Name: floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

This work was supported by the Ogelbay fund.

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في بعض الأنواع النباتية، مثل الكتان (LINUM usitatissimum)، كان ناجحا تحول النبات محدود. سابقا، والتحول في الكتان ويتطلب وجود عدوى الأجرعية التي كتبها جرح وزراعة المشترك، تطبيق الجسيمات biolistic أو باستخدام الموجات فوق الصوتية صوتنة، تليها تجديد. عملية في آن معا منذ فترة طويلة وعرضة للأن يرافقه العديد من الأحداث طفرية. وعلاوة على ذلك، فإن عملية اختيار هذه التقنيات تتطلب استخدام علامات اختيار المضادات الحيوية مثل الكانامايسين. ومع ذلك، فقد لوحظ في الأدب أن هذا الأسلوب في اختيار تنتج العديد من ايجابيات كاذبة، كما يميل الكتان للهروب تركيزات عالية من المضادات الحيوية 6،9،14. وكان ثمة عيب آخر من التقنيات السابقة في التحول الكتان انخفاض معدلات التحول 2،6. في بروتوكول الموصوفة هنا، وقد تبين الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار غمسأن يؤدي إلى معدل التحول عالية لالكتان (50 - 60٪). وقد تم الحصول على Transformants من الزهور انخفض والتي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. وقد تم اختيار transformants إيجابية ببساطة عن طريق زراعة النباتات T1 على التربة وفحص أوراقها قريبا بعد أن نبتت، واستخدام المضادات الحيوية-اختيار المارة، وهي خطوة المستخدمة سابقا كقاعدة في الأزهار وتراجع للأنواع النباتية الأخرى. عن طريق إجراء اختبار PCR المباشر من الأوراق، وباستخدام بادئات T-DNA المناسبة، transformants إيجابية يمكن اختيار بسرعة. هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وسهلة لأداء، ولكن النتائج في معدل التحول أعلى بكثير من تلك التي ذكرت سابقا لنبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى باستخدام هذه الطريقة 1،10،12. بل هو أيضا أعلى معدل التحول الإبلاغ عنها من الكتان. ومع ذلك، هناك خطوات حاسمة في الإجراءات بما في ذلك اختيار أفضل مرحلة زهرة وأفضل تركيز بالسطح، بحيثوالأجرعية يمكن أن تخترق الخلايا النباتية دون قتل أجهزة زهرة. إذا تم استخدام مرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع ارتفاع تركيز Silwet-77 أكثر من 0.05٪، وزهرة لم تتطور ولا تعيين البذور. إذا تم استخدام مرحلة أواخر برعم (الشكل 2C)، على الرغم من أن التحول قد عمل، وسوف تحدث بمعدل أقل من ذلك بكثير. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع نبات الأرابيدوبسيس تراجع الأزهار التحول 1،4. لهذا البروتوكول، تم اختبار جميع المراحل الأزهار مع مختلف Silwet-77 تركيزات وتم تحديد أفضل مرحلة لتكون المرحلة برعم المتوسط ​​(الشكل 2C) مع Silwet-77 في 0.05٪ لغمس الأول، تليها غمس الثاني في المرحلة الراحل برعم (الشكل 2C) مع انخفاض طفيف تركيز Silwet-77 من 0.03٪. كما عملت التحول جيدا باستخدام المرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع تركيز منخفض silwet-77 من 0.003٪ تلاهغمس الثاني مع مرحلة برعم المتوسط ​​(الشكل 2B) في أعلى Silwet-77 تركيز 0.05٪. في هذا البروتوكول، وقد حاول بعض المعالم الأخرى لتحسين معدل التحول، ولكن وجد أن له أي آثار على النتيجة النهائية. وتشمل الأمثلة يمتد الوقت بعد غمس أن النباتات تكمن في جانبهم وغطت في البلاستيك من يوم واحد إلى يومين. باستخدام OD أكثر من 1 للثقافة الأجرعية، بدلا من 0،5-1. زيادة الوقت غمس 5 - 15 دقيقة بدلا من 1 - 2 دقيقة. مرة أخرى نحن لم نلحظ أي تأثير على معدل التحول باستخدام هذه الاستراتيجيات. العوامل الأكثر فعالية، ومع ذلك، وجدت أن استخدام النباتات الصحية في المراحل زهرة الصحيحة، واستخدام أفضل تركيز Silwet-77. لاحظنا أن اثنين من فترات غمس، ويعمل بطريقة أو بأخرى الوقت أفضل من واحد، على الرغم من واحد غمس الوقت يعمل أيضا. لا يمكن أن يتحقق تعديل على هذا البروتوكول من قبل reducin<html> ز تركيز Silwet-77 إلى أقل من 0.003٪ في غمس الثاني أو الثالث. منذ Silwet-77 غير سامة، وارتفاع جدا نتائج تركيز في الزهور النامية على نحو رديء، مما يؤدي إلى أي محصول البذور. يمكن الحد من وتيرة غمس إلى واحد، مع الأحداث الثانية أو الثالثة القضاء إذا النباتات لا يبحثون صحي والبراعم لا تتطور بصورة جيدة. وهناك أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية هو انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، وعدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، ودورة حياة طويلة من الكتان. يستغرق 6-8 أسابيع من بذر البذور لديها براعم الأولية جاهزة لغمس أول وإضافية 8-10 أسابيع بعد غمس-للوصول الى جيل T1. في المجموع، ومجموعة من 5 - هناك حاجة إلى 6 أشهر للحصول على الجيل T1. على عكس الأنواع النباتية الأخرى، والتي زهرة في أي وقت من السنة، وبعض أصناف الكتان زهرة أفضل في أوقات محددة من السنة. تخطيط مدروس جدا لهذا الأسلوب هو المهم. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; وباختصار، نتائجنا من تراجع الأزهار مع اثنين من أصناف الكتان مختلفة: الكتان من الألياف، ستورمونت سيروس (البلاستيك استجابة و)، وزيت الكتان، بيتون (مستقر وغير المراعية)، تبين أن الأجرعية - بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق وفعالة للتحول الكتان، ويمكن استخدامها لتحل محل التقنيات المستخدمة سابقا للتحول الكتان. فإن إدخال تعديلات على طريقة الأزهار وتراجع في هذا البروتوكول تكون قابلة للتطبيق للاستخدام مع أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس على سبيل الحصر الكتان.

الكتان (LINUM usitatissimum) هو المحصول المهم نمت على نطاق واسع للألياف والزيوت. التحول من الجينوم الكتان هو ممكن مع تقنيات مثل إصابة أو عدوى الأجرعية، وشارك في زراعة في زراعة الأنسجة، وتطبيق الجسيمات biolistic أو صوتنة الموجات فوق الصوتية تليها التجدد. ومع ذلك، هذه التقنيات لها عيوب كثيرة، بما في ذلك الميل إلى العديد من الأحداث طفرية وتمديد الوقت للحصول على خطوط المعدلة وراثيا. يمكن أيضا أن تكون بعض من هذه الطرق مكلفة وتتطلب معالجة المهرة وكفاءة الصكوك، مما أدى إلى انتعاش الشتلات منخفضة. الأهم من ذلك، هذه التقنية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدلات التحول 2،6. الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو نهج بسيطة وفعالة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا. تم بشكل روتيني وبنجاح استخدامه للعديد من الأنواع النباتية مثل نبات الأرابيدوبسيس thalianعلى 1،4، فصة برميلية 11، الطماطم 12، 13 القمح والذرة 10. ومع ذلك، لم يعتقد أنه من كتقنية قابلة للتحول الكتان بسبب عدة عوامل، مثل انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، عدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، وحجم البذور واسع، ومعطف سميك، والتي يمكن أيضا أن يكون مشكلة لمثل هذه عملية التحول الوراثية. بالإضافة إلى ذلك، والجزء اختيار تقنية الأزهار وتراجع يتطلب الإنبات بذور حولت على وسائل الاعلام النباتات التي تحتوي على مضاد حيوي، مع السلالات تحولت حاليا على أساس قدرتها على الإنبات والبقاء الأخضر، في حين أن السلالات غير حولت إما لا تنبت أو تنبت ولكن التبييض بسرعة ويموت. في الأدب الحالي، وقد لوحظ أن من النوع البري الكتان يميل إلى الهروب تركيز عال من الاختيارات للمضادات الحيوية، وإنتاج نتائج إيجابية كاذبة، وجعل اختيار السلالات T1 مقرهاعلى مقاومة المضادات الحيوية أكثر صعوبة 6،14. أيضا، عندما أضيف على نسبة عالية من المضادات الحيوية إلى وسيلة الاختيار، ومعدل التحول الملحوظ انخفض بشكل كبير 9. في هذا البروتوكول، استخدمنا الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع لتحويل خط من ألياف الكتان، ستورمونت المعلاق (استجابة والبلاستيك)، وهو ما ثبت للرد على الضغوط في البيئة عن طريق تغيير الجينوم 3،5. للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية، اخترنا أن تفعل اختبار PCR المباشر من الحمض النووي من أوراق T1، بدلا من اختيار طريق إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام النبات. ونحن قد استفادت من تشريح بسيط من الكتان لتتبع الزهور محددة في وقت العلاج. يسمح هذا النظام تتبع اختيار البذور من الزهور محددة والإنبات في التربة دون إضافة المضادات الحيوية. وقد تم تحديد transformants إيجابية ببساطة عن طريق اختبار DNA الحصول عليها من الأوراق باستخدام طريقة سريعة وفعالة سو PCR المباشر. وتظهر نتائجنا أن طريقة الأزهار وتراجع عملت بشكل جيد جدا في هذا الخط من الكتان ونتج من المستغرب في معدل التحول عالية جدا (50 - 60٪)، وهي نسبة أعلى من تلك التي لوحظت من قبل لthaliana نبات الأرابيدوبسيس، الذي تشير التقارير إلى أن 0،1-1 ٪ 1، وأعلى أيضا من الأنواع النباتية الأخرى 10،12. نحن أيضا اختبار صنف آخر من بذر الكتان (الكتان النفط)، بيتون (مستقر وغير مستجيبة)، وتشير البيانات الأولية لدينا أن الأزهار وتراجع يعمل أيضا لهذا التنوع من الكتان. والهدف من هذا البروتوكول هو إظهار أن الأجرعية والأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة، وأسرع من غيرها من أساليب التحول الكتان. والأهم من ذلك أنه يؤدي إلى معدل التحول أعلى بكثير من غيرها من أساليب التحول الكتان 2،6. تشريح نبات الأرابيدوبسيس thaliana، التي لديها العديد من الفروع والزهور، يا أماهKES من الصعب التمييز تراجع والزهور غير مغموسة على نفس النبات. لذلك، فإن أعدادا كبيرة من البذور، وحوالي 20،000 البذور للنبات، تحتاج إلى فحص لتحديد transformants إيجابية 8. الكتان، من ناحية أخرى، لديها عدد أقل من الفروع (فرع رئيسي واحد وعدد قليل من فروع جانبية) وعدد أقل من الزهور، وتنتج ما يقرب من 100 البذور في النباتات، مما يجعل من الممكن لتتبع الزهور الفردية واختيار البذور محددة خلال عملية الفرز. ونقترح أن الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق لتحويل أي نوع من الأنواع ذات الصلة من الكتان، وهو جنس من حوالي 200 نوع. هذه الطريقة يعطي أعلى بكثير معدل التحول من الأساليب الأخرى للتحول الكتان. نحن نقترح أيضا أن فحص PCR المباشر من T1 ورقة DNA هو وسيلة فعالة للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية المقاومة التي غالبا ما تنتج العديد من ايجابيات كاذبة. فحص PCR المباشر يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس ر يقتصرس الكتان. تقنية تتبع البذور بسيطة العاملين في هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى مع المتفرعة التشريح مماثلة لالكتان.

<table><tbody><tr><td>Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&quot; pots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potting soil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greenhouse with appropriate light setting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electropheresis equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital imaging setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>LEHLE SEEDS</td><td>VIS-01</td><td>Toxic, wear gloves</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>Part# 9PIM712</td><td></td></tr><tr><td>Terra PCR Direct Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639270</td><td></td></tr><tr><td>Binary vector PRI 909</td><td>Takara</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td><td>Takara</td><td>9115</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA cloning kit</td><td>Invitrogen</td><td>K4595-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator and cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2092</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic wrap and aluminum foil wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>speedSTAR DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>RR070A/B</td><td></td></tr><tr><td>QlAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN plasmid mini kit</td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligation kit</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr></tbody></table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع في مجال تحول النبات وتم الإبلاغ عن أن تكون ناجحة للعديد من الأنواع النباتية. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ الكتان (LINUM usitatissimum) التحول من الأزهار وتراجع. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات أن الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وفعالة، والأهم من ذلك، يعطي معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان. وباختصار، فقد انخفض النورات من الكتان في حل من الأجرعية تحمل البلازميد ثنائي الموجه (جزء T-DNA بالإضافة إلى إدراج تسلسل LINUM، LIS-1) ل1 - 2 دقيقة. كانت قد وضعت النباتات شقة على جانبهم لمدة 24 ساعة. ثم، تم الحفاظ على النباتات في ظل ظروف النمو الطبيعي حتى علاج المقبلة. بروسسوتكررت الصورة من غمس 2-3 مرات، مع ما يقرب من 10-14 فترات اليوم بين غمس. تم جمع بذور T1 ونبتت على تربة. بعد ما يقرب من أسبوعين، تم اختبار السلالات تعامل من قبل PCR المباشر؛ واستخدمت 3 الأوراق للنبات بالإضافة إلى الاشعال T-DNA المناسبة - 2. تم اختيار transformants إيجابية ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. وكان معدل التحول عالية بشكل غير متوقع، مع 50 - 60٪ من البذور من النباتات المعاملة يجري transformants إيجابية. هذا هو معدل التحول أعلى من تلك التي ذكرت لthaliana نبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى، وذلك باستخدام التحول الأزهار وتراجع. بل هو أيضا أعلى، والتي تم الإبلاغ حتى الآن، للتحول الكتان باستخدام طرق أخرى للتحول.

الشكل 1-4 توضيح بعض الخطوات ضمن البروتوكول. في أرقام 1 و 2، ويترك في جميع أنحاء براعم الإزهار يتم قطع لفضح لهم الخلايا الأجرعية والمراحل برعم المختلفة التي استخدمت لتطوير بروتوكول الشكل يظهر 3 عملية الكتان الأزهار وتراجع الشكل 4، يظهر مثال عن كيفية الفروع الرئيسية والجانبية يمكن أن يكون المسمى وكيف الزهور فرد يمكن تتبع وتحديد الشكل 5 يبين كيف يمكن نبتت على السلالات T1 على وسائل الإعلام مصنع MS ومن ثم زرعها في التربة لنضج الشكل يوضح كيف 6 wild- نوع الكتان يمكن الهروب تركيزات عالية من الكانامايسين، مؤكدا النتائج السابقة في الأدب 6،9،14. ويبين الشكل 7 مثال PCR التضخيم مباشرة من transformants T1 إيجابية. تم جمع الزهور T1 من م<html> عين والجانب يطلق النار على محطة T0 واحد. كما يمكن أن يرى من PCR المباشر، واختبارها 8/12 النباتات T1 الإيجابية التي PCR ولقد ضخمت في مناطق مختلفة في جميع أنحاء T-DNA. تم تصميم الاشعال لدينا أيضا بين LIS-1 إدراج والمواقع استنساخ متعددة (الشكل 7B وC). كنا الاشعال إضافية من متجه ثنائي مصنع لتضخيم شرائح مختلفة من الحمض النووي T، مثل الحدود الأيسر وفاصل NOS (لا تظهر البيانات) أو الحد الأيمن وموقع استنساخ متعددة (الشكل 7D). واستخدمت بادئات محددة لإدراج LIS-1 أيضا في هذا البروتوكول (لا تظهر البيانات). وهناك قائمة من الاشعال في الجدول 1. ومع ذلك، فإن تسلسل هذه الاشعال تعتمد على سلسلة من متجه ثنائي محطة T-DNA وإدراج المستخدمة لوتراجع الأزهار. لاحظنا أيضا أنه لم يكن هناك اختلاف كبير في معدل التحول بين الزهور التي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. ف together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" /> الشكل 1. قص الأوراق حول براعم الإزهار الأولية ليعرضهم للخلايا Agrobacterim. (A) وتغطي براعم بواسطة إجازات. وقطعت (B) أوراق حول البراعم لفضح لهم. (C) تضخيم صورة من المصنع في (A) بعد قطع لفضح البراعم. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> الشكل 2. مراحل برعم المختلفة التي استخدمت في هذا البروتوكول لتحديد أفضل مرحلة لاستخدامه في تراجع الأزهار. (A) المرحلة برعم المبكر هو approxima<html> tely 2 مم. (B) المرحلة برعم المتوسط ​​حوالي 5 ملم. (C) المرحلة برعم المتأخر هو ما يقرب من حوالي 1 سم. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> الشكل 3. عملية الكتان الأزهار غمس. وانخفض (A) والنورات الأولية في وسائل الإعلام تسلل تحتوي على خلايا الأجرعية. (B) مكبر من (A). (C) وضعت النباتات انخفض شقة حتى اليوم التالي، ويتم تغطية فروع انخفض مع البلاستيك للحفاظ على الرطوبة العالية. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> jove_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . الشكل 4. إن عملية تتبع الزهور والبذور مجموعات من النباتات T0 تعامل (A) مثال على مصنع كامل مع الفرع الرئيسي (أطول فرع في الوسط) والجانب فروع (B - D). إن . مثال الزهور من مختلف فروع (E) مثال من البذور التي تم جمعها من الزهور الفردية (المسمى ل- ك). من الفرع الرئيسي <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> تزرع الشتلات الشكل 5. T1 دون اختيار المضادات الحيوية. (A) البذور T1 هينبتت على وسائل الإعلام مصنع MS. (B) transformants إيجابية، على النحو الذي يحدده PCR المباشر، يتم زرعها في التربة ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> والتغلب على الشكل 6. الهروب المضادات الحيوية، وهي مشكلة لT1 اختيار، من خلال فحص PCR المباشر. (A) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS دون المضادات الحيوية. (B) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS + زيادة تركيزات من الكانامايسين (200 ميكروغرام / مل، 600 ميكروغرام / مل، 1 ملغ / مل). (C) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على MS سائل الإعلام المصنع مع 2 ملغ / مل الكانامايسين. (D) PCR من النوع البري الكتان وT1 الشتلات باستخدام بادئات كانامايسين، كل AMPLified والكانامايسين الجين (الأساطير: EZ1: علامة DNA، FlaxS، من النوع البري flaxS، C: السيطرة غير مغموسة فرع، ما: T1 ذرية من زهرة &quot;أ&quot; التي تم جمعها من الفرع الرئيسي، SC، SD، سي، SF: السلالات T1 من الزهور المختلفة &quot;ج، د، ه، و&quot; التي تم جمعها من فرع الجانب، W: لا DNA) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> الرقم 7. مثال على التكبير PCR ناجحة من السلالات T1 باستخدام طريقة PCR المباشر. (A) رسم تخطيطي لناقلات ثنائي مصنع + والمستنسخة LIS-1 إدراج. الأسهم الزرقاء تدل على موقف الاشعال PCR تستخدم في فحص PCR المباشر (معدلة من تاكارا). (ب) PCR مع الاشعال M13F + 3 &quot;(C) PCR مع الاشعال M13R + 18A <stroنانوغرام&gt; (D) PCR مع الاشعال الحدود الأيمن (RB) ومتعددة الموقع الاستنساخ (MCS) ** كل حارة يمثل T1 من الزهور الفردية التي تم جمعها من C: فرع التحكم (غير مغموسة)، M: الرئيسي AG فرع الزهور، S: الجانب على فرع زهرة قبل الميلاد. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مصدر تسلسل التمهيدي إلى الأمام </td><td> تسلسل 5&#39;-3 &quot; </td><td> العكسي مصدر تسلسل التمهيدي </td><td> تسلسل 5&#39;-3 &quot; </td><td> الصلب تيمبراتوري (° C) </td><td> الوقت تمديد (ثانية) </td><td> حجم المتوقعة (بي بي) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &quot;(LIS-1 إدراج) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18A (LIS-1 إدراج) </td><td> TATTTTAACCC <bص /&gt; TATCTCCCAACAC </td><td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. بعض من الاشعال المستخدمة لاختبار PCR المباشر.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

هنا، نقدم بروتوكول لتحويل الكتان باستخدام الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار وتراجع. هذا البروتوكول هو بسيط لأداء وغير مكلفة، ولكن ينتج معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان.

الأزهار وتراجع التحول من الكتان (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) لتوليد المعدلة وراثيا السلالات مع معدل التحويل عالية

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.2K Views.  Case Western Reserve University.  هنا، نقدم بروتوكول لتحويل الكتان باستخدام الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار وتراجع. هذا البروتوكول هو بسيط لأداء وغير مكلفة، ولكن ينتج معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان. 

Video: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

توليد النباتات المعدلة وراثيا مع الملاحق نسخة واحدة باستخدام ناقل ثنائي بيبك-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic resources available to study how plants adapt to environmental stresses, its value as a functional genomics model and tool has been limited by the lack of a feasible transformation system. In this protocol, we report how to generate stable transgenic S. parvula lines using an Agrobacterium-mediated floral-dip method. We modified the transformation protocol used for A. thaliana to account for unique traits of S. parvula, such as an indeterminate flowering habit and a high epicuticular wax content on leaves. Briefly, S. parvula seeds were stratified at 4 &#176;C for five days before planting. Plants were grown at a photoperiod of a 14 h light and 10 h dark and a 130 &#181;mol m-2s-1 light intensity, at 22 &#176;C to 24 &#176;C. Eight to nine week-old plants with multiple inflorescences were selected for transformation. These inflorescences were dipped in an infiltration solution of Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying the pMP90RK plasmid. We performed two rounds of flower dipping with an interval of three to four weeks to increase the transformation efficiency. The T1 seeds were collected and dried for four weeks in a container with desiccants before germination to screen for candidate transformed lines. Resistance to BASTA was used to screen T1 plants. We sprayed the BASTA solution three times with an interval of three days starting at two week-old plants to reduce false positives. A BASTA drop test was performed on surviving individual plants to identify true positive transformants. The transformation efficiency was 0.033%, yielding 3&#8211;4 transgenic plants per 10,000 T1 seeds propagated.

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-mediated transformation using a floral-dip method can be successfully employed to create stable transgenic lines of the extremophyte model Schrenkiella parvula. We present a protocol modified from that for Arabidopsis thaliana, considering different growth habits and physiological characteristics of the extremophyte.

النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا<em&gt; ضمة الكوليرا</em&gt; بناء على التحول الطبيعي وإعادة التركيب، FLP

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Immunology and Infection

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Chemistry

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an Agrobacterium rhizogenes mediated transformation system on pigeon pea. The stem is infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced callus after 7 days and adventitious roots 14 days later. The generated transgenic hairy root was identified by morphological analysis and a GFP reporter gene.To further illustrate the application range of this system, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) was transformed into pigeon pea using this transformation method. The transgenic plants were treated with jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA), respectively, for the purpose of testing whether CcCIPK14 responds to those hormones. The results demonstrated that (1) exogenous hormones could significantly upregulate the expression levelof CcCIPK14, especially in CcCIPK14 over-expression (OE) plants; (2) the content of Genistein in CcCIPK14-OE lines was significantly higher than the control; (3) the expression level of two downstream key flavonoid synthase genes, CcHIDH1 and CcHIDH2, were up-regulated in the CcCIPK14-OE lines; and (4) the hairy root transgenic system can be used to study metabolically functional genes in non-model plants.

<meta charset="utf8"></head><body>تحليل وظيفة الجينات CcCIPK14 لإلقاء الضوء على نظام الجذر المعدل وراثيا الفعال

Here we present an efficient and stable transformation system for the functional analysis of the CcCIPK14 gene as an example, providing a technical basis for studying the metabolism of non-model plants.

سي سيبك14 تحليل وظيفة الجينات لإلقاء الضوء على نظام الجذر المعدل وراثيا الفعال

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

المستحثة بيئيا توريثه التغييرات في كتان

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

مفرط piggyBac Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

الأزهار وتراجع التحول من الكتان (

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

توليد النباتات المعدلة وراثيا مع الملاحق نسخة واحدة باستخدام ناقل ثنائي بيبك-GW

النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا

TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

سي سيبك14 تحليل وظيفة الجينات لإلقاء الضوء على نظام الجذر المعدل وراثيا الفعال

سي سيبك14 تحليل وظيفة الجينات لإلقاء الضوء على نظام الجذر المعدل وراثيا الفعال

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

المستحثة بيئيا توريثه التغييرات في كتان

مفرط piggyBac Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda