이 작품은 숲 Rohwer에게 수여 국립 보건 연구소 (1 R01 GM095384-01)에 의해 지원되었다. 우리는 리보 제로 역학 키트 조기 액세스를 제공하기위한 Epicentre, Illumina의 회사를 감사합니다. 우리는 초 원심 튜브 홀더의 설계 및 생산에 대한 마크 하타 감사합니다. 우리는 촬영 과정을 지원을위한 중요한 판독하고 원고의 토론 안드레아스 하스와 베냐민 놀즈 감사, 로렌 폴.

The authors have nothing to disclose.

바이러스 성 메타 지노믹스 바이러스 입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 석출이나 소량 농축기를 이용하여 농축된다. 일부의 경우, 농도는 필요하지 않을 수도 있지만, 미리 여과 또는 저속 원심 분리 단계가 진핵 미생물 세포를 제거하는데 사용된다. 바이러스 성 용 해물을 더욱 풍부하고 밀도 구배 초 원심 9,41 또는 작은 크기의 필터 (예를 들면 0.45 μm의)가 진핵 미생물 및 대형 셀 (25)을 제거하기 위해.하여 정제 될 밀도 구배 초 원심 분리는 일반적으로 바이러스 성 입자 (41)를 집중 수크로오스 또는 세슘 클로라이드와 같은 조밀하지만 불활성 해법 행한다. 물리적 분리는 바이러스 입자 크기와 밀도의 부력에 기초한다. 따라서, 필터의 기공 크기를 적절히 선택과 구배 엄격한 제제의 물리적 회복 성공으로, 특정 바이러스 커뮤니티를 분리하는 데 필수적인VLP를 41 (추출 밀도 내에서 필터 또는 가을에 통과하지 않는 즉, 바이러스 입자 metagenome에서 검출되지 않습니다)을 고립 지역 사회를 결정합니다. 바이러스의 분리 및 농축 후에, 무료 핵산 미생물 및 진핵 세포의 형태 모두 샘플 비 바이러스 게놈 물질 본 오염이있을 수있다. 따라서 시료에서 바이러스 입자의 순도 (도 1a 및도 1b)을 확인하는 것이 중요하다. 클로로포름 처리는 일반적으로 종래의 핵산 추출법 자유 핵산을 저하 클레아 처리하여 잔여 세포를 용해하기 위해 사용된다. 제시된 워크 플로우에 대한주의는 웹 기반 협동 학습 그라데이션를 입력 너무 낙관적 일 수있다 포락선 바이러스 입자를 제외 할 수 있으므로 바이러스 입자를 분리하는 밀도 기울기 분리를 사용했다. 대안은 &quot;포괄&quot;방법은 밀도 구배 separ를 생략하는 것입니다ATION는 0.45 μm의에서 지역 사회 DNA 분리 및 - 클로로포름의 DNase I.이 방법으로 처리 여과 액을 같은 면봉 또는 혈장에서 그와 같은 작은 샘플 볼륨을 수용하는 것이 적절하다. 그러나,이 클로로포름 내성 세균 오염과의 DNase I-내성 세포 DNA의 양이 더 발생할 수 있습니다. 높은 DNA 수율은 시퀀싱 옵션의 폭 넓은 선택을 제공함으로써 현재 시퀀싱 프로토콜은 1 NG 시퀀싱 라이브러리 준비를위한 핵산의 μg의 1이 필요합니다. 생성 viromes의 DNA 농도는 종종 200 이상 NG / μL로 검출 한계 이하의 범위. 회수 된 바이러스 핵산의 양은 직접 염기 서열 라이브러리 제조에 불충분 할 수있다. 이러한 경우, 핵산 증폭은 필수적이다. 링커 증폭 산탄 라이브러리 (LASLs) 2,42,43 복수 변위 증폭 (MDA)에 기초하여 전체 게놈 증폭 두 아르방법은 가장 일반적으로 충분한 DNA 시퀀싱을 생성하기 위해 사용될. 이러한 Phi29 DNA 폴리머 라제에 기초한 것과 MDA 방법은 증폭 바이어스 겪을 공지되어 있으며, 비 정량적 우선적 분류 학적 및 기능적 특성화 44,45 결과, ssDNA를 원형 DNA를 증폭 할 수있다. LASLs 접근법의 최적화 된 버전은 최소한의 바이어스를 소개 도시 (출발 물질이 소량에 대해) 더 높은 민감도를 촉진하고, 용이하게 다른 시퀀싱 플랫폼 (43)하도록되어있다. 그러나, 방법은 많은 단계가 DNA 손상을 최소화하기 위해 특수 장비를 필요로하고, dsDNA 템플릿에 한한다. 우리 연구실에서는이 방법이 성공적으로 기관지 lavage-, coral-과 바다 물에서 파생 된 VLP를 (미 출판과 Hurwitz의 등. 46)에서 추출 된 DNA의 검출 및 탐지 양을 증폭하도록하고있다. 데이터 분석 파이프 라인을 개발하는 것은 CLA를 가지고ssically 인해 바이러스 성 지역 사회의 매우 다양하고 대부분 알 수없는 특성으로 바이러스 메타 지노믹스 분석의 가장 어려운 문제 중 하나가되었습니다. 날짜 현재 바이러스 데이터베이스에 생물권에 약 10 8 바이러스 유전자형이가 있지만,이 대략 전체 바이러스 성 다양성의 약 1 / 100,000입니다 ~ 4000 바이러스 게놈가 포함되어 있습니다. 따라서, 바이러스 성 metagenomes의 분류 및 기능 할당 (예 : BLAST 47) 유사성 기반 검색은 고유의 과제를 가지고있다. 많은 서열은 게놈 데이터베이스의 상당한 유사성을 실패하고, 그러므로, 미지로 분류된다. 상동 기반 검색이 분류법을 할당을위한 가장 중요한 애플리케이션은 데이터 시퀀스를 작동하더라도, 데이터베이스 분석에 근거하여 독립적 인 대안 적 방법은 48 (50)이 개발되었다. Fancello 등. (51)은 비라에 사용되는 계산 도구와 알고리즘의 전체 리뷰를 제공리터의 메타 지노믹스. 미생물 메타 지노믹스 일반적으로, 저장성 용해 처리 된 미생물 군집 (HL-DNA)에서 추출 된 DNA의 총량은 20 ng의 5 μg의 범위. 수율은 환자의 건강 상태 및 본 연구 (표 2)에 추출 된 HL-DNA의 총 수율에 변화를 보이는 설명 수집 객담 시료의 양에 크게 의존한다. 중요한 단계는. 양질 시퀀스 데이터 생성 순서 라이브러리의 질에 의존 생성 2 효소 기반 DNA 단편화 절차를 이용하여 CF 객담 유래의 미생물 DNA로부터 생성 순서 라이브러리의 전형적인 크기 범위를 도시도. 최적 라이브러리 크기는 시퀀싱 플랫폼 및 애플리케이션의 선택에 의존하며, 따라서, 필요한 경우, 단편화와 같은 절차를 초음파 분무 같은 대체 방법을 통해 최적화 될 수있다. 이외에도제시된 대표적인 결과는, 여러 시점에 걸쳐 다수의 환자에서 수집 CF 객담에 제시된 방법의 성공은 또한 (2012) 9. 임 등의 알에서 설명하고 임 외. (2014) 10. 이전의 연구 9,10 모든 환자가 변동으로 인해 이러한 항생제 치료 등의 섭동 가능성시키면서 지역 사회 내 주요 선수의 지속성을 반영, 시간이 지남에 따라 이동 미생물 군집의 고유 한을 품고있는 것이 좋습니다. 이러한 변동도 외부 교란하지 않거나 인해 샘플링 절차 및 샘플 처리에 매일 발생 여부, 질문에 아직도있다. HL-DNA의 metagenomic 및 16S rDNA의 증폭 물 분석에 기초하여, 7 일 종 샘플링 보여준다 항생제 섭동없이 미생물 프로필 일일 변동 (주 1, 2, 3) 하였다 최소 (도 3a 및도 3b). 소개시항생제 시프로플록사신은 P.으로 알려진 세균성 병원균의 광범위한 스펙트럼을 대상으로하는 동안 경구 용 항생제의 duction 즉시 3 일 샘플링 한 후, 지역 사회 프로파일의 변화는 일 4. 명백하게되었다 녹농균, 황색 포도상 구균, 폐렴 구균 및은 치료 P.의 상대적인 농축 증가 녹농균은 연쇄상 구균 종을 감소한다. 및 P. melaninogenica. 6 일함으로써, 지역 사회 천천히 초기 시작 사회 구조에 회복되었다. 결과는 한 명의 환자 내에서 미생물 프로파일의 변동으로 인해기도에 지역 사회의 동요에 더 많은 가능성이 있음을 시사한다. HL-유도 된 DNA로부터 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes의 미생물 프로파일 사이의 일관성을 감안할 때, 우리는이 연구에서 사용 된 16S rRNA 유전자 프라이머에서 발생하는 편견을 배제. 16S rDNA 염기 분류에 걸쳐 본의 차이점에 대한 한 가지 가능한 설명총 DNA 및 HL-유래 DNA (그림 3B)에서 생성 된 알 프로파일은 슈도모나스 종 다량의 존재 일 수있다. 항생제 치료 후 세포 DNA. 이것은 이러한 차이는 7 일에서 가장 명백한 있다고 연구 결과에 의해 지원됩니다, 삼일 슈도모나스 종을 대상으로 항생제 치료 후. 다른 이외에. 시프로플록사신 일반적 만성 P. CF 환자에서 제 치료제로서 사용 활동의 스펙트럼이 가장 CF-관련된 병원체를 포함하더라도 녹농균 감염. 우리는 항생제 치료가 연쇄상 구균 종을 포함하여 취약 지역 사회를 근절한다는 가설을 세웠다. 따라서 내성 P.에 의해 채워 틈새를 만들어 녹농균. 녹농균은 생물막 지역 사회를 증가를 통해 저항을 얻을 수 있으며, 세포 외 DNA는 생물막 구조 (52)의 주요 구조 지원 될 것으로 나타났다. 심지어 t으로그는 사회 구조는 세포 외 DNA는 CF 객담에 남아있을 수있다, 회복되었다. 따라서 이러한 데이터는 저장성 용해 잠재적으로 만 인간 유래 DNA를 제거하지에 도움이 워크 플로에 제시된 세척 단계뿐만 아니라, 미생물 유래의 세포 외 DNA는 실제 미생물 프로파일을 잘못 수 있음을 시사한다. Metatranscriptomics 고품질 metatranscriptome는 상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 지역 사회 성적 증명서 (의 mRNA)의 편견 샘플링을 대표한다. 인해 mRNA를 짧은 반감기 및 제한된 양으로, 이는 프로토콜이 여기에 제시된 바와 같이, 회수 된 전 사체의 수를 최대화하기 위해 시료 처리를 최소화하는 것이 중요하다. 최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이들은 MICROB 풍부하게, 리보 제로 및 샘플 별 감산 시간을 포함ybridizations 올리고 뉴클레오티드 하이브리드 화, 및 5 &#39;모노 포스페이트를 함유하는 엑소 뉴 클레아 제 효소 활성 표적 RNA에 기초-ONLY mRNA의 키트에 기초 53아르. 또한, 이러한 우선적으로 선형 RNA를 polyadenylates 및 증폭 MessageAmp II-박테리아 키트와 같은 mRNA의 부화에 대한 몇 가지 접근 방식도 사용할 수 있습니다. 이러한 방법 (예를 들면, mRNA의 전용 MICROB E의 XPRESS 및 MessageAmp)의 일부는 최적의 효율을 동시에 사용된다. 그러나 이러한 접근 방법 모두의 효능은, 부분적으로 저하 rRNA의 작업을 자주 CF 샘플에서 추출 된 총 RNA에서 관찰 특히, 제한된다. 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 원핵 및 진핵 세포 모두에의 mRNA 이루어진 metatranscriptomes을 생성하기 위해 사용될 수 없다. 또한, 폴리 (A) 꼬리에 유용 시퀀스 데이터의 양을 줄일 수있는 서열에 첨가 하였다. 단독 뻗어와 지역의 품질이 저하 점수를하는 경향이, C상당수를 ausing 것은 폴리을 트리밍 한 후 시퀀싱 및 후 시퀀싱 소프트웨어, 평균 판독 유용한 길이에 의해 여과 될 판독한다 (A) 꼬리 (54)가 크게 감소 될 것이다. 복잡한 CF 미생물 지역 사회와 부분적으로 저하 RNA (도 4A 및 4C) 다루기, 우리의 이전 연구는 리보 제로 골드 키트에 의한 하이브리드 캡처 방법을 사용하여 결합 치료에 비해 인간과 미생물 rRNA를 모두 제거에 더 효과적인 것으로 나타났다 다른 키트 9 (표 3). 결과 데이터는 인간 숙주와 미생물 성적 증명서 모두를 동시에 분석 할 수 있습니다. 수율 및 RNA의 질뿐만 아니라 시퀀싱 플랫폼의 최종 선택에 따라 cDNA를 합성하는 단계를 포함하여 이들 공정 중 많은 시퀀싱 라이브러리 생성하여 간소화 될 수있다. 예를 들어, 리보 제로 처리 된 RNA는 metatranscriptome 시퀀싱 천칭을 만들기 위해 사용될 수있다RIES ScriptSeq RNA-SEQ 도서관 준비 키트를 사용하여. 동물 관련 커뮤니티의 Metagenomic 분석은 호스트와 관련된 지역 사회를 포함하는 전체 기능 엔티티의 포괄적 인 표현을 제공합니다. 여기에 제시된 플로 특히, 원하는 바이러스 및 미생물에 더하여 두꺼운 점액 세포 파편, 세포 DNA, 단백질 및 당 단백질 복합체의 높은 양뿐만 아니라, 숙주 세포를 포함하는 것과 복잡한 동물 연관된 다양한 시료에 적용 할 수있다 입자. 미생물 및 바이러스 성 입자는 모든 단계에서 손실 될 수있다하더라도, 분리 및 정제가 숙주 DNA의 양을 최소화하는 것이 필수적이다 입자. 메타 지노믹스 데이터가 조사 된 지역 사회의 대사 잠재력을 제공하지만, 인코딩 기능 9의 발현 차이를 공개하여이를 보완 metatranscriptomics. 유전체 및 전 사체 데이터의 포괄적 인 평가는 새로운 기능을 나왔고지역 사회 상호 작용의 역학에 ights 및 개선 치료 9,10,55의 개발을 용이하게한다.

<html> 인체와 관련된 바이러스 및 미생물 군집은 1,2- 시퀀싱 기술의 적용을 통해 지난 10 년간 광범위하게 연구되었다. 결과는 인간의 건강과 질병의 중요성 미생물의 인식으로 이어졌다. 주요 사업은 인간의 피부에있는 세균을 설명하는 인간 마이크로 바이 옴 프로젝트 (일부 고세균)에서 온, 구강 충치,기도, 비뇨 기관, 위장관 3 내. 기관지 폐포 세척액 (BAL) 4,5 인두 면봉 4을 통해 건강한 사람의기도의 또 마이크로 바이 옴의 연구는 폐 환경 샘플링 장치,기도에 과도 미생물 식민지의 결과로 역할을 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 장애인기도 표면의 미생물 식민지의 영향은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 본 것과 같은 심각한 만성 폐 감염으로 이어질 수 있습니다. t는 &quot;&gt; CF는 낭포 성 섬유증 막 횡단 레귤레이터 (CFTR)의 돌연변이 유전자 (6)에 의한 치명적인 유전 질환이다. 이러한 돌연변이가 차례로 상피 세포의 꼭대기의 표면을 가로 질러 transepithelial 이온 수송에 영향을 미치는 결함이있는 CFTR 단백질에 상승을 제공합니다.이 질환에 영향을 미칩니다 여러 기관 시스템,하지만 사망률과 이환율의 대부분은 CF 폐 질환 (7) 때문이다. CF 폐 미생물 식민지의 고유 한 생태계를 제공한다. 이온 수송에 결함이 호기성으로 구성된 미세 환경을 생성, CF기도에 구축하는 점액의 원인 정적 영양이 풍부한 점막 표면에 의해 고정 호기성 및 혐기성 구획.이 환경은 바이러스, 박테리아, 곰팡이를 포함한 식민지 미생물의 증식을 촉진한다. 급성 및 만성 폐 미생물 감염의 결과로 일정하지만 효과가 면역 반응으로 이어질 광범위한기도 개형, 폐 용량 감소, 궁극적 pulmo어림 실패. CF 폐와 관련된 세균 지역 사회는 물론 16S 리보솜 RNA (rRNA 유전자) 유전자 염기 서열 8 산탄 총 메타 지노믹스 (9, 10)를 사용하여 포함 모두 문화에 의존하는 문화 독립적 인 접근 방식을 사용하여 설명 하였다. 16S rRNA의 중심 접근법은 미생물 종의 다양한 특징 및 커뮤니티 다양성 넓은 변화를 포착 할 수있다. 그러나, 지역 사회를 정의의 해상도로 제한된다. (Claesson 등 2010 년 11 요약) 및 신진 대사에 영향을 미치는 잠재력의 예측은 확인 된 분류군에 대한 공지 된 일반적인 기능으로 제한됩니다. 따라서, 16​​S rRNA의 유전자 시퀀싱 방법은 CF 폐에 존재하는 다양한 미생물 지역 사회의 필요 분류 학적 및 기능적 분석의 정확성에 대한 불충분하다. 여기에 설명 metagenomic 접근은 그 한계를 극복, 16S rRNA 유전자 기반 접근법을 보완하고, 상대적으로 효율적인 방법을 가능하게미생물 군집의 분류 및 CF 폐 유전 적 내용을 모두 분석합니다. 동물 샘플들로부터 격리 관련된 미생물 DNA는 종종 숙주 DNA를 다량 포함. 14 - CF 객담 또는 폐 조직 샘플은 일반적으로 면역 반응에 의해 방출 인간 호중구 DNA 다량의 DNA (12)의 총 종종 99 % 초과를 함유한다. 일부 본래 인간 세포가 존재하더라도,이 DNA 용액의 대부분은 무료 또는 미생물의 표면에 흡착된다. 또한, 매우 점성 점액 플러그, 세포 잔해 및 다른 오염 물질이 미지의 존재는 상기 균체 분리 복잡. 여러 가지 방법을 선택적으로 인간의 DNA (16), 및 MolYsis 키트, 제한적인 성공에 모든 저하 에티 디움 브로마이드 모노 아자 미생물 균체 (15)에서 분리 된 인간의 DNase I 치료에 퍼콜 그라디언트를 포함하여 인간 DNA의 이러한 샘플을 파괴 시험 하였다.<html> CF 객담에 가장 효과적인 미생물 DNA 정제 과정을 최신 것은 Breitenstein 등에 의해 기술 된 방법의 변형이었다. (1995) 17. 본원 저장성 용해 (HL)로 알려진 방법이 방법은, 점액 이황화 결합, 진핵 세포의 저장성 용해하고, 수용성 DNA의 DNase I (9)의 처리를 줄이기 위해 β 머 캅토 에탄올의 조합을 사용한다. 대안의 부족에도 불구하고 HL 방법으로 인해 (I)에 대한 몇 가지 우려 원치 않는 미생물의 분해 및 화상으로 인한 가능한 편견을 제기 (II) 지역 사회 조성 (9, 10)의 관찰 변동이 샘플 가공과 관련이 변화의 이슈인지. 샷건 metagenomes의 생성 외에, 우리는 전체 DNA 및 연속 7 일에 걸쳐 단일 환자로부터 수집 객담 샘플들의 동일한 세트를 사용하여 HL 방법에서 추출 미생물 DNA의 16S rRNA 유전자 프로파일을 비교함으로써, 이러한 문제를 해결한다. 미생물 군집에 비해 ENT는 &quot;&gt;, 동물과 관련된 바이러스 성 지역 사회의 특성은 제한 (18, 19)이다 CF기도의 바이러스 성 사회는 최소한 20 특성화되었다 -.. 22 CF기도의 바이러스 성 지역 사회의 DNA를 특징 짓는 첫 번째 metagenomic 연구 CF 폐와 관련된 대부분의 바이러스는 파지 20 있음을 보여 주었다. CF와 비 CF 개인의 파지의 대사 가능성이 크게 달랐다. 특히, CF 개인의 파지 사회가 CF기도의 생리에 박테리아 숙주 적응의 반사 유전자를 실시, 및 CF 폐 조직에서 바이러스의 세균 독성 (20). 이후 metagenomic 연구는 해부학 적 영역 (22) 사이의 바이러스 성 지역 사회의 고유 한 공간 이질성을 보여 주었다. 또한, CF 폐 조직은 어떤 생태계 22 일에 관찰 된 가장 낮은 바이러스 성 다양성을 숨겨. 확인 된 대부분의 바이러스는 파지했다가능성 CF 병원균에 감염. 그러나, 헤르페스 바이러스, 아데노 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV)와 같은 진핵 세포 바이러스도 검출되었다. 폐 조직에 낭종 해부 동안 관찰 한 경우에서는, 인간 유두종 바이러스 게놈의 99 % 이상이 환자는 폐 암 또는 유두종으로 진단되지 않았다하더라도, 회수 하였다. 이것은 바이러스 다이버 시티는 본 조직 손상의 정도를 반영 할뿐만 아니라 노출 및 하부지지 않은 질환을 설명 할 수있을뿐만 아니라 것을 나타낸다. 여기에 설명 된 프로토콜은 두꺼운 점액, 호스트와 균체, 자유 DNA뿐만 아니라 세포 파편 다량으로 구성 샘플로부터 바이러스 - 유사 입자 (VLP를)를 분리하기 간단하지만 강력한 방법을 제공한다. 메타 지노믹스 보완, metatranscriptomics는 미생물 지역 사회와 호스트 9,23에서 유전자 발현의 역학을 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 경우, 모두 미생물 및 호t mRNA를 우선적으로 선택해야합니다. 세균의 mRNA가 폴리아 데 닐화되지 않기 때문에, 올리고 dT를 기반 mRNA의 풀다운 방법으로 악용 할 수 없습니다. 샘플 진핵 mRNA를 다량 함유하는 것으로 알려진 경우, 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 호스트 관련된 샘플에서 사용될 수 없다. CF 객담 포함한 많은 동물 연관된 샘플은, RNases 포함 높은 세포 파편의 양 및 클레아 외에도 세포의 높은 농도를 포함한다. 따라서, 또 다른 도전 과제는 metatranscriptome 처리 중에 광범위한 RNA 분해를 방지하는 것이다. 대부분의 경우에, CF 객담에서 추출한 총 RNA는 RNA 유래의 하류 어플리케이션 및 유틸리티를 제한 부분적으로 저하된다. 최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이러한 방법의 효능은 그러나 특히 부분적으로 저하 rRNA의 9,24 작업을 할 때, 제한된다. 여기에 사용 된 방법은 허용효율적인 하류 총 rRNA의 제거에 적합 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA의 검색을 위해 에디션. 두 개의 서로 다른 키트를 비교 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA에서 rRNA 유전자 제거의 효율을 직접 비교는 임 등의 알에 의해 설명되었다. (2012) 9. 전반적으로,이 원고의 목적은 예를 들어 객담 샘플을 사용하여, 하나의 동물 연관된 샘플로부터의 프로토콜 세트 바이러스 및 미생물 샷건 metagenomes를 생성한다 (도 1), 및 metatranscriptome를 제공하는 것이다. 분자 실험실 워크 플로는 교차 오염을 최소화하기 위해 별도의 사전 및 사후 증폭 영역을 포함해야한다. 방법은 조직 (22), 인두 및 구강 인두 면봉 (25), 기관지 폐포 세척액 (BAL)와 산호 (게시되지 않은 데이터)와 같은 다른 종류의 시료에 쉽게 적응할 수 있습니다. 각 샘플 수령시 즉시 처리, 특히 미생물 메타 지노믹스와 만족하여야한다atranscriptomics 연구가 요구된다. 샘플을 동결하면 잠재적 셀 무결성을 방해로 동결 metagenomes 속담 미생물 균체의 분리를 제한한다. 그러나, 동결 metatranscriptomics과 바이러스 분리되지만, 동결 - 해동 과정을 통해 영향을받을 수있는 회수 된 바이러스 입자의 RNA의 질과 양을 배제하지 않는다. 그것은 그 객담이 BAL이 너무 침입 할 수있는 성인 CF 환자와 만성 폐 질환 (26, 27)과 관련된 많은 연구에서 샘플의 기본 소스 역임했다 주목하는 것이 중요하다. 우리의 연구에서, 객담 샘플을 구강 및 최소 객담 내 구강 미생물 오염을 유지하는 멸균 생리 식염수를 사용하여 구강 헹굼 다음 신중하고 일관된 샘플링 방법, 즉, 함께 수집 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

높은 처리량 시퀀싱의 접근성은 생물학의 여러 분야를 혁명을 일으켰다. 더 나은 호스트 관련 바이러스와 미생물 군집을 이해하기 위해서는, DNA와 RNA 추출을위한 포괄적 인 워크 플로우를 개발 하였다. 플로 동시에 차세대 시퀀싱 단일 샘플로부터 바이러스 및 미생물 metagenomes뿐만 아니라 metatranscriptomes를 생성한다. 이러한 방식의 커플 링은 분류 학적 특성과 사회 인코딩 기능 모두의 개요를 제공합니다. 그것은 매우 점성과 점액의 높은 양, 무료 호중구 DNA 및 기타 알 수없는 오염 물질을 포함하고 있기 때문에 제시된 방법은, 낭포 성 섬유증 (CF) 가래, 문제 샘플 유형을 사용합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 문제를 대상으로 성공적 최소 인간 DNA의 오염 미생물 및 바이러스 성 DNA를 회수. 메타 지노믹스 연구를 보완하기 위해, metatranscriptomics 프로토콜은 모두 미생물을 복구하기 위해 최적화 된상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 호스트의 mRNA. 데이터 특성의 개요는 방법의 성공 여부를 평가하기위한 기준으로서 역할을 제시한다. 추가 CF 객담 샘플은 (i) 단일의 환자 내에서 연속 7 일에 걸쳐 마이크로 바이 프로파일의 일관성을 평가하고, (ⅱ) 16S 리보솜 RNA 유전자 기반 시퀀싱 metagenomic 방법의 일관성을 비교하기 위해 수집 하였다. 결과는 항생제 교란하지 않고 미생물의 프로필 매일 변동이 최소이고 일반적인 CF-관련된 박테리아의 분류 프로파일 저장성 용해 (HL) 유래 DNA로부터 생성 된 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes 사이에 매우 유사한 것으로 나타났다. 저장성 용해 및 세척 단계는 오직 인간 유래 DNA를 제거하지 시킨다는 이점이 제안하지만, 16S rDNA 염기 분류 학적 프로파일 간의 차이가 전체 DNA 및 HL 유래 DNA로부터 생성뿐만 아니라 extracellul을 미생물 유래실제 미생물 프로파일을 잘못 할 수있다 아칸소 DNA.

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K 조회수.  San Diego State University.  일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다. 

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Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Qiagen Miniprep 키트를 사용하여 세균의 플라스미드 식민지에서 DNA를 정화

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

연구

생물학

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

랍스터의 뱃속의 총 해부, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 HPLC 방법

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

파편을 사용하여 풀링된 장면에서 드문 게놈 변종의 탐지

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...