Name: multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Alemã de Ciência (DFG, Ro2327 / 6-1) para CRR Os autores gostariam de agradecer a S. Durry e C. Rodrigo para assistência técnica especializada, e M. Dubbert (Laboratório de Eletrônica, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia, Alemanha) para obter ajuda na implementação do controlador de célula Pockels eo interruptor HF.

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes. Os autores receberam apoio financeiro permitindo Open Publication Acesso por Rapp optoeletrônicos (Wedel, Alemanha), que produz um instrumento usado no artigo de vídeo. A empresa não foi nem envolvidos nos experimentos, nem na manipulação de dados, nem na escrita manuscrita.

O presente estudo mostra que SBFI é bem adequado para dois fótons de imagem de transientes de cálcio intracelular em pequenos compartimentos celulares. Tem que se ter em mente, porém, que a eficiência quântica de SBFI é bastante baixo em 15 e relativos alterações na concentração de sódio são muito pequenas com atividade fisiológica. Assim, a medição de alta resolução de transientes de Na + em processos distintos é uma tarefa relativamente tedioso, e criação de faixas ou a média de vários ensaios, pode ser necessário para obter sinais satisfatórios. Além disso, a cinética de transientes de sódio são surpreendentemente lenta, tornando obrigatória a gravar por períodos de tempo prolongados. Esta observação corresponde àqueles em estudos anteriores, onde decaimento monoexponencial de transientes de sódio em dendrites neuronais e em astrócitos foi caracterizado por grandes constantes de tempo de decaimento no intervalo de 10 segundos à temperatura ambiente, 1,2,6. Transientes de sódio, portanto, parecem exercer uma vez co muito mais lentourse e muito maiores constantes de tempo de decaimento, em comparação com transientes de cálcio 16. Separe essas desvantagens, a imagiologia de sódio revela-se uma ferramenta valiosa para a investigação das propriedades fisiológicas de subdomínios neuronais. Por exemplo, a imagiologia de sódio pode servir para acompanhar a actividade sináptica excitatória no ou perto de sinapses activas. Porque não é essencialmente sódio tamponada 8,17, transientes sódio induzido da actividade são linearmente relacionado com uma vasta gama de libertação sináptica de glutamato aplicado exogenamente ou glutamato. Eles, portanto, representam indicadores diretos e imparciais sobre a atividade glutamatérgica neuronal. Além disso, os corantes indicadoras de sódio apresentam uma elevada K d &#39;s (da SBFI K d está na gama de 25 a 1 mM). Mesmo com as concentrações relativamente elevadas de corante intracelulares utilizados para atingir o brilho suficiente (geralmente 0,5-1 mM), a alta K d &#39;s significa que os próprios corantes não actuar como tampões para sódio. Por conseguinte, eles não se distorcem o campo de amplitude nem o tempo de transientes de sódio, o que é sempre uma preocupação quando corantes sensíveis ao cálcio são introduzidos nas células 18. Assim, pode-se presumir que os sinais detectados representam uma boa medida das mudanças &quot;reais&quot; em sódio intracelular. Seu curso lento tempo implica, então, que a velocidade de difusão intracelular de sódio nos neurônios é muito menor do que anteriormente se pensava 19. Um requisito essencial para a execução bem sucedida de experimentos que abordam as propriedades excitatórias transmissão e influxo de sódio vias sinápticas em espinhas e dendritos é a indução de uma ativação rápida e altamente localizada de estruturas pós-sinápticos. Isto pode ser obtido por aplicação rápida e local de glutamato ou agonistas de glutamato na vizinhança directa de uma coluna ou um dendrito pelo fotólise de compostos em gaiolas. Flash fotólise faz dama não mecanicamentege o tecido, é livre de artefatos de movimento e está bem estabelecido para a investigação de questões relacionadas (por exemplo, a sinalização local de cálcio). O diâmetro da mancha de 1,5 um foi uncaging no plano xy. Uncaging perto de um sinal de sódio espinhoso dendrito induzida em ambas as espinhas e a dendrite pai. Considerando que os sinais tendem a ser maior nas espinhas mais próximas ao local uncaging, as amplitudes do dendrito pai e espinhas mais longe ainda eram bastante semelhantes aos imediações do local uncaging. Uncaging foi realizada durante 300 mseg, durante o qual as correntes internas aumento na amplitude. Glutamato Uncaged poderia ter difundido no tecido durante o mesmo período de tempo, ativando os receptores de glutamato ionotrópicos e influxo de sódio em regiões dendríticas e espinhas mais longe do local uncaging. Um problema intrínseco que ocorre quando se utiliza um laser de UV para a fotólise de compostos engaiolados administradas através da solução do banho de célulasé &quot;filtragem interior&quot;. Devido à elevada taxa de absorção da gaiola, a luz UV é atenuada fortemente ao longo do caminho do objectivo para o local de estimulação 20,21. Uma maneira possível de evitar isso é a perfusão local com a gaiola que está restrito apenas ao sítio de estimulação, o qual, além disso, diminui a quantidade de composto necessária para enjaulado um mínimo. Em comparação com uncaging UV a laser de varredura-mediada, quase-infra-vermelho de dois fotões uncaging 22 é espacialmente mais precisa, principalmente porque a exactidão da estimulação é aumentada no eixo z. Por outro lado, devido à pequena secção transversal de gaiolas vulgarmente utilizados para os comprimentos de onda mais longos, como empregues com excitação de dois fotões, ou uma elevada concentração do composto em gaiolas ou muito elevada, são necessárias intensidades de luz potencialmente fototóxicos. Além disso, dois fótons uncaging exige um investimento muito maior no equipamento; entre outros, um laser de IR adicional além dos componentes ópticos, é necessário,. Ambos SBFI e MNI-glutamato são excitáveis ​​na faixa de comprimento de onda idênticas. Isto pode levar a uma indesejada interdependência de laser de UV e uncaging SBFI ou laser imagem IR e MNI-glutamato, o que resulta no branqueamento de SBFI pelo flash uncaging e / ou um uncaging contínua de glutamato por o feixe de luz infravermelha. No entanto, como mostrado na Figura 6C, nem um flash UV, por si só, nem a imagem de vários fótons causado tais efeitos recíprocos, nas condições experimentais. Sistemas de flash de UV semelhantes ao descrito aqui são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios e outros podem ser relativamente facilmente incorporado em qualquer microscópio de imagem multi-fotão existente. Ele oferece a vantagem de que o feixe de laser para fotólise pode ser posicionado livremente no campo de visão. Além disso, o sistema permite um reposicionamento rápido e automático do feixe de laser e o volume de libertação, respectivamente, no campo de visão durante uma experiência. Our modificação simplifica e melhora o posicionamento preciso do local uncaging, de modo a que os quadros do software de imagem pode servir para ajustar quadros de imagem e uncaging congruentemente. Tomados em conjunto, de células inteiras de patch-clamp e imagem multi-fotão de sódio em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging luz UV-induzido de glutamato, permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Pode, assim, servem para analisar as propriedades de transmissão sináptica excitatória e de sinais de sódio em neurónios pós-sinápticos no tecido intacto.

As recentes melhorias nas técnicas de microscopia óptica, como a microscopia multi-fotão têm permitido o estudo de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, estas técnicas são agora amplamente utilizados para analisar os sinais elétricos relacionadas com a atividade dos neurônios, bem como sinais concomitantes de cálcio em pequenos compartimentos subcelulares, ou seja, em dendrites finas e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio em dendritos e espinhas, que possuem propriedades que são largamente inexplorado. Tais sinais podem ser analisados ​​por dois fotões imagiologia de sódio intracelular ([Na +] i) que permite a medição em linha de [Na +] i transitórios durante períodos prolongados sem branqueamento significativo corante ou foto-dano 1,2. Para imagiologia de [Na +] i </sub&gt;, apenas alguns corantes indicador químico estão disponíveis, por exemplo, Corona Verde ou Asante Natrium Verde 3,4. A sonda fluorescente mais usada para Na + imagem é isophthalate benzofuran- (SBFI) de ligação de sódio. É uma medida proporcional, corante UV-animado semelhante ao conhecido corante sensível ao cálcio com fura-2, e tem sido empregada para imagiologia convencional de Na +, em muitos tipos de células (por exemplo, 5,6). Existem diferentes possibilidades de excitar o corante e coleta de sua fluorescência. Se a alta resolução temporal (ou seja, uma taxa de quadros alta de imagem) é necessária em combinação com a informação espacial, SBFI pode ser animado com uma lâmpada xenon arco ou um dispositivo de alta potência diodo emissor de luz (LED) e sua emissão detectada com uma carga de alta velocidade dispositivo -coupled (CCD) 7,8. Para resolução espacial máxima profunda no tecido, microscopia de varredura a laser multi-fotão é o método de escolha 9. A relativamente baixa efficie quantumNCY de SBFI exige concentrações relativamente elevadas de corante (0,5-2 mM), e o carregamento directo de forma a membrana impermeável de SBFI através de um microeléctrodo afiada 10 ou remendo pipeta 1. Usando SBFI, trabalho anterior realizado em fatias de tecido agudas do hipocampo de roedores demonstraram transientes de sódio relacionadas com a actividade em dendritos e espinhas de neurônios piramidais CA1 que são causadas principalmente pelo influxo de sódio através ionotrópico receptores NMDA 1,2. Para o estudo das propriedades de tais sinais de sódio locais em mais detalhe, a activação específica de receptores pós-sinápticos, por aplicação de agonistas do receptor é um método bem adequada de escolha. Para imitar a atividade pré-sináptica e liberação do transmissor, a aplicação deve ser relativamente breve e focada para permitir estimulação local. Isto, no entanto, provou ser um grande desafio em tecido intacto. Aplicação de pressão local de agonistas do receptor utilizando uma pipeta de ponta fina permite ap muito focalcação, mas hospeda o risco potencial para a produção de movimento da estrutura de interesse (por exemplo, como um dendrito ou espinhas dendríticas), e, portanto, impede a imagem de alta resolução. A adequação da iontoforese de substâncias neuro-ativa depende de suas propriedades elétricas e altas amplitudes atuais podem produzir artefatos celulares também. Uma maneira de contornar esses obstáculos é o emprego de compostos fotoativados e sua fotólise. Basicamente, dois princípios diferentes são usados ​​para a foto-ativação de substâncias enjaulados: I) Wide-campo do flash fotólise 11 e II) uncaging focal empregando módulos de digitalização em combinação com lasers 12. Enquanto todo o campo de flash fotólise é utilizada para activar grandes regiões de interesse, por exemplo, uma célula inteira, uncaging focal é utilizado para estimular especificamente pequenos compartimentos celulares. No presente estudo, nós demonstramos um procedimento de célula inteira de patch-clamp e multi-pimagiologia de sódio Hoton em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging induzida por luz UV de glutamato, o que permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido.

<table><tbody><tr><td>Borosilicate-glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC compatible camera</td></tr><tr><td>Deconvolution software</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Miniature fiber optic spectrometer</td></tr><tr><td>Filter tubes</td><td>VWR</td><td></td><td>cenrifugal filter, 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>IR beam power controller</td><td>Custom built</td><td></td><td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td></tr><tr><td>IR laser</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION</td></tr><tr><td>IR power monitor</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope/Imaging System</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td></tr><tr><td>ND filter wheel</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Narishige</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic drug ejection system</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Pockels cell</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td></tr><tr><td>Pockels cell driver</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>High voltage differential amplifier</td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-coated BeCu blades</td></tr><tr><td>Shutter controller</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Uncaging software</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UV laser</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td></tr><tr><td>UV laser scanning system</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Galvanometric scanning system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Compound&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/&lt;br /&gt;Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>SBFI K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td></tr><tr><td>NMI-caged-L-Glutamate</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Caged glutamate released upon UV absobtion</td></tr></tbody></table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Microscopia de fluorescência multi-fotão permitiu a análise de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, é amplamente utilizada para estudar sinais de cálcio relacionadas com a actividade em pequenos compartimentos subcelulares, como dendritos e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio pós-sinápticos, as propriedades dos quais são compreendidos apenas marginalmente. Aqui, nós descrevemos um método para a célula inteira patch-clamp combinado e imagem de sódio multi-fotão em micro domínios celulares de neurônios centrais. Além disso, apresentamos um procedimento modificado de ultra-violeta (UV) uncaging -Light-induzida do glutamato, o que permite a ativação confiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Para este fim, as gravações de célula completa foram realizados em cornu Ammonis subdivisão 1 (CA1) neurónios piramidais em fatias de tecido aguda dahipocampo do rato. Os neurônios foram preenchidos com o corante fluorescente SBFI sensível ao sódio através do patch-pipeta, e multi-fotão excitação de SBFI permitiu a visualização dos dendritos e espinhas adjacentes. Para estabelecer uncaging focal induzida por UV, vários parâmetros, incluindo a intensidade da luz, o volume afectada pelo feixe uncaging UV, o posicionamento do feixe, bem como a concentração do composto testado foram engaiolados e optimizado. Nossos resultados mostram que a perfusão local com glutamato enjaulado (MNI-glutamato) e seu resultado UV-uncaging focal em correntes de entrada e transientes de sódio nos dendritos e espinhas. Curso de tempo e de amplitude dos dois sinais de correntes de entrada e de sódio correlacionar com a duração do impulso de uncaging. Além disso, os nossos resultados mostram que os sinais de cálcio intracelular são bloqueados na presença de agentes bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos, demonstrando que são mediados por influxo de sódio que esta via. Em resumo, o método fornece uma ferramenta fiável para oinvestigação dos sinais de sódio intracelular induzida por activação do receptor focal em tecido cerebral intacto.

No presente estudo, nós demonstramos um método de microscopia multi-fotão de dinâmica de sódio celulares com o corante fluorescente SBFI dependente de sódio em neurónios piramidais CA1 do rato aguda fatias de tecido de hipocampo. Além disso, mostramos como combinar esta técnica de imagem com uncaging baseada no escaneamento a laser de compostos neuro-ativo (por exemplo, o glutamato enjaulado) e seu direcionamento preciso para micro-domínios celulares. Carregando os neurónios com SBFI através da pipeta patch-activada a visualização de toda a célula, incluindo dendrites finas e espinhas adjacentes, empregando múltiplos fotões de excitação (Figura 6A, B, D e figura 7A). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 sinais de sódio e correntes sinápticas induzidas por fotólise de glutamato enjaulado. (A) Maximimagem de projeção al de um neurônio CA1 piramidal carregado com SBFI via pipeta de patch (PP). A caixa indica a área mostrada ampliada em B. LP indica a posição e orientação da pipeta para a perfusão local de glutamato enjaulado. (B) de projecção de alta potência máxima de uma pilha de secções ópticas de uma dendrite com espinhas dendriticas adjacentes. As pilhas de secções ópticas sofreu z-alinhamento e deconvolução. A cruz vermelha indica a região alvo do feixe uncaging. A linha pontilhada laranja delineia a região de interesse a partir do qual a emissão de fluorescência foi registada. A caixa indica a área mostrada ampliada em D. (C) Esquerda: sinal de sódio (linha superior) e somático interior atual (linha inferior) induzida por fotólise de glutamato enjaulado (indicado pelo flash amarelo). A linha vermelha representa um ajuste dos dados experimentais. A área cinzenta representa o período em que o flash uncaging (300ms) obstruiu a imagem de fluorescência SBFI Direito.: Sem pré-perfusão com glutamato enjaulado, o mesmo-flash UV nem provocou uma mudança na emissão SBFI, nem uma corrente para dentro (D) À esquerda:. Imagem de alta potência do dendrito e adjacente espinhas, conforme esboçado na B. Ao lado, a mesma imagem com valores de cinza invertidos. As linhas tracejadas indicam as regiões de interesse, em que a emissão de fluorescência foi registado. A cruz vermelha indica a localização do feixe uncaging direita:. Transientes sódio induzida por fotólise-lampejo de UV de glutamato enjaulado. Traço azul: sinais de sódio no dendrito; traço vermelho: resposta média de três espinhas adjacentes ao local uncaging; traço verde: resposta média de três espinhas distantes. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a> Após a perfusão local com Cagedglutamato, a aplicação de um flash de UV perto de uma dendrite resultou numa diminuição transitória na emissão de fluorescência de SBFI, reflectindo um aumento na concentração de cálcio intracelular (Figura 6C, D e Figura 7B). Ao mesmo tempo, uma corrente de influxo foi registada a soma (Figura 6C e a Figura 7B). Aumentando a duração do flash de UV resultou no aumento da amplitude de ambos os provocada correntes para dentro e os sinais de sódio (dados não mostrados), indicando que o sistema foi bem dentro da sua gama dinâmica e que as respostas celulares nem uncaging nem estavam saturados. Aplicação de um aparelho de lampejo de UV de duração idêntica ou mais fatias para que não havia sido pré-perfusão com glutamato enjaulado, nunca provocou alterações na fluorescência SBFI nem correntes de entrada, indicando que estes sinais são devido à uncaging de glutamato (Figura 6C). Além disso, estes resultados mostram que nenhum dos componentes interdependência imaging- e observa-se u uncagingnder nossas condições experimentais. Sinais de sódio também pode ser detectado nas espinhas dendríticas (Figura 6D). Enquanto nós não tentou realizar a estimulação de uma única coluna apenas com glutamato uncaging, amplitudes de pico tende a ser um pouco maior em lombadas próximas ao local uncaging, enquanto que as espinhas mais longe mostrou alterações de fluorescência praticamente idênticas às do dendrito pai (Figura 6D). Por fim, estudou-se o caminho para o influxo de sódio em dendritos e espinhas em resposta a uncaging de glutamato. Para este fim, utilizou-CNQX e APV, que são bloqueadores selectivos para os sódio-permeável, os receptores do glutamato ionotrópicos do AMPA- e subtipo NMDA-, respectivamente. Os nossos resultados mostram que os sinais de sódio intracelular induzida pelo glutamato e as correntes somáticas eliciados foram omitidos na presença destes bloqueadores (Figura 7B). Após a lavagem para fora dos bloqueadores, os sinais são recuperados. Isso demonstra that uncaging de glutamato ativa os receptores de glutamato ionotrópicos em neurônios piramidais CA1, que medeiam o influxo de sódio em dendritos e espinhas, resultando em transientes de cálcio intracelular ea correntes de entrada. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7 Perfil farmacológico de sinais de sódio evocadas e correntes de entrada. (A) cheio de SBFI CA1 piramidal neurônio com o patch pipeta (PP) ligado à soma (B) À esquerda:. Transitória de sódio e atual somática induzida por foto-ativação de glutamato enjaulado em um dendrito e espinhos anexados Center:. Perfusão com o Os bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos CNQX e APV inibe tanto o sinal de sódio e a corrente de influxo induzido por uncaging direita:. Ao wash-out dos bloqueadores, os sinais são restaurados. Os represen linha vermelhats um ajuste dos dados experimentais. A área cinza representa o período em que o flash uncaging (300 ms) obstruiu a imagem de SBFI fluorescência. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K visualizações.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato. 

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Neurociência

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...