Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) assegnato a Forest Rohwer. Ringraziamo Epicentre, una società di Illumina per fornire accesso anticipato ai kit Ribo-Zero Epidemiologia. Ringraziamo Mark Hatay per la progettazione e la produzione del supporto tubo ultracentrifugazione. Ringraziamo Andreas Haas e Benjamin Knowles per letture critiche e le discussioni del manoscritto, e Lauren Paolo per assistere il processo di ripresa.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomica virali Particelle virali sono concentrati utilizzando polietilene glicole (PEG) precipitazione o piccoli concentratori di volume. In alcuni casi, la concentrazione può non essere necessario, ma pre-filtrazione o centrifugazione a bassa velocità passi sono usati per rimuovere le cellule eucariotiche e microbiche. Lisati virali saranno ulteriormente arricchite e purificati mediante gradiente di densità ultracentrifugazione 9,41 o filtri di piccole dimensioni (ad esempio, 0,45 micron) per rimuovere le cellule microbiche eucariotiche e grandi 25. Gradiente di densità ultracentrifugazione viene in genere effettuata con soluzioni dense ma inerti come saccarosio o di cesio cloruro di isolare e concentrare le particelle virali 41. La separazione fisica si basa sulla dimensione e densità di galleggiamento di particelle virali. Pertanto, la corretta scelta della dimensione dei pori del filtro e la rigorosa preparazione di gradienti sono essenziali per isolare comunità virali specifici, come il successo del recupero fisico diVLP determina la comunità isolata 41 (cioè particelle virali che non passano attraverso il filtro o rientrano la densità di estrazione non saranno rilevate nel metagenoma). Dopo isolamento virale e concentrazione, ci possono essere contaminanti non virale materiale genomico presente nel campione sia nella forma di acidi nucleici liberi e microbica e cellule eucariotiche. Pertanto, è fondamentale per verificare la purezza di particelle virali nei campioni (Figure 1A e 1B). Un trattamento cloroformio è comunemente utilizzato per lisare cellule rimanenti, seguito da un trattamento con nucleasi di degradare gli acidi nucleici liberi prima dell&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico. Un avvertimento al flusso di lavoro presentato è stato l&#39;uso della separazione gradiente di densità per isolare le particelle virali come può escludere particelle virali con involucro che possono essere troppo positivo per inserire il gradiente di CsCl. Un&#39;alternativa &quot;catch-all&quot; metodo è quello di omettere la SEPAR gradiente di densitàzione e isolare il DNA comunità dalle 0,45 micron - filtrati trattati con cloroformio e DNasi I. Questo approccio è anche opportuno accogliere piccoli volumi di campione come quelli di tamponi o plasma sanguigno. Tuttavia, ciò può provocare la contaminazione batterica cloroformio-resistenti e superiori quantità di DNasi I-resistenti DNA extracellulare. Protocolli di sequenziamento attuali richiedono 1 ng a 1 mg di acidi nucleici per la preparazione biblioteca sequenziamento del DNA per cui i rendimenti più elevati offrono una scelta più ampia di opzioni di sequenziamento. La concentrazione di DNA viromes generati varia spesso da sotto del limite di rilevazione a più di 200 ng / ml. La quantità di acidi nucleici virali recuperati può essere insufficiente per la preparazione diretta biblioteca sequenziamento. In tali casi, l&#39;amplificazione dell&#39;acido nucleico è essenziale. Amplificazione fucile librerie Linker (LASLs) 2,42,43 e tutta l&#39;amplificazione del genoma basata su più spostamenti di amplificazione (MDA) sono i duemetodi più comunemente utilizzati per generare DNA sufficiente per sequenziamento. MDA metodi come quelli basati su Phi29 DNA polimerasi sono noti a soffrire di pregiudizi amplificazione, e possono amplificare preferenzialmente ssDNA e DNA circolare, con conseguente tassonomico non quantitativa e caratterizzazione funzionale 44,45. Una versione ottimizzata dell&#39;approccio LASLs ha dimostrato introdurre solo distorsioni minime, promuove maggiore sensibilità (per piccole quantità di materiale di partenza), ed è facilmente adattato per diverse piattaforme 43 sequenziamento. Tuttavia, l&#39;approccio ha molti passaggi, richiede attrezzature specializzate per ridurre al minimo la perdita di DNA, ed è limitata ai modelli dsDNA. Nel nostro laboratorio, questo approccio è stato adattato con successo per amplificare quantità rilevabile e non rilevabili di DNA estratto da lavage- broncoalveolare, VLP-derivati ​​acqua coralline e mare (inediti e Hurwitz et al. 46). Lo sviluppo di gasdotti di analisi dei dati ha classically stato uno degli aspetti più impegnativi di analisi metagenomica virale a causa della natura altamente diversificata e in gran parte sconosciuti delle comunità virali. Mentre ci sono circa 10 8 genotipi virali nella biosfera, ad oggi attuali banche dati virali contenere ~ 4.000 genomi virali, che è circa 1 / 100.000 di questa diversità virale totale approssimativa. Pertanto, le ricerche basate similarità (come BLAST 47) per l&#39;assegnazione tassonomica e funzionale in metagenomi virali possiedono sfide inerenti. Molte sequenze non avere analogie significative genomi nel database, e di conseguenza, sono classificati come sconosciuti. Anche se le ricerche basate omologia-sono le applicazioni più importanti per l&#39;assegnazione di tassonomia e la funzione per la sequenza di dati, metodi alternativi basati su analisi indipendente dal database sono stati sviluppati 48- 50. Fancello et al. 51 forniscono una revisione completa di strumenti di calcolo e gli algoritmi utilizzati in Virametagenomica l. Microbica Metagenomica Tipicamente, la quantità totale di DNA estratto da comunità ipotonici lisi trattati microbiche (HL-DNA) vanno da 20 ng a 5 mg. La resa è fortemente dipendente dallo stato di salute del paziente e la quantità di campione di espettorato raccolti, che spiega le variazioni visti nella resa totale di HL-DNA estratto in questo studio (Tabella 2). I passaggi critici per generare dati di sequenza buona qualità affidamento sulla qualità delle librerie sequenziamento generati. Figura 2 mostra un intervallo tipico dimensioni per le librerie sequenziamento generati dal DNA microbico CF espettorato derivato utilizzando una procedura basata frammentazione del DNA enzimatica-. La dimensione ottimale biblioteca dipende dalla scelta della piattaforma sequenziamento e l&#39;applicazione, e di conseguenza, la procedura frammentazione può essere ottimizzata, se necessario, attraverso approcci alternativi come sonicazione e nebulizzazione. Inoltrei risultati rappresentativi presentati, il successo del metodo presentato su espettorato CF raccolti da più pazienti su più punti di tempo è anche illustrata in Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10. Studi precedenti 9,10 suggeriscono che ogni paziente ospita un set unico di comunità microbica che sposta nel tempo, riflettendo così la persistenza dei principali attori all&#39;interno della comunità, mentre fluttuazioni sono probabilmente dovute a perturbazioni quali trattamenti antibiotici. Se queste fluttuazioni si verificano quotidianamente anche senza perturbazioni esterne oa causa di modalità di campionamento e trattamento del campione, è ancora in discussione. Basato sul metagenomic HL-DNA e l&#39;analisi amplicon 16S rDNA, il campionamento longitudinale 7 giorni mostra che la fluttuazione giornaliero di profili microbici senza perturbazioni antibiotico (giorno 1, 2 e 3) è minima (Figure 3A e 3B). Su introproduzione di antibiotici per via orale subito dopo il Day 3 di campionamento, i cambiamenti nel profilo di comunità divenne evidente il giorno 4. Mentre la ciprofloxacina antibiotico si rivolge a un ampio spettro di batteri patogeni noti come P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus e la polmonite, il trattamento aumentato la relativa abbondanza di P. aeruginosa mentre diminuendo il spp Streptococcus. e P. melaninogenica. By Day 6, la comunità lentamente recuperato alla struttura iniziale comunità di partenza. I risultati suggeriscono che le fluttuazioni dei profili microbici all&#39;interno di un singolo paziente è più probabile a causa di perturbazioni della comunità nelle vie aeree. Data la coerenza tra i profili microbici delle biblioteche 16S rDNA e metagenomi di DNA HL-derivato, abbiamo escluso i pregiudizi derivanti dai primer 16S rRNA utilizzati in questo studio. Una possibile spiegazione per le differenze viste attraverso 16S rDNA tassonomicaprofili AL generati dal DNA totale e DNA HL-derivato (Figura 3B) possono essere la presenza di elevate quantità di Pseudomonas spp. DNA extracellulare dopo il trattamento antibiotico. Questo è supportato dai risultati che queste differenze sono più evidenti a 7 ° giorno, tre giorni dopo il trattamento di antibiotici, che si rivolge Pseudomonas spp. oltre ad altri. La ciprofloxacina è comunemente usato come trattamento di prima linea nei pazienti con FC e P. cronica infezione aeruginosa anche se il suo spettro di attività include la maggior parte patogeni CF-associate. Abbiamo ipotizzato che il trattamento antibiotico sradica le comunità a rischio, tra cui Streptococcus spp. e quindi la creazione di una nicchia riempito da resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa può ottenere aumentando la resistenza sue comunità biofilm e DNA extracellulare ha dimostrato di essere il principale sostegno strutturale della sua architettura biofilm 52. Anche se tegli struttura della comunità recuperato, DNA extracellulare può stare nella CF sputo. Pertanto, questi dati suggeriscono che la lisi ipotonica e le fasi di lavaggio presentati in questo flusso di lavoro potenzialmente beneficiare non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma il DNA extracellulare anche microbica derivato che possono falsare i profili microbici reali. Metatranscriptomics Un&#39;alta qualità metatranscriptome deve contenere relativamente poche sequenze di RNA ribosomiale (rRNA) e rappresentano un campione imparziale delle trascrizioni comunità (mRNA). A causa della breve emivita e quantità limitata di mRNA, è fondamentale che il protocollo, come presentato qui, riduce al minimo la manipolazione del campione per massimizzare il numero di trascrizioni recuperati. Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. Questi includono MicroB Enrich, Ribo-Zero, e specifici del campione sottrattiva hybridizations 53 che si basano sulla oligonucleotide ibridazione, e l&#39;mRNA SOLO kit che si basa sull&#39;attività enzimatica exonuclease RNA mira contenente un &#39;monofosfato 5. Inoltre, diversi approcci per arricchimenti mRNA come il MessageAmp Kit II-I batteri che polyadenylates preferenzialmente ed amplifica RNA lineari sono inoltre disponibili. Alcuni di questi metodi (ad esempio, di mRNA-ONLY, MicroB E Xpress e la MessageAmp) vengono utilizzati contemporaneamente per l&#39;efficienza ottimale. Tuttavia, l&#39;efficacia di tutti questi approcci sono limitati, in particolare quando si lavora con parzialmente degradata rRNA, come spesso osservato in RNA totale estratto da campioni CF. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato per generare metatranscriptomes costituiti sia mRNA eucariotico e procariotica. Inoltre, il poli (A) coda aggiunto alle sequenze può ridurre la quantità di dati di sequenza utili. Regioni con tratti omopolimero tenderanno ad avere punteggi di qualità inferiori, causing un numero significativo di legge per essere filtrati dal sequenziamento e software di post-sequencing, e la durata media di lettura utile dopo il taglio off poly (A) code saranno ridotti significativamente 54. Trattare con le comunità microbiche complesse CF e RNA parzialmente degradati (Figure 4A e 4C), il nostro studio precedente ha mostrato che il metodo di ibridazione-capture dal kit oro Ribo-Zero è stato più efficace nella rimozione sia rRNA umana e microbica rispetto ai trattamenti combinare con altri kit 9 (tabella 3). I dati risultante permette l&#39;analisi simultanea di entrambi ospite umano e trascrizioni microbiche. A seconda della resa e la qualità dell&#39;RNA, nonché scelta definitiva della piattaforma di sequenziamento, molti di questi processi compreso sintesi passo cDNA possono essere semplificati con generazione librerie sequenziamento. Ad esempio, RNA trattato Ribo-Zero può essere usato per fare metatranscriptome sequenziamento libraRies utilizzando kit ScriptSeq RNA-Seq Biblioteca Preparazione. Analisi metagenomica di comunità animali associate fornisce una rappresentazione completa dell&#39;entità funzionale globale che comprende l&#39;host e le sue comunità associate. Il flusso di lavoro qui presentato è adattabile ad una varietà di campioni animali associata complesse, in particolare quelli che contengono muco denso, elevate quantità di detriti cellulari, DNA extracellulare, proteine ​​e complessi glicoproteici, così come cellule ospiti, oltre al microbica virale e desiderato particelle. Anche se le particelle virali e microbiche possono essere persi ad ogni passo, particelle isolamento e purificazione sono essenziali per minimizzare la quantità di DNA ospite. Mentre i dati metagenomica offre potenzialità metaboliche delle comunità esaminati, metatranscriptomics completare tale rivelando l&#39;espressione differenziale delle funzioni codificate 9. Una valutazione completa dei dati genomica e trascrizioni ha dato nuove insIRITTI alla dinamica delle interazioni nelle comunità e facilita lo sviluppo di migliorare terapie 9,10,55.

<html> Comunità virali e microbiche associate con il corpo umano sono stati studiati estesamente negli ultimi dieci anni attraverso l&#39;applicazione di tecnologie di sequenziamento 1,2. I risultati hanno portato al riconoscimento dei microbi importanza nella salute umana e la malattia. L&#39;importante iniziativa è venuto dal progetto umano microbioma che descrive i batteri (e alcuni archeobatteri) residenti sulla pelle umana, e all&#39;interno di cavità orale, vie respiratorie, del tratto urogenitale e gastrointestinale 3. Ulteriori studi microbioma di sane vie aeree umani attraverso lavaggio broncoalveolare (BAL) di 4,5 e tamponi nasofaringei 4 hanno dimostrato che il polmone può servire come strumento di campionamento ambientale, i risultati di colonizzazione microbica transitoria nelle vie aeree. Tuttavia, l&#39;impatto della colonizzazione microbica in superfici delle vie aeree con problemi può portare a infezioni polmonari gravi e croniche, come quelli visti in fibrosi cistica (CF) pazienti. t &quot;&gt; CF è una malattia genetica letale causata dalla mutazione in transmembrana della fibrosi cistica regolatore (CFTR) gene 6. Queste mutazioni generano proteine ​​CFTR difettosa che a loro volta influenzano il trasporto di ioni transepiteliale attraverso la superficie apicale dell&#39;epitelio. La malattia colpisce molteplici sistemi di organi, ma la maggior parte di mortalità e morbilità è imputabile a malattie polmonare FC 7. Il polmone CF fornisce un ecosistema unico per la colonizzazione microbica. Il difetto di trasporto di ioni provoca muco per costruire nelle vie aeree CF, creando microambienti, comprensivi di aerobica , microaerofili e scomparti anaerobici ancorati da una superficie mucosa ricca di nutrienti statico. Questo ambiente facilita la colonizzazione e la proliferazione di microbi, tra cui virali, batteri e funghi. acuta e le infezioni microbiche polmonari croniche portano a risposte immunitarie costanti ma inefficaci, con conseguente ampio rimodellamento delle vie aeree, perdita di capacità polmonare, e in ultima analisi pulmofallimento nario. Comunità batteriche associate al polmone CF sono stati ben descritti utilizzando approcci cultura-dipendenti e cultura indipendente, che includono uso 16S RNA ribosomiale (rRNA) gene sequenziamento 8 e metagenomica fucile 9,10. L&#39;approccio basato rRNA 16S è in grado di caratterizzare una vasta gamma di specie microbiche e catturare ampi cambiamenti nella diversità delle comunità. Tuttavia, è limitata nella sua risoluzione nella definizione comunità (riassunte Claesson et al. 2010 11) e le previsioni di potenziali metaboliche sono limitati a tali funzioni generali noti per il taxa identificati. Pertanto, 16S rRNA metodi di sequenziamento del gene sono insufficienti per il necessario tassonomica e funzionale la precisione analitica delle diverse comunità microbiche presenti nei polmoni CF. L&#39;approccio metagenomica descritto qui completa l&#39;approccio basato rRNA 16S, supera i suoi limiti, e consente un modo relativamente efficaceper analizzare sia la tassonomia comunità microbica e contenuto genetiche nei polmoni CF. DNA microbica isolato da campioni animale associato spesso contiene una grande quantità di DNA ospite. Campioni di espettorato o tessuto polmonare CF solito contengono una grande quantità di DNA umano rilasciata dai neutrofili nella risposta immunitaria, spesso superiore al 99% del DNA totale 12 - 14. Sebbene alcune cellule umane intatti possono essere presenti, la maggior parte di questo DNA è libero in soluzione o adsorbiti sulla superficie dei microbi. Inoltre, la presenza di tappi particolarmente viscosi muco, detriti cellulari e altri contaminanti sconosciuti complicare ulteriormente isolamento delle cellule microbiche. Diversi metodi sono stati testati per deplezione questi campioni di DNA umano, compresi Percoll a gradienti umana separata da cellule microbiche 15, il trattamento con DNasi I, bromuro di etidio monoazide a degradare selettivamente DNA umano 16, e il kit MolYsis, tutti con successo limitato.<html> Ad oggi la procedura di purificazione del DNA microbico più efficace per CF espettorato è una modificazione del processo descritto da Breitenstein et al. (1995) 17. Questo approccio, noto come metodo qui ipotonica lisi (HL), utilizza una combinazione di β-mercaptoetanolo per ridurre mucina legami disolfuro, lisi ipotonica delle cellule eucariotiche e trattamento DNasi I di DNA solubile 9. Nonostante la mancanza di alternative al metodo HL ha sollevato alcune preoccupazioni a causa di (i) eventuali pregiudizi derivanti dalla lisi indesiderato di microbi e (ii) se le fluttuazioni osservate nella composizione della comunità 9,10 sono un artefatto di variazioni associate con l&#39;elaborazione del campione. Oltre alla generazione di metagenomi fucile, abbiamo affrontare questi problemi confrontando i profili del gene 16S rRNA del DNA totale e DNA microbico estratto dal metodo HL utilizzando la stessa serie di campioni di espettorato raccolti da un singolo paziente in sette giorni consecutivi. ent &quot;&gt; Rispetto alla comunità microbiche, la caratterizzazione delle comunità virali associati con gli animali è limitato 18,19 Le comunità virali CF vie aeree sono state caratterizzate solo in minima parte 20 -.. 22 Il primo studio metagenomica caratterizza il DNA delle comunità virali in CF vie respiratorie hanno dimostrato che la maggior parte dei virus associati polmoni CF sono fagi 20. Il potenziale metabolico del fago in CF e individui non-CF è stata significativamente diversa. In particolare, le comunità dei fagi in individui CF effettuate geni riflettente di adattamenti ospitanti batteriche alla fisiologia del CF vie aeree, e batterici di virulenza. 20 studi metagenomiche successivi di virus nel tessuto polmonare CF dimostrato distinto eterogeneità spaziale delle comunità virali tra le regioni anatomiche 22. Inoltre, il tessuto polmonare CF ospitava la diversità virale più basse fino ad oggi in qualsiasi ecosistema 22. La maggior parte dei virus identificati erano fagicon la possibilità di infettare i patogeni CF. Tuttavia, sono state rilevate anche virus eucariotiche quali herpesvirus, adenovirus e virus del papilloma umano (HPV). In un caso in cui sono stati osservati cisti nel tessuto polmonare durante la dissezione, più del 99% di un genoma papillomavirus umano è stato recuperato, anche se il paziente non è mai stato diagnosticato un papilloma polmonare o carcinoma. Ciò indica che la diversità virale presente non solo riflette la gravità del danno tissutale, ma può anche esporre e spiegare una malattia non caratterizzato sottostante. I protocolli descritti forniscono un modo semplice, ma potente per isolare particelle virali (VLPs) da campioni che consistono di grandi quantità di muco denso, di accoglienza e di cellule microbiche, DNA libero, così come detriti cellulari. A complemento metagenomica, metatranscriptomics viene utilizzato per monitorare le dinamiche di espressione genica in tutta la comunità microbica e l&#39;host 9,23. In questo caso, sia microbica e host mRNA devono essere preferenzialmente selezionato. Poiché mRNA batteriche non sono poliadenilato, un metodo di pull-down mRNA basato oligo-dT non può essere sfruttata. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato in campioni ospitanti associata se sono noti i campioni contengono grandi quantità di mRNA eucariotico. Molti campioni animali-associata, compresi CF espettorato, contengono un&#39;alta densità di cellule oltre a elevate quantità di detriti cellulari e nucleasi che includono RNasi. Pertanto, un altro compito impegnativo è quello di evitare una eccessiva degradazione dell&#39;RNA durante metatranscriptome lavorazione. Nella maggior parte dei casi, l&#39;RNA totale estratto da espettorato CF è parzialmente degradata, limitando le applicazioni a valle e l&#39;utilità del RNA derivato. Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. L&#39;efficacia di questi approcci è tuttavia limitata, soprattutto quando si lavora con parzialmente degradato rRNA 9,24. I metodi impiegati qui consentonoed per il recupero di RNA totale parziale degrado adatto per la rimozione efficiente rRNA totale valle. Confronto diretto della efficienza nella rimozione rRNA parzialmente degradata da RNA totale confrontando due diversi kit è stato illustrato da Lim et al. (2012) 9. In generale, lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire un set completo di protocolli (figura 1) per generare metagenomi fucile virali e microbiche, e un metatranscriptome, da un singolo campione animale-associata, utilizzando campione di espettorato indotto come esempio. Flusso di lavoro di laboratorio molecolare dovrebbe includere zone pre e post-amplificazione separati per ridurre al minimo la contaminazione incrociata. I metodi sono facilmente adattabili ad altri tipi di campioni come il tessuto 22, nasofaringeo e orofaringei 25, lavaggio broncoalveolare (BAL) e corallo (dati non pubblicati). Ogni campione deve essere trattato immediatamente al momento della raccolta soprattutto quando metagenomica microbica e ha incontratoatranscriptomics studi sono desiderati. Se sono stati congelati i campioni, limita l&#39;isolamento di cellule microbiche intatte per metagenomi microbici come il congelamento potenzialmente compromettere l&#39;integrità delle cellule. Tuttavia, il congelamento non esclude metatranscriptomics e isolamento virale, ma la qualità di RNA e la quantità di particelle virali recuperati possono essere influenzati attraverso il processo di congelamento-scongelamento. È importante notare che espettorato indotto è servito come fonte primaria di campioni in molti studi associati pazienti CF adulti e altre malattie polmonari croniche come 26,27 BAL può essere troppo invasivo. Nei nostri studi, campioni di espettorato sono stati raccolti con un metodo di campionamento attenta e coerente, cioè, dopo collutorio e risciacquo della cavità orale con soluzione salina sterile per mantenere la contaminazione microbi orali nei campioni di espettorato al minimo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

L&#39;accessibilità di high-throughput sequencing ha rivoluzionato molti campi della biologia. Per comprendere meglio le comunità virali e microbiche ospite-associato, un flusso di lavoro completo per l&#39;estrazione di DNA e RNA è stato sviluppato. Il flusso di lavoro genera contemporaneamente metagenomi virali e microbiche, nonché metatranscriptomes, da un singolo campione per sequenziamento di prossima generazione. L&#39;accoppiamento di questi approcci fornisce una panoramica sia delle caratteristiche tassonomiche e le funzioni della community codificato. I metodi presentati usano fibrosi cistica (CF) espettorato, un tipo di campione problematica, poiché è estremamente viscoso e contiene elevata quantità di mucine, DNA neutrofili libera, e altri contaminanti sconosciuti. I protocolli descritti qui di mira questi problemi e con successo il recupero del DNA virale e microbico alla contaminazione minima DNA umano. Per completare gli studi metagenomica, un protocollo metatranscriptomics è stato ottimizzato per recuperare sia microbicae mRNA host che contiene relativamente pochi RNA ribosomiale (rRNA) sequenze. Una panoramica delle caratteristiche dei dati viene presentato per servire come riferimento per valutare il successo dei metodi. Altri campioni di espettorato CF sono stati raccolti per (i) valutare la consistenza dei profili microbioma in sette giorni consecutivi in ​​un solo paziente, e (ii) confrontare la coerenza di approccio metagenomica per un sequenziamento basato sui geni 16S RNA ribosomiale. I risultati hanno mostrato che la fluttuazione giornaliera dei profili microbici senza perturbazione antibiotico era minimo ei profili di tassonomia dei comuni batteri CF-associate sono stati molto simili tra le librerie 16S rDNA e metagenomi generati dalla lisi ipotonica (HL) DNA -derived. Tuttavia, le differenze tra i profili tassonomiche 16S rDNA generati dal DNA totale e HL-DNA derivato suggeriscono che lisi ipotonica e le fasi di lavaggio vantaggio non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma anche extracellul microbica-derivatiDNA ar che possono travisare i profili microbici effettivi.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata.

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K Views.  San Diego State University.  Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata. 

Video: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purificazione del DNA plasmidi da colonie batteriche Utilizzando il kit Qiagen Miniprep

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Ricerca

Biologia

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissezione lordo dello Stomaco del Gambero, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Un metodo HPLC lectina per arricchire Peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Purificare l'Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Purificazione del DNA plasmidi da colonie batteriche Utilizzando il kit Qiagen Miniprep

Dissezione lordo dello Stomaco del Gambero, Homarus Americanus

Un metodo HPLC lectina per arricchire Peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine specifico in campioni complessi

Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

High Yield Espressione di proteine ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

Purificare l'Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Purificazione del DNA plasmidi da colonie batteriche Utilizzando il kit Qiagen Miniprep

Dissezione lordo dello Stomaco del Gambero, Homarus Americanus

Un metodo HPLC lectina per arricchire Peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine specifico in campioni complessi

High Yield Espressione di proteine ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione