OE lines was significantly higher than the control; (3) the expression level of two downstream key flavonoid synthase genes, CcHIDH1 and CcHIDH2, were up-regulated in the CcCIPK14-OE lines; and (4) the hairy root transgenic system can be used to study metabolically functional genes in non-model plants.

<meta charset="utf8"></head><body>Análise da função do gene CcCIPK14 para iluminar o sistema transgênico radicular eficiente

Here we present an efficient and stable transformation system for the functional analysis of the CcCIPK14 gene as an example, providing a technical basis for studying the metabolism of non-model plants.

CcCIPK14 Análise da função gênica para iluminar o sistema transgênico radicular eficiente

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-dip Transformação de Arabidopsis thaliana Examine a PTSO2:: β-glucuronidase Expressão Gênica Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Biologia

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Ambientalmente induzido mudanças hereditárias em Linho

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Floral-Dip Transformação de linho (

Resumo

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Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula

TransFLP - um método para modificar geneticamente

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

CcCIPK14 Análise da função gênica para iluminar o sistema transgênico radicular eficiente

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