Name: production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters at JoVE.com

This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

NOTA: Os seguintes procedimentos estão em conformidade com as directrizes aprovadas pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal. Todos os esforços são para minimizar a dor eo sofrimento dos animais durante os procedimentos. 1. Revestimento de Filtros Nota: Quando as inserções de filtro de cultura são colocadas em poços de placas de poços múltiplos, dois compartimentos são definidos: o compartimento de cima é a região superior da inserção e do compartimento inferior é o que está abaixo do inserto Figura 1A.ab. Os explantes são semeados na parte superior do compartimento onde se fixam para o lado de cima do filtro; muitos axónios crescer através do filtro e prolongar sobre o lado inferior do filtro, dentro do compartimento inferior Figura 1A.c. Os volumes de trabalho padrão (ou seja, para a aplicação de solução de revestimento, lavagens, meios de cultura, etc) são 2 ml para o compartimento inferior e 1 ml para o compartimento superior e vão ser referidos no protocolo como &quot;; Volumes normais &quot;. Adicionar as soluções de partida, com o compartimento de fundo, colocando a ponta da pipeta no espaço entre o inserto e o lado do poço. Além disso, a inserção de inclinar para um lado, enquanto a distribuição da solução para evitar que as bolhas de ser preso na parte inferior do filtro. <ol><li> Inicie o revestimento dos filtros no dia antes do plaqueamento. De acordo com o tecido de cultura esterilizado capa, colocar 24 inserções de filtro mm numa placa de 6 alvéolos de recepção. Incubar inserções com poli-D-lisina em água (1 mg / ml) durante 1 hora à temperatura ambiente usando volumes padrão: 2 ml no compartimento inferior e um ml do topo. </li><li> Aspirar poli-D-lisina e lavar uma vez com água. Aspirar água, feche a tampa e deixe as placas para secar no capô O / N. Durante a aspiração de líquidos, certifique-se de remover um remanescente de líquido que fica preso diretamente sob o filtro. </li><li> Na manhã seguinte, diluir em água laminina (10 ug / ml), misturar e quente a 37 ° C. Incubar inserções com laminina 1 hr no cell incubadora a 37 ° C, utilizando-se volumes padrão. </li><li> Laminina aspirado e adicionam colagénio em água (0,1 mg / ml) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Neste caso utilizam 2 ml para o compartimento inferior e 2 ml para o compartimento superior. </li><li> Colagénio Aspirar e lavar uma vez com água estéril. Os filtros já estão prontos para receber meios de cultura e explantes DRG, conforme descrito no passo 3. </li></ol> 2. Dissecação Embryonic gânglio de raiz dorsal (DRG) explantes <ol><li> Anestesiar um rato fêmea grávida de 13 dias por uma injeção IP de Avertin (250 mg / kg). Espere 10-15 minutos e verifique se há falta de reflexos de retirada da córnea e pedais. Uma vez que os reflexos estão ausentes, realizar deslocamento cervical. </li><li> Desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos e abdômen feminino com etanol 70%. Permitir instrumentos para secar. Mantenha a pele do abdómen e cortar através das camadas da pele e músculo para expor a cavidade abdominal. </li><li> Remover o útero por descolamento do colo do útero e ovários. Numa Sterile capô, retire os embriões do útero com uma tesoura e coletá-los em uma placa de Petri cheia de mídia L15 gelada. Mantenha no gelo. NOTA: Consulte relatórios técnicos anteriores para obter mais detalhes sobre como obter embriões de 13 dias de gestação 17,18. </li><li> Sob o microscópio, estava o embrião de um lado e usar uma tesoura pequena mola para remover a cabeça. Faça uma incisão ao longo das laterais para descartar o peito, barriga, pernas e cauda. Mantenha as costas contendo a coluna vertebral, deitados lado ventral para cima e remova todos os órgãos viscerais. </li><li> Com uma tesoura pequena mola, expor toda a medula espinal por corte da coluna vertebral a partir do seu lado ventral na linha média. Segurar a carcaça para baixo com um par de pinças (# 3) e com um segundo par de segurar a medula espinal por seu aspecto mais rostral. </li><li> Lenta e delicadamente puxe o cabo longe da cavidade vertebral e beliscar fora DRGs da medula espinhal usando fórceps ultra-finas (# 5). Grupo dos DRGs que devem ser recolhidaso fundo do prato. </li><li> Colete DRGs agrupados por aspiração com uma pipeta de 200 mL que foi cortado para ampliar a sua abertura. Coloque as GDH num tubo e deixar em gelo até a recolha de DRG está terminado. NOTA: Branco dicas / transparentes são os preferidos porque DRGs não aderem às paredes desta ponta (em comparação com pontas amarelas padrão). Dicas Flushing com a mídia antes do uso impede mais DRGs de degola para suas paredes. </li></ol> 3. Sementeira e Manutenção de gânglio de raiz dorsal explantes em Filtros <ol><li> Adicionar mídia DRG completa a 37 ° C para as pastilhas revestidas utilizando volumes padrão. Suplemento da mídia compartimento inferior com 15 ng / ml de NGF, enquanto se mantém a parte superior do compartimento de NGF livre. NOTA: Apesar de NGF difunde de forma eficiente através do filtro e sua concentração equilibra dentro de horas, temos observado que a aplicação de NGF ao compartimento inferior diretamente antes da semeadura aumenta significativamente o rendimento axonal no bottom superfície do filtro. </li><li> Transferir os DRGs do tubo para os filtros, utilizando uma pipeta de 1000 ul com uma ponta cortada para aumentar a sua abertura. </li><li> Desenhe mídia na ponta 2-3x antes de coletar os DRGs. Isto evita que fiquem coladas ao lado de dentro da ponta. A mesma ponta pode ser re-utilizado para todos os poços. O uso de dicas uncolored (versus pontas azuis padrão) reduz DRG degola para a superfície da ponta. </li><li> Para transferir DRGs, defina a pipeta de 800 mL. Aspirar cerca de 200 mL de mídia a partir do lado superior do filtro, em seguida, ir para o tubo contendo DRG e pipetar um volume pequeno para cima e para baixo - para voltar a suspender DRGs que se afundaram para o fundo. Aspirar todo o volume e GDH submergindo a ponta da pipeta no meio do inserto. </li><li> Uma vez que todas as inserções são carregados, feche a tampa e agite a placa placa de 10x, tocando-o com cuidado no banco capô entre cada redemoinho. Estes movimentos aumentar o rendimento axonal, ajudando explantes DRG pia eanexar ao filtro. Isto também ajuda a distribuir uniformemente explantes de modo que a partir de axônios diferentes explantes não se sobrepõem. NOTA: O procedimento de semeadura explante descrito nas etapas anteriores, aumenta significativamente a taxa global de fixação explante para o substrato (até 75%). Mais significativamente, o processo de pipetagem prontamente impede explantes de flutuar sobre a superfície dos meios de comunicação em vez de afundar para o fundo do inserto. </li><li> Para as análises bioquímicas, DRGs sementes de um embrião (cerca de 30) por filtro. Para as análises morfológicas, use metade ou um terço dos DRGs de um embrião (10-15). Esta decisão deve ser tomada antes de coletar os DRGs em tubos, de modo que todos os DRGs de um tubo são semeadas em um único poço (se é 30, 15 ou 10 DRGs). </li><li> Manter as culturas numa incubadora celular a 37 ° C, alterando mídia a cada 2-3 dias. Para mudar de suporte, aspirar o compartimento de topo em primeiro lugar, seguido do compartimento inferior. Adicionar mídia frescas em volume padrãos a partir do compartimento inferior. NOTA: Para evitar que células / axônios de secagem, não mudam de mídia em mais de três inserções ao mesmo tempo. DRGs cultivadas em filtros na presença de NGF vai estender axônios longos, atingindo até 2 mm ao fim de 2 dias em cultura. </li></ol> 4. Fator Trófico Tratamento Retirada Retirada NGF induz degeneração axonal com a fragmentação axonal (determinado pelo contraste de fase e β-III-tubulina SE), que aparece pela primeira vez em torno de 12 horas após a retirada. Fragmentação completa é alcançada em 36 horas. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental. <ol><li> Após a fase de extensão axonal de 2 dias, a partir de meios de mudar os compartimentos superior e inferior de meios de comunicação, que carece de NGF e que contém os anticorpos anti-NGF (1 ug / ml) para sequestrar qualquer remanescente (ou produzida endogenamente) NGF. </li><li> E volta para as placas da incubadora celular (37 ° C) para permitirNGF degeneração induzida por retirada de proceder para a quantidade de tempo desejada. </li><li> Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7). </li></ol> 5. Axonal transecção para induzir a degeneração walleriana Este procedimento deixa os axónios no lado inferior do filtro separado do seu corpo da célula, mas de outra forma intacto. Posteriormente, esses axônios iniciar rapidamente a degeneração Walleriana. Fragmentação axonal (evidenciado pelo contraste de fase ou β-III-tubulina IF) aparece pela primeira vez por 3 horas após a transecção; por 9 horas, os axônios são completamente fragmentados e são separadas do filtro. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental. <ol><li> Raspe o lado superior do filtro, contendo explantes DRG cultivados, com um raspador de células. Assegurar a remoção completa do material de topo por raspador movendo-se em X, Y e circularindicações. </li><li> Descartar o material da parte superior do compartimento contendo os explantes flutuantes que foram raspados do filtro e substitua com 1 ml de pré-aquecido, meios DRG completo contendo NGF (10 ng / ml). </li><li> Retornar placa para a célula incubadora (37 ° C) para permitir que a degeneração waleriana prosseguir durante o período de tempo escolhido pelo utilizador final. </li><li> Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7). </li></ol> 6. Extração de proteínas das amostras axonais <ol><li> Preencha tubos de coleta (1,5 ml) com 75 mL de tampão de amostra Laemmli. Manter tubos em gelo enquanto colhendo os axônios de todo o conjunto de filtros. </li><li> Lavar o filtro com explantes DRG em PBS e raspar o lado de topo do filtro. Remova a inserção da placa, limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta e aspirar qualquer PBS extra dos lados superior e inferior. </li><li> Coloque inserção de cabeçapara baixo no banco e cortar o filtro da inserção utilizando um bisturi afiada. Mantenha o filtro com uma pinça, de baixo para cima. Fazer um corte a partir da circunferência para o centro do filtro, com uma tesoura. </li><li> Local filtro no topo do tubo de recolha, e com uma pinça, prima do centro do filtro para baixo do tubo. Enquanto isso, um funil devem formar. Empurrar o filtro em forma de funil para o fundo do tubo de maneira que ele é submerso no tampão de amostra Laemmli. </li><li> Extração de proteína completa, fervendo os tubos para 4 min. Retirar o filtro, utilizando um fórceps para colocá-la de cabeça para baixo na parte superior do tubo e realizar uma breve centrifugação (2000 xg durante 15 seg). Descarte os filtros secos. </li><li> Resolver 10 ul da preparação de proteína axonal num SDS-PAGE seguido por Western blot para detectar as proteínas de interesse. NOTA: Como referência, uma preparação axonal de 20 explantes cultivados durante 2 dias e lisadas em 100 ul de tampão de lise RIPA terá uma concentração de proteína de 4-6ug / ul. </li></ol> 7. Exame de imunofluorescência de axônios em Filtros Os passos seguintes descrevem as manipulações gerais para executar se a coloração de elementos filtrantes, exemplificadas pela detecção de β-III-tubulina. Fixação, tempos de incubação, concentrações e outros elementos devem ser otimizados para outros pares de antígeno-anticorpo. <ol><li> Utilize usados ​​anteriormente placas de 6 poços, cuidadosamente limpos, para as seguintes lavagens e incubações das inserções. </li><li> Lava-se rapidamente insertos em PBS. Corrigi-los em recém-preparada de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente no agitador. </li><li> Após a fixação, raspar e limpar o lado de topo do inserto de recolher os axónios que cresceram exclusivamente sobre a superfície inferior do filtro. Prossiga com incubações padrão para IF. </li><li> Incubar inserções em solução de bloqueio (TBS, 0,05% de Tween 20, 5% de leite desnatado), usando volumes padrão, durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Transferência de inserções para anticorpo primário diluído em tampão (anti-β-III-tubulina, 1:5000) de bloqueio, utilizando volumes padrão. Incubar S / N (~ 18 horas) a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Lavar o primeiro anticorpo duas vezes em PBS (2 x 10 min à temperatura ambiente). </li><li> Transferência insere a anticorpos secundários fluorescentes conjugados diluídos em tampão de bloqueio (cabra anti-ratinho, 1:2000), usando volumes padrão. Incubar coberto da luz durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Lavar 3x anticorpo secundário em PBS (3 x 10 min à temperatura ambiente). </li><li> Depois de IF é completa, tome inserir fora, despeje longe PBS a partir da última lavagem e limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta. Aspirar todo o líquido a partir dos lados superior e inferior. </li><li> Local inserir de cabeça para baixo no banco, e cortar o filtro de inserção com um bisturi afiada. </li><li> Mantenha o filtro com uma pinça, desvantagem, e colocar sobre lâmina de microscopia. Overlay com uma lamela e mou compatível fluorescentemídia NTING. Vamos plana e seca no quarto frio, coberto de luz. Examinar e capturar imagens usando um microscópio fluorescente. NOTA: Quando armazenado a 4 ° C e protegida da luz, estas preparações podem ser mantidas durante semanas, com uma perda mínima de fluorescência. </li><li> OPCIONAL: Como alternativa, se pode ser realizada em filtros que foram removidas a partir da inserção. Para fazer isso, raspar e limpar o lado de cima dos filtros directamente após a fixação. <ol><li> Tome filtros fora das pastilhas com um bisturi afiado filtros e colocar axónios-se na parte inferior de uma placa de seis poços. </li><li> Em seguida, execute incubações para IF como indicado na 7,4-7,8 e 7.11. A vantagem desta alternativa é que poupa reagentes, uma vez que, por exemplo, os volumes de incubação pode ir até 500 mL (em comparação com os 3 ml utilizadas quando os filtros são directamente corados sobre as inserções como mostrado na 7,1-7,11). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).</li><li>Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+initial+segment+and+the+maintenance+of+neuronal+polarity.">The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).</li><li>Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+as+a+therapeutic+target+in+the+CNS.">Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS.</a> Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).</li><li>Torre, E. R., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+local+protein+synthesis+within+dendrites+using+a+new+cell+culture+system+that+permits+the+isolation+of+living+axons+and+dendrites+from+their+cell+bodies.">Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies.</a> J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).</li><li>Zheng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+role+for+intra-axonal+protein+synthesis+during+axonal+regeneration+from+adult+sensory+neurons.">A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).</li><li>Willis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transport+and+local+translation+of+cytoskeletal,+injury-response,+and+neurodegeneration+protein+mRNAs+in+axons.">Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons.</a> J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).</li><li>Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+process-localized+mRNAs+from+cultured+rodent+hippocampal+neurons.">Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).</li><li>Schoenmann, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+is+regulated+by+the+apoptotic+machinery+or+a+NAD+-sensitive+pathway+in+insects+and+mammals.">Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals.</a> J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).</li><li>Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIAP+regulates+caspase+activity+in+degenerating+axons.">XIAP regulates caspase activity in degenerating axons.</a> Cell Rep. 4, 751-763 (2013).</li><li>Ure, D. R., Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures.">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Minis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcriptomics-Dissection+of+the+mRNA+composition+in+the+axonal+compartment+of+sensory+neurons.">Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons.</a> Dev. Neurobiol. , (2013).</li><li>Niekerk, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+in+axons+triggers+retrograde+transport+of+the+RNA-binding+protein+La.">Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+roles+in+neuronal+development+and+function.">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Plating,+and+Maintenance+of+Dorsal+Root+Ganglion+Neurons+for+Monoculture+and+for+Coculture+with+Dorsal+Horn+Neurons.">Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Leach, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+primary+motor+and+sensory+neurons+in+defined+media+on+electrospun+poly-L-lactide+nanofiber+scaffolds.">The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthetic+pathways+delays+axonal+degeneration+after+axotomy.">Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy.</a> J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Parâmetros importantes a ter em conta aquando da adaptação desta técnica incluem a população neuronal que vai ser estudado, o substrato, o tamanho dos poros do filtro e área de superfície. Todos estes parâmetros terá impacto sobre a especificidade, qualidade e quantidade da preparação neurite obtido e deve ser analisada com cuidado pelo usuário final. Nos exemplos apresentados neste protocolo, o uso de neurônios DRG tem a vantagem de estender apenas axônios, dando assim um puro preparação axonal (espec?...

O compartimento axonal de neurônios mostra um elevado grau de independência funcional do compartimento do somato-dendrítica. Em neurônios de projeção, os axônios conter a maior parte do 1,2 proteína neuronal. O estudo da fisiologia e fisiopatologia dos axônios ganhou força na comunidade da neurociência porque estudos recentes têm mostrado que a disfunção axonal no início parece ser uma característica comum de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos 3. Parece provável que uma melhor compreensão dos mecanismos axonal exclusiva em condições normais e patológicas vai lançar luz sobre os eventos iniciais que levam a disfunção. O presente protocolo descreve como utilizar inserções de cultura tendo uma membrana porosa (filtro) para obter grandes quantidades de material axonal puro que é adequado para análises bioquímicas e imunocitoquímica. O uso de filtro insere estudar biologia axonal foi implementado pela primeira vez por Steward e4 colegas e desenvolvido por Twiss e colegas 5 a sua configuração actual. A técnica é agora de uso corrente por parte de grupos que estudam diferentes aspectos da biologia axonal e dendritos, com ligeiras modificações, em cada caso para acomodar a população de neurônios estudados, os tratamentos realizados eo tipo de análises bioquímicas usadas 6-9. O presente protocolo não pretende acomodar todas as alternativas para uma tal variedade de aplicações, mas sim fornecer uma abordagem simples que é adequado para a maioria das aplicações. Em particular, o protocolo descrito aqui utiliza uma camada tripla que maximiza o rendimento axonal para análises bioquímicas e é o mais apropriado para estudar revestimentos degeneração axonal outros descritos na literatura produziu menos axónios que retraem e degeneram mais rápido quando privados de factores tróficos 9. Neste procedimento, os corpos celulares neuronais permanecer isolada sobre os filtros de whaxônios ile passar através dos poros e crescer ao longo de sua superfície inferior. Axónios puros (livres de células da glia e os contaminantes do corpo da célula neuronal), que crescem sobre a superfície inferior do filtro pode ser recolhido para análises bioquímicas ou pode ser fixada in situ e examinadas por meio de técnicas de imunocitoquímica 9. O procedimento baseia-se na utilização de neurónios sensoriais embrionárias a partir de gânglios da raiz dorsal (DRG). DRGs embrionárias são amplamente usados ​​para o estudo da biologia axonal porque neurites a partir dessas células sofrem um crescimento rápido e robusto, in vitro, quando mantidos em factor de crescimento do nervo (NGF), e porque rapidamente sofrer degeneração quando privados deste factor. Além disso, os neurónios DRG falta dendritos, de modo que todas as neurites recolhidos por este método são meramente axónios. Filtrar inserções representam uma grande vantagem em comparação com outras abordagens utilizadas para estudar os axônios. Estudos que dependem da utilização de microscopia de diferenciar os processos que ocorrem na célula do soma daquelas numaXONs fornecer informação bioquímica limitado. Como outro exemplo, os sistemas de cultura (por exemplo, em compartimentos, câmaras Campenot 10 ou dispositivos de microfluidos 11) são úteis para abordagens de imagem e para o tratamento diferencial de compartimentos celulares, mas fornecer apenas pequenas quantidades de material axonal, impedindo o uso destas técnicas para análises bioquímicas que requerem quantidades relativamente grandes de amostra. Além disso, seu uso requer treinamento significativo, bem como dispositivos especializados, e eles são demorados. Outra abordagem frequentemente usada para isolar os axônios a partir de explantes é remover manualmente um centro de explante (contendo corpos celulares neuronais) antes da coleta de amostra axonal. Embora este pode produzir grandes quantidades de preparações enriquecidas dos axónios, os axônios nesta preparação pode ser envolto em células gliais e removendo rapidamente corpos 20 do explante consecutivamente a partir de 6 poços (como um exemplo de uma experiência mínima) é demorado e no limite de viabilidade. Em contraste, o método aqui apresentado produz preparações axonais abundante e pura, que pode, então, ser analisados ​​por virtualmente qualquer técnica bioquímica que é vulgarmente utilizado para analisar os lisados ​​de células inteiras, como Western blot, imunoprecipitação 6, northern blot 5 espectrometria de massa 6, a purificação de ARN 7,12,13, entre outros. Além disso, o protocolo pode ser aplicado para imunofluorescência (IF) de técnicas, como é possível a fixação de axónios em crescimento no lado inferior do filtro para os examinar ainda por IF. Esta abordagem facilita muito a análise dos processos específicos de axonal já que não há corpos celulares na preparação final. Esta é uma vantagem significativa uma vez que um sinal de alta imunofluorescência de corpos celulares muitas vezes prejudica o exame e análise de um sinal mais fraco proveniente de estruturas finas, tais como axónios. Duas aplicações do método de cultura para estudar axonal ar degeneraçãoe descritos; um modelo de poda de desenvolvimento e um modelo de degeneração induzida por lesão (comumente referido como degeneração Walleriana). A modelagem da poda de desenvolvimento baseia-se no fato de que os neurônios sensoriais in vivo competem para limitar a quantidade de NGF derivado do alvo e aqueles não receber suficiente neurotrófico degenerado apoio 14. Este fenómeno pode ser mimetizado em culturas de DRG embrionárias mediante a retirada do NGF do meio de cultura, o que, como acontece in vivo, inicia a degeneração axonal seguida da destruição de células do corpo. Para modelar a degeneração Wallerina, o lado superior do filtro com os corpos celulares é raspado. Os axônios que tinham crescido para o lado inferior do filtro tornar-se fisicamente separados dos corpos celulares e, posteriormente, submeter-se ao processo degenerativo rápido e estereotipado conhecida como degeneração Walleriana 15, em homenagem a A. Waller que primeiro relatou o fenômeno em 1850 16.

<table><tbody><tr><td>CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td><td>Charles River</td><td></td><td>In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td></tr><tr><td>Falcon cell culture inserts</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &amp;micro;m pore size, fits 6-well receiving plate</td></tr><tr><td>Falcon cell culture companion plates</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Receiving plates for inserts</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Used at 10 &amp;micro;g/ml in water. Take 100x stock from -80 &amp;deg;C and thaw O/N at 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol bovine collagen solution</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Can be replaced by DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&amp;prime;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, beta subunit)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGF antibody</td><td>Prepared in-house</td><td></td><td>As described in: Acheson, A. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. &lt;strong&gt;7&lt;/strong&gt;, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Commercial option</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DRG culture medium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium&lt;br/&gt; 2% B27 Neurobasal Supplement&lt;br/&gt; 2 mM l-Glutamine&lt;br/&gt; 1% Penicillin-streptomysin&lt;br/&gt; 10 &amp;micro;M FDU&lt;br/&gt; 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1x Laemmli sample buffer&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS&lt;br/&gt; 50 mM DTT&lt;br/&gt; 60 mM Tris (pH 6.8)&lt;br/&gt; 5% Glycerol&lt;br/&gt; 0.01% (w/v) Bromophenol blue</td></tr></tbody></table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Explantes gânglio da raiz dorsal de ratos E13.5 crescer extensivamente sobre filtros sequencialmente revestidas com poli-D-lisina, laminina e colágeno (Figura 1B, à esquerda), atingindo até 2 mm de dentro de 2 dias em cultura. Esta combinação de substrato produz um crescimento particularmente exuberante; outras combinações produzir axónios que são consideravelmente mais curto (Figura 1B, à direita). Além disso, os GDH mantidos em filtros estender mais e mais longos do que os...

Watch this Scientific Journal Video about Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters at JoVE.com

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produção e Isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica Usando filtros porosos

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K visualizações.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

Vídeo: Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Neurociência

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ganglia that line the spinal column. Understanding the receptors and channels expressed by these sensory afferent neurons could lead to novel therapies for disease. The initial step is to identify the specific subset of sensory neurons of interest. Here we describe a method to identify afferent neurons innervating the muscles by retrograde labeling using a fluorescent dye DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate). Understanding the contribution of ion channels to excitation of muscle afferents could help to better control excessive excitability induced by certain disease states such as peripheral vascular disease or heart failure. We used two approaches to identify the voltage dependent ion channels expressed by these neurons, patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry. While electrophysiology plus pharmacological blockers can identify functional ion channel types, we used immunocytochemistry to identify channels for which specific blockers were unavailable and to better understand the ion channel distribution pattern in the cell population. These techniques can be applied to other areas of the nervous system to study specific neuronal groups.

Afferent sensory neurons signal sensory information from the periphery to the central nervous system. Identifying specific afferent neurons will help in understanding their physiology. We describe a method of retrograde labeling to identify afferent neurons, and study the voltage-gated ion channels in these neurons using patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry.

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Biologia do Desenvolvimento

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Projetar filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento do nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Bioengenharia

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Despolarização Seletiva Assistida por Microfluídica das Mitocôndrias Axonais

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

Source: Kaelberer, M. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53917">A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

Isolamento de células de gânglios sensoriais

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#8217;s IRB guidelines.
1. Sensory Ganglia Dissociation

	...