Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation IOS e IOS 0844948 1024811

Mantenha toda a água do mar ou água do mar artificial (SW), os animais adultos, e as culturas a 15 ° C, tanto quanto é prático. Assegurar ovos e zigotos são mantidos imersos em SW. Sais do mar preparados comercialmente reconstituídas com água destilada ou de osmose serve também como uma fonte de SW. Verifique salinidade utilizando um densímetro e ajustar sais ou água para atingir níveis ótimos. Manter os níveis de gravidade específica entre 1,020-1,025. Mantenha todos os vidros e de plástico separado de todos os outros materiais de laboratório para evitar a contaminação com produtos químicos. Limpo embrião grau laboratorial, por lavagem com água desionizada ou saturando ocasional em hipoclorito de sódio diluído seguido por lavagem várias vezes em água. 1 Obtenção e amadurecimento gâmetas provenientes Patiria miniata Adultos <ol><li> Selecione um animal para extirpar gônadas. Determinar o sexo após a excisão, procurando a presença de ovários ou testículos porque P. miniata não estão sexually dimórfico. </li><li> Cortar uma pequena abertura, não maior do que 1 cm, ao longo do lado de um braço de estrela do mar com uma lâmina de bisturi (Figura 1A). Usando pequenos fórceps encerrou-Blunt puxar para trás bordas da incisão para acessar o tecido gonadal e puxe o tecido gonadal através da incisão. NOTA: Evitar a puxar para fora o tecido intestinal, que é um tecido cinzento ou castanho solto (Figura 1B). Os ovários são tipicamente laranja, amarelo ou marrom claro (Figura 1C), enquanto que os testículos são brancas ou bege e quando perturbado fará com que a água do mar para se tornar leitosa ou um aspecto turvo (Figura 1D). </li><li> Voltar fêmeas para os aquários. Isolar machos para uma ou duas horas em um recipiente de SW desde o stress da manipulação pode induzir a desova. Animais curar ao longo do local da incisão e continuar a fornecer gametas por vários meses. </li><li> Recolhe testículos para um tubo Eppendorf de 1,5 ml com tão pouco quanto possível SW e armazenar em gelo até à utilização. Guarde todos os testículos não nosed no dia da coleta, a 4 ° C por até uma semana. </li><li> Colete ovários em uma pequena cultura prato de vidro em um vários mililitros de SW. Para libertar os oócitos a partir do tecido do ovário, desmembrar o tecido com dois pares de pinças até não permanecer pedaços grandes. NOTA: O ideal é que a maioria dos oócitos estão completamente desenvolvidos. Esses oócitos são grandes, redondos, e claro amarelo ou marrom claro com uma vesícula germinal distinta no oócito (Figura 2A), em comparação com o subconjunto de oócitos subdesenvolvidos que são menores, marrom, granulado e opaco (Figura 2B). Se for maior que cerca de 25% dos oócitos são da variedade subdesenvolvido, selecione uma mulher diferente para obter oócitos. </li><li> Despeje os oócitos ou tecido remanescente por meio de uma taça de filtro de malha com um tamanho de poro de 200 um e recolher fluir. Isto irá conter todas as variedades de oócitos, mas remover o tecido ovariano. Desalojar ovócitos remanescentes do tecido detectada pelo filtro pulverizando wom SW a partir de uma garrafa de esguicho. Copos de filtro são feitas utilizando um tubo de 50 ml (Figura 3A-A &#39;). </li><li> Verter o fluxo através do passo 1.6 por meio de uma taça de filtro de malha de 100 um. Descarte pequenos oócitos em fluxo através. Oócitos grandes plenamente desenvolvidos que estão prontos para a maturação vai ficar no filtro. Lavar os oócitos em uma limpeza 200 ml. </li><li> Adicionar 95 ml de SW para a proveta de vidro de 200 ml de oócitos. Adicionar 5 ml de 200 uM 1-metiladenina para uma concentração final de 10 uM. </li><li> Transferir os oócitos a uma grande placa de cultura e raso lugar a 15 ° C. Uma grande área de superfície para volume do prato de cultura permite a troca de oxigénio. Os ovócitos não amadurecem ou pode não se desenvolver bem, se eles estão superlotadas durante esta fase de maturação. Quebrar em vários pratos de SW mais 10 mM 1-methlyadenine até que a cultura é inferior a 200 ovócitos / ml. </li><li> Permitir que os ovócitos de amadurecer durante 45-90 minutos, mas não mais como isso vai tornar os oócitos incapazes de ser fertilized. Para determinar se a maturação for concluída, olhar para os oócitos sob um escopo dissecar. Os movimentos das vesículas germinais direção e funde com a membrana da célula durante a maturação. Em seguida, ele se rompe e, portanto, não é mais visível em oócitos maduros (Figura 2C). </li></ol> 2. fertilização dos ovócitos maduros <ol><li> Escolheu um pequeno aglomerado de tecido testicular, aproximadamente do tamanho de ervilha, e pique em um pequeno prato de cultura de vidro com aproximadamente 1 ml de SW. </li><li> Usar uma pipeta de Pasteur, para transferir 2-3 gotas da água do mar leitosa resultante para cerca de 100 ml de oócitos maduros e agita-se a placa de cultura para misturar. Evitar a transferência de peças de tecido testicular. Evite adicionar uma maior quantidade de esperma, pois isso pode resultar em poliespermia e desenvolvimento pobre subseqüente. </li><li> Depois de vários minutos, observar os oócitos sob um escopo de dissecação. Os ovos fertilizados, ou zigotos, tem um envelope de fertilização, que é um globo transparente que sobe fora do cell membrana (Figura 2D). NOTA: Não prossiga com a cultura se menos do que cerca de 90% de ovos de fertilizar uma vez que as taxas de fertilização pobres são uma indicação de uma cultura saudável que também pode não se desenvolver bem. </li><li> Após a fertilização é completa, alterar o SW em zigotos por vazamento através de um filtro de malha de 100 um e de lavagem para uma placa de cultura com SW fresco. É importante remover o excesso de esperma para evitar a fome de oxigénio. Colocar a placa de cultura a 15 ° C durante 15-30 min. </li></ol> 3 De-gelatinizante e Remo ovos fertilizados <ol><li> Preparar pratos de injecção, tendo a tampa a partir de um 60 x 15 mm numa caixa de Petri de poliestireno. <ol><li> Desenhar uma linha caneta marcador permanente na parte de trás do prato, em torno da área que coincide com o campo de visão do microscópio microinjecção. Isto assegura que todos os embriões remavam estão dentro do campo de visão do microscópio. </li><li> Use uma pipeta de Pasteur de vidro para marcar uma linha através do círculo, preferably para um lado do círculo (Figura 3B). Use esta linha depois de quebrar as agulhas de injecção (Passo 4.5). NOTA: Os reagentes comumente usados ​​para aderir embriões de ouriço do mar, por exemplo, sulfato de protamina ou poli-L-lisina, são desnecessários. De-gelatinoso P. zigotos miniata ficar muito bem ao plástico não revestido. Note que eles não aderem bem a recipientes de vidro. </li></ol></li><li> Adicionar cerca de 10 ml de SW para cada prato de modo a que a superfície é coberta, mas não a água em excesso vai salpicar no prato como este pode perturbar embriões remadas. </li><li> Remover o P. casaco geléia zigoto miniata com SW ácido antes de remo. Este casaco de geléia é mais extensa do que a observada para as espécies de ouriços-do-mar modelo. <ol><li> Prepare SW ácido na gama de pH 4,0-4,2. O pH é importante para permitir a remoção eficiente de revestimento geleia permitindo ao mesmo tempo o desenvolvimento normal. </li><li> Adicionar gotas individuais de 1 N (1 M) HCl em SW para um estoque de 1 L de SW. Permitir que cada gota para misturar completamentee monitorar o pH antes de adicionar mais HCl. Observação: Uma de alguns mililitros de HCl resulta no pH apropriado, mas não se adicionar a totalidade do volume de uma só vez. NOTA: Prepare 1 N HCl em hotte com SW e (M 12) HCl 12 N. </li><li> Remover SW em zigotos ao derramá-las para um filtro de malha de 100 um. Enxágüe em um copo de 200 ml na menor quantidade possível de SW (aproximadamente 10 ml). Encha o copo até 150 ml com SW ácido (pH 4,0) e permitir que os zigotos para sentar-se no SW ácido por 3 min. </li></ol></li><li> Tira casaco geléia dos zigotos, derramando-lhes frente e para trás entre dois copos de 200 ml, a cada vez que passa os zigotos através de um filtro de malha de 200 m. Despeje os zigotos através do filtro em torno 5-10x durante cerca de uma janela de tempo de 2 min. </li><li> Remover SW ácido vertendo os zigotos para um filtro de malha de 100 um. Lave os zigotos em um pequeno prato de cultura de vidro com SW. Zigotos De-gomas podem ficar com pratos de plástico. Embriões linha imediatamente; eles começam a produzir mais jcasaco Elly que leva a fraca adesão aos pratos de plástico ao longo do tempo. </li><li> Usar uma pipeta (Figura 3C-C &#39;) para pegar zigotos da cultura prato de vidro e coloque-os em linhas retas sobre os pratos de injeção. Derreter o centro do lado fino de uma pipeta de Pasteur, sobre uma chama até que o vidro é mole. Rapidamente puxar as extremidades do vidro para além de produzir um estiramento muito fino do copo. Uma vez que o vidro é legal, quebre a pequena extremidade da pipeta Pasteur (para obter informações adicionais sobre a preparação de uma pipeta de boca ver Wessel et al., 2004 17 ou doce et al., 2004 18). <ol><li> Adicione uma pipeta de remo de tal modo que o diâmetro é apenas maior do que o diâmetro dos embriões de modo a que apenas um único zigoto vai entrar e sair da pipeta de cada vez. Isto vai permitir que uma única fileira de modo a formar. Pipetas de menor diâmetro podem retirar o envelope de fertilização e perturbar os zigotos como P. zigotos miniata não tem uma membrana hialina umand são bastante suaves. </li><li> Se os zigotos não ficar com o prato de plástico, mantê-los por um tempo adicional na SW ácido (até vários minutos). Alternativamente, uma pipeta de menor diâmetro pode ajudar na remoção de revestimento de gelatina para permitir que os zigotos para furar de forma mais eficaz. </li><li> Os zigotos são ligeiramente positivamente flutuante e tendem a flutuar ou passe um pouco acima do fundo do prato. Neste caso, a posição da pipeta de modo a que a remo dos zigotos são suavemente pressionadas contra a superfície do prato de medida que saem da pipeta (Figura 3D). NOTA:. É permitido ajustar muitas linhas sobre esses pratos P. membranas embrionárias miniata não se tornar mais difícil de penetrar ao longo do tempo e, portanto, pode-se injetar centenas de zigotos em um único prato. </li></ol></li></ol> 4 Injeção de zigotos <ol><li> Preparar soluções injectáveis ​​com concentrações adequadas de oligonucleotídeos antisense morf (MASO), mRNA, ou DNAs em uma concentração finalentration de KCl 200 mM. 400-800 uM MASO e 2,5 ng / mL de ADN tendem a produzir fenótipos morphant enquanto minimizando a toxicidade. A concentração final no ovo será 1/125 º a concentração de partida 14. Para soluções de injeção contendo MASOS, o calor a 65 ° C por 5 minutos imediatamente antes da utilização e guarde em temperatura ambiente. <ol><li> Para facilitar a triagem de embriões injectados, adicionar rodamina dextrano traçador à solução de injecção para se obter uma concentração de 0,1%. </li></ol></li><li> Preparar as agulhas de injecção puxando tubo capilar de vidro (1,0 mm de diâmetro externo x 0,75 mm ID, 100 mm de comprimento) de uma agulha que puxa instrumento seguindo as instruções do fabricante. Agulhas adequados para a injeção em ouriços do mar também funcionam bem para as estrelas do mar, portanto, use parâmetros similares 19. </li><li> Carregar cerca de 2 ml de solução de injecção de uma agulha de injecção, utilizando uma ponta de pipeta microloader. </li><li> Inserir a extremidade cega da agulha no manipulator. Definir Picospritzer a 100 mseg de pulso e uma pressão de ar de 40 psi. </li><li> Coloque um prato de embriões remavam no palco de microscópio e têm todos os embriões no campo de visão. Orientar o prato de modo a que a linha marcada está no lado mais próximo da agulha. Posicionar a agulha com um ângulo de aproximadamente 60 ° de modo que a ponta está perto do centro da linha e um pouco acima da superfície da água. </li><li> Concentre-se na linha demarcada e abaixe a agulha até que a ponta entra em foco. Abaixe a ponta um pouco mais e quebrá-lo aberto, executando-o suavemente para dentro dos cumes da linha demarcada. Levante a ponta para fora da superfície do prato e coloque-o no topo da primeira linha de zigotos e focar os zigotos. </li><li> Diminuir a ponta de modo que ela vai espetar o centro do zigoto vindo em torno de um ângulo de 60 °. A agulha penetra facilmente P. zigotos miniata. Passo sobre o pedal (ou outros meios de forçar o material a partir da agulha de injecção) para introduzir um bolus de injecção solução para o embrião. </li><li> Apontar para um bolus, que é de 20-30% do diâmetro do embrião, ou entre 25 e 80 pl. Se o bolo for maior ou menor do que esta, ajustar a duração da injecção no Picospritzer e injectar o embrião seguinte. Continue a ajustar a duração necessária para obter o tamanho desejado bolus. Comece a 100 ms de duração. Re-quebrar a agulha se maior do que cerca de 200 milissegundos é necessário introduzir o bolus apropriado. Descarte a agulha e preparar um novo se menos de 15-20 ms é necessário para obter esse tamanho bolus como o tamanho da agulha é muito grande e pode perturbar o desenvolvimento normal. </li><li> Prossiga para injetar os zigotos restantes no prato de injeção. Os embriões podem ser facilmente injetado até o início da clivagem e em blastômeros individuais após a primeira clivagem. Periodicamente levantar a agulha acima da superfície da água para remover os zigotos que aderem sobre a agulha. Se necessário re-quebrar a ponta da agulha, ou carregar uma nova agulha, se ocorre um bloqueio. </li></ol><ol><li> Permitir que os embriões para desenvolver a 15 ° C no sudoeste. Manter a elevada área superficial para volume das culturas para permitir a troca de oxigénio. Certifique-se de embriões não estão lotados; manter culturas a ou abaixo de 200 embriões / ml. Dependendo do estágio desejado de embrião, pretende coletar embriões injetados em torno de 20-24 horas pós-fertilização. NOTA: Este é frequentemente um momento ideal para classificar e coletar e porque os embriões em desenvolvimento normalmente são facilmente distinguidos morfologicamente, mas ainda não estão nadando. </li><li> Se os embriões têm eclodido, sal delicadamente choque para evitar nadar. Adicionar 200 ul de NaCl 5 M e 10 ml de SW no prato de injecção enquanto agita suavemente a SW. Depois de alguns minutos, os embriões vai cair para o fundo do prato. Colete estes e movê-los para SW salinidade normal. </li><li> Recolhe embriões injectados sob uma fonte de luz fluorescente adequado compatível com o marcador utilizado no injectiem solução. Se não foi utilizado nenhum marcador, classificar embriões para selecionar para a morfologia normal. </li><li> Usando uma pipeta de boca, desenhe fluorescentes embriões com uma quantidade mínima de SW e explodi-los em uma pequena placa de cultura cheio de SW. Pipetas boca Ideal tem uma abertura grande o suficiente para os embriões de ser puxado para dentro e para fora sem danificá-los, mas não tão grande que os embriões indesejados e SW estranhos também são puxados para cima. </li><li> Depois de todos os embriões desejados foram recolhidos para o novo prato, observar os embriões sob luz fluorescente e remover todos os embriões un injetado ou embriões pouco desenvolvidos. </li><li> Cultura classificadas embriões para estágios desejados em uma incubadora e prosseguir com imagens ou outros protocolos desejados. </li></ol>

<ol>
	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados pelos autores.

Existem dois passos críticos que são difíceis para os usuários novatos desta técnica, mas são essenciais para a criação de embriões com sucesso morphant. A primeira é selecionar ovócitos saudáveis ​​que vencem e fertilizar adequadamente. A percentagem de desenvolvimento normal em cultura depende da época do ano, a saúde do animal, e o número de vezes que os oócitos foram colhidas a partir de um único indivíduo. Oócitos tendem a ser de melhor qualidade a partir de abril a outubro. É importante olh...

A estrela de mar, Patiria miniata, (vulgarmente conhecida como a estrela bat) está emergindo como um sistema modelo interessante e versátil para uma variedade de celular 1 a 3, de desenvolvimento 4,5, evolutiva 6 a 8, e estudos ecológicos 9 a 11. Adulto P. miniata são distribuídos ao longo da costa do Pacífico a partir de Sitka, no Alasca a Baja, Califórnia 12 e são facilmente mantidos em aquários marinhos. Os oócitos são obtidos durante todo o ano e cada fêmea pode lançar dezenas de milhares de ovos. Os oócitos são facilmente maturados e fertilizados externamente 13. Os embriões resultantes são transparentes permitindo a fácil observação; elas se desenvolvem de forma síncrona, e requerem apenas água do mar para o desenvolvimento. Montagem do genoma inteiro e vários transcriptomas também estão disponíveis para P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Essas vantagens tornam ideais para uma série de pesquisase fins de ensino. Nos últimos anos, P. miniata tornou-se um sistema modelo para rede de regulação genética do desenvolvimento analisa 14 a 16. O objetivo desses estudos é identificar todo o elogio de genes regulatórios e determinar a rede de suas interações. Grande parte deste trabalho envolve a expressão do gene perturbadora através da introdução de oligonucleotídeos antisense ou in vitro sintetizado mRNAs. Além disso, análises de regulação em cis são utilizadas para caracterizar a função de DNA regulador 15. Estas análises requerem introdução de reagentes de perturbação e / ou repórter DNA constrói em embriões. Além disso, para caracterizar os efeitos a jusante dessas perturbações, deve-se testar muitos embriões para alterações na expressão de genes de alvos potenciais. Técnicas de microinjeção de muitas centenas de zigotos são fundamentais para este trabalho. Equinodermes, incluindo P. miniata </em&gt;, exigem muitos meses para atingir a maturidade sexual. Devido a isto, não é geralmente prático para desenvolver e manter linhas transgénicas destes animais de experimentação. Portanto, a criação de adultos transgênicos não pode de forma eficiente criar embriões modificados. Em vez disso, perturbação deve ocorrer de novo através de microinjecção. Microinjecção oferece uma oportunidade para modificar os embriões com os reagentes que não são de células-permeável. O protocolo seguinte descreve um método para introduzir ADN, ARNm, marcadores de células, e os oligonucleótidos anti-sentido morfolino em centenas de ovos fertilizados num 2-3 hr sessão através de microinjecção. Isto produz material suficiente para uma variedade de experiências, incluindo a jusante, mas não se limitando a, qPCR, hibridação in situ, o RNA-Seq, e transferência de western.

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenine</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>For pulling microinjection needles</td></tr><tr><td>Model P-97 Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Also available in many pet stores</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Equinodermos têm sido um sistema modelo favorito para estudos de reprodução e desenvolvimento, e, mais recentemente, para o estudo da regulação de genes e evolução dos processos de desenvolvimento. A estrela de mar, Patiria miniata, está ganhando prevalência como um sistema modelo para estes tipos de estudos que foram anteriormente realizadas quase que exclusivamente nos ouriços do mar, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus. Uma vantagem destes sistemas modelo é a facilidade de produção de embriões modificados em que um gene particular é para cima ou reprimidos, rotular um grupo de células, ou a introdução de um gene repórter. Um método de microinjecção único é capaz de criar uma grande variedade de tais embriões modificados. Aqui, apresentamos um método para a obtenção de gametas a partir de P. miniata, produzindo zigotos, e introdução de reagentes perturbadores via microinjeção. Embriões morphant saudáveis ​​são posteriormente isolado para estudos quantitativos e qualitativos da gefunção ne. A disponibilidade de dados do genoma e transcriptoma para este organismo aumentou os tipos de estudos que são realizados e da facilidade de executá-los.

O objetivo deste protocolo é a introdução de reagentes em embriões. Demonstramos a eficácia do protocolo através da injeção de uma construção repórter DNA que dirige a expressão da proteína verde fluorescente (GFP). Embriões injectados expressar a GFP em manchas clonais (Figura 4A-B), tal como o ADN incorpora durante a clivagem inicial. Muitos reagentes que são desejáveis ​​para introduzir em embriões são tóxicos em quantidades elevadas e lotes subóptimas de embriões. Manifestos...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie.

Um Método para microinjeção de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K visualizações.  Carnegie Mellon University.  Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie. 

Vídeo: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genética

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biologia do Desenvolvimento

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Técnicas de Microinjeção de Zebrafish

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Um Método para microinjeção de

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo