Name: production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters at JoVE.com

This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

NOTA: Le seguenti procedure sono conformi alle linee guida approvate dal Consiglio canadese dei Animal Care. Tutti gli sforzi sono fatti per minimizzare il dolore e la sofferenza degli animali durante le procedure. 1. Rivestimento di filtri NOTA: Quando inserti del filtro cultura sono poste in pozzetti di piastre multi-pozzetto, due comparti sono definite: vano superiore è la regione sopra l&#39;inserto ed il vano inferiore è quello sotto l&#39;inserto Figura 1A.ab. Espianti vengono seminate nel vano superiore dove essi attribuiscono al lato superiore del filtro; molti assoni crescono attraverso il filtro e si estendono sul lato inferiore del filtro, all&#39;interno del compartimento inferiore Figura 1A.c. I volumi di lavoro standard (ad esempio per l&#39;applicazione di soluzione di rivestimento, lavaggi, terreni di coltura, ecc) sono 2 ml per il comparto inferiore e 1 ml per il comparto superiore e stanno ad essere indicato nel protocollo come &quot;; Volumi standard &quot;. Aggiungere soluzioni a partire con il vano inferiore posizionando la punta della pipetta nel divario tra l&#39;inserto e il lato del bene. Inoltre, l&#39;inserto, inclinarlo su un lato, mentre l&#39;erogazione della soluzione per evitare bolle restino intrappolate sul fondo del filtro. <ol><li> Avviare rivestire i filtri il giorno prima placcatura. Sotto il cofano coltura tissutale sterili, collocare 24 cartucce filtranti mm in una piastra da 6 pozzetti ricezione. Incubare inserti con poli-D-lisina in acqua (1 mg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, usando volumi standard: 2 ml nel comparto inferiore e 1 ml in cima. </li><li> Aspirare poli-D-lisina e lavare una volta con acqua. Aspirare acqua, chiudere il coperchio e lasciare le piastre ad asciugare al cofano O / N. Durante l&#39;aspirazione di liquidi, assicurarsi di rimuovere un residuo di liquido che diventa intrappolato direttamente sotto il filtro. </li><li> La mattina successiva, diluire laminina in acqua (10 mg / ml), mescolare e calda a 37 ° C. Incubare inserti con laminina 1 ora in cell incubatore a 37 ° C, utilizzando volumi standard. </li><li> Aspirare laminina e collagene aggiungere in acqua (0,1 mg / ml) e incubare per 1 ora a RT. In questo caso utilizzare 2 ml per il comparto inferiore e 2 ml per vano superiore. </li><li> Aspirare collagene e lavare una volta con acqua sterile. I filtri sono ora pronti a ricevere terreni di coltura e espianti DRG, come descritto nel passaggio 3. </li></ol> 2. Dissezione embrionali radice dorsale Ganglion (DRG) espianti <ol><li> Anestetizzare un 13-giorno incinta topo femmina da una iniezione IP di Avertin (250 mg / kg). Attendere 10-15 minuti e verificare per mancanza di riflessi di prelievo della cornea e pedali. Una volta che i riflessi sono assenti, eseguire dislocazione cervicale. </li><li> Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici e addome femminile con il 70% di etanolo. Lasciare strumenti per asciugare. Tenere la pelle dell&#39;addome e tagliare gli strati cutanei e muscolari per esporre la cavità addominale. </li><li> Rimuovere l&#39;utero staccando dal collo dell&#39;utero e delle ovaie. In un steriLe cappuccio, rimuovere gli embrioni dall&#39;utero con le forbici e raccoglierli in una capsula di Petri pieno di ghiaccio freddo L15 media. Tenere su ghiaccio. NOTA: Fare riferimento a relazioni tecniche precedenti per ulteriori dettagli su come ottenere embrioni di 13 giorni di gestazione 17,18. </li><li> Sotto il microscopio, porre l&#39;embrione da un lato e l&#39;uso di piccole forbici a molla per rimuovere la testa. Fare un&#39;incisione lungo i fianchi laterali per eliminare il petto, ventre, gli arti e la coda. Tenere la schiena che contiene la colonna vertebrale, laici lato ventrale e rimuovere tutti gli organi viscerali. </li><li> Con piccole forbici a molla, esporre l&#39;intero midollo spinale tagliando la colonna vertebrale dal suo lato ventrale lungo la linea mediana. Tenere la carcassa giù con un paio di pinze (# 3) e utilizzando una seconda coppia di tenere il midollo spinale dal suo aspetto più rostrale. </li><li> Lentamente e delicatamente tirare il cavo lontano dalla cavità vertebrale e un pizzico fuori DRG dal midollo spinale con pinze ultra-sottile (# 5). Gruppo DRG devono essere raccolte suil fondo del piatto. </li><li> Raccogliere DRG raggruppati aspirando con 200 microlitri pipetta punta che è stato tagliato per allargare la sua apertura. Mettere i DRG in un tubo e lasciare sul ghiaccio fino alla raccolta DRG è finito. NOTA: consigli Bianco / trasparente sono preferiti perché DRG non si attaccano alle pareti di questa punta (rispetto alle punte gialle standard). Ha Flushing con i media prima dell&#39;uso ulteriore impedisce DRG di attaccarsi alle sue mura. </li></ol> 3. Semina e manutenzione di radice dorsale Ganglio espianti su Filtri <ol><li> Aggiungere supporti DRG completa a 37 ° C per gli inserti rivestiti con volumi standard. Integrare il supporto comparto inferiore a 15 ng / ml di NGF, pur mantenendo il vano superiore NGF-free. NOTA: Anche se NGF diffonde in modo efficiente attraverso il filtro e la sua concentrazione in equilibrio entro poche ore, abbiamo osservato che l&#39;applicazione di NGF per il vano inferiore direttamente prima della semina aumenta significativamente il rendimento assonale sul bottom superficie del filtro. </li><li> Trasferire i DRG dal tubo ai filtri utilizzando una pipetta di 1.000 pl con una punta tagliata per ingrandire sua apertura. </li><li> Disegnare supporto nella punta 2-3x prima di raccogliere i DRG. Questo impedisce loro di attaccarsi al lato interno della punta. La stessa punta può essere riutilizzato per tutti i pozzetti. L&#39;uso di punte incolore (contro punte blu standard) riduce DRG si attacchi alla superficie punta. </li><li> Per trasferire DRG, impostare la pipetta a 800 ml. Aspirare circa 200 ml di media dal lato superiore del filtro, quindi andare al tubo-DRG e pipetta contenente un piccolo volume su e giù - per risospendere DRG che hanno toccato il fondo. Aspirare l&#39;intero volume e DRG pipette sommergere la punta al centro dell&#39;inserto. </li><li> Una volta che tutti gli inserti sono stati caricati, chiudere il coperchio piatto e agitare la piastra 10x, picchiettando delicatamente sul banco cofano tra ogni ricciolo. Questi movimenti aumentano la resa assonale aiutando espianti DRG lavello eallegare al filtro. Questo aiuta anche a distribuire uniformemente espianti modo che assoni di diversi espianti non si sovrappongano. NOTA: La procedura semina espianto descritto nei passaggi precedenti aumenta significativamente il tasso globale di attaccamento espianto al substrato (fino al 75%). Più significativamente, la procedura di pipettaggio impedisce prontamente espianti dal galleggiante sulla superficie del supporto invece di affondare al fondo dell&#39;inserto. </li><li> Per le analisi biochimiche, DRG seme da un embrione (circa 30) per filtro. Per le analisi morfologiche, utilizzare la metà o un terzo dei DRG da un embrione (10-15). Tale decisione deve essere presa prima di raccogliere i DRG in tubi, in modo che tutti i DRG di un tubo vengono seminate in un singolo bene (se si tratta di 30, 15, o 10 DRG). </li><li> Mantenere culture in un incubatore cella a 37 ° C, a cambiare i media ogni 2-3 giorni. Per cambiare supporto, aspirare il vano superiore per primo, seguito dal comparto inferiore. Aggiungi mezzi freschi in volume standards partendo con il vano inferiore. NOTA: per evitare cellule / assoni di asciugatura, non cambiare supporto in più di 3 inserti allo stesso tempo. DRG coltivate su filtri in presenza di NGF estenderà assoni lunghi, raggiungendo fino a 2 mm dopo 2 giorni di coltura. </li></ol> 4. Trofico Factor sospensione del trattamento NGF ritiro induce degenerazione assonale con la frammentazione assonale (determinata dal contrasto di fase e β-III-tubulina IF) che appare prima di circa 12 ore dopo la sospensione. Frammentazione completo si ottiene con 36 hr. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall&#39;utente finale secondo il disegno sperimentale. <ol><li> Dopo la assonale fase di estensione di 2 giorni, cambiano i media dai compartimenti superiori e inferiori a media che manca di NGF e contiene anticorpi anti-NGF (1 mg / ml) di sequestrare qualsiasi residuo (o produzione endogena) NGF. </li><li> Piastre Return to incubatore cellulare (37 ° C) per consentireNGF degenerazione ritiro indotto a procedere per il tempo desiderato. </li><li> Procedere alla estrazione delle proteine ​​(fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7). </li></ol> 5. Assonale transezione per indurre degenerazione Walleriana Questa procedura lascia gli assoni sul lato inferiore del filtro staccati dalla loro corpo cellulare, ma altrimenti intatto. Successivamente, questi assoni rapidamente avviare walleriana degenerazione. Frammentazione assonale (evidenziato dal contrasto di fase o β-III-tubulina IF) appare per la prima da 3 ore dopo resezione; da 9 ore, gli assoni sono completamente frammentati e si staccano dal filtro. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall&#39;utente finale secondo il disegno sperimentale. <ol><li> Raschiare il lato superiore del filtro, contenente espianti DRG coltivate, con una cella-raschietto. Assicurare la completa rimozione di materiale superiore spostando raschietto in X, Y e circolareindicazioni. </li><li> Eliminare il supporto dal vano superiore contenente gli espianti galleggianti che sono stati raschiati dal filtro e sostituire con 1 ml di pre-riscaldato, i media DRG completo contenente NGF (10 ng / ml). </li><li> Piastra di ritorno alla cella incubatore (37 ° C) per consentire Wallerian degenerazione procedere per la quantità di tempo scelto dall&#39;utente finale. </li><li> Procedere alla estrazione delle proteine ​​(fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7). </li></ol> 6. Proteine ​​Estrazione di assonale Campioni <ol><li> Riempire tubi di raccolta (1,5 ml) con 75 ml di tampone campione Laemmli. Conservare le provette su ghiaccio mentre la raccolta assoni dall&#39;intera serie di filtri. </li><li> Lavare il filtro con espianti DRG in PBS e raschiare il lato superiore del filtro. Rimuovere l&#39;inserto dalla piastra, pulire la superficie superiore del filtro con un applicatore con punta di cotone e aspirare qualsiasi PBS supplementare dai lati superiore e inferiore. </li><li> Posizionare inserto upsidegiù sulla panca e tagliare il filtro dell&#39;inserto con un bisturi affilato. Tenere il filtro con una pinza, bottom-up. Effettuare un taglio dalla circonferenza al centro del filtro con le forbici. </li><li> Inserire filtro sulla parte superiore del tubo di raccolta, e con una pinza, premere il centro del filtro nel tubo. Nel fare questo, un imbuto dovrebbe formare. Spingere il filtro a imbuto al fondo del tubo in modo che sia immerso nel tampone Laemmli. </li><li> Estrazione di proteine ​​complete facendo bollire le provette per 4 min. Rimuovere il filtro con pinze per posizionarlo capovolto nella parte superiore del tubo e l&#39;esecuzione di una breve rotazione (2.000 xg per 15 sec). Eliminare i filtri secchi. </li><li> Risolvere 10 ml di preparazione proteina assonale in un SDS-PAGE seguita da western blot per rilevare le proteine ​​di interesse. NOTA: Come riferimento, una preparazione assonale da 20 espianti coltivati ​​per 2 giorni e lisati in 100 ml di RIPA Lysis Buffer avrà una concentrazione proteica di 4-6mg / mL. </li></ol> 7. Immunofluorescenza Esame degli assoni su Filtri Le seguenti operazioni delineano le manipolazioni generali da eseguire se la colorazione su inserti filtranti, esemplificate dal rilevamento di β-III-tubulina. Fixative, tempi di incubazione, le concentrazioni e le altre indicazioni devono essere ottimizzati per altre coppie antigene-anticorpo. <ol><li> Utilizzare 6 pozzetti utilizzati in precedenza, accuratamente puliti, per i seguenti lavaggi e incubazione degli inserti. </li><li> Brevemente lavare inserti in PBS. Fissarli in appena preparato 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente su agitatore. </li><li> Dopo fissazione, raschiare e pulire la superficie superiore dell&#39;inserto per raccogliere gli assoni che crescevano esclusivamente sulla superficie inferiore del filtro. Procedere con incubazione standard per IF. </li><li> Incubare inserti in soluzione di blocco (TBS, 0,05% Tween 20, latte scremato 5%), con volumi standard, per 1 ora a RT agitando delicatamente. </li><li> Trasferimento inserti di anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio (anti-β-III-tubulina, 1/5.000), utilizzando volumi standard. Incubare O / N (~ 18 hr) a 4 ° C con un leggero scuotimento. </li><li> Lavare il primo anticorpo due volte in PBS (2 X 10 min a temperatura ambiente). </li><li> Trasferimento inserti di anticorpi secondari fluorescenti coniugato diluito in tampone di bloccaggio (capra anti-topo, 1:2.000), utilizzando volumi standard. Incubare coperto dalla luce per 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente. </li><li> Lavare 3x anticorpo secondario in PBS (3 x 10 min a temperatura ambiente). </li><li> Dopo IF è completo, prendere inserire out, svuotare PBS dall&#39;ultimo lavaggio e pulire il lato superiore del filtro con un applicatore di cotone punta. Aspirare il liquido dai lati superiore e inferiore. </li><li> Luogo inserire capovolta sulla panchina, e tagliare il filtro dell&#39;inserto con un bisturi affilato. </li><li> Tenere il filtro con una pinza, ribasso, e mettere al microscopio diapositiva. Overlay con un vetrino e mou-compatibile fluorescentesupporti nting. Lasciate asciugare piatto in camera fredda, coperto dalla luce. Esaminare e catturare immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. NOTA: Se conservato a 4 ° C e al riparo dalla luce, questi preparati possono essere conservati per settimane con una perdita minima di fluorescenza. </li><li> OPTIONAL: In alternativa, se può essere eseguita su filtri che sono stati rimossi dal dell&#39;inserto. Per fare questo, raschiare e pulire il lato superiore dei filtri direttamente dopo la fissazione. <ol><li> Prendere filtri su inserti con un bisturi e filtri Consiglio tagliente assoni-up sul fondo di una piastra sei pozzetti. </li><li> Successivamente, eseguire incubazione per IF come indicato in 7,4-7,8 e 7.11. Il vantaggio di questa alternativa è che risparmia reagenti, poiché, ad esempio, i volumi di incubazione può scendere a 500 microlitri (rispetto ai 3 ml utilizzati a filtri colorati direttamente sugli inserti come mostrato in 7,1-7,11). </li></ol></li></ol>

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	<li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).</li><li>Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+initial+segment+and+the+maintenance+of+neuronal+polarity.">The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).</li><li>Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+as+a+therapeutic+target+in+the+CNS.">Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS.</a> Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).</li><li>Torre, E. R., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+local+protein+synthesis+within+dendrites+using+a+new+cell+culture+system+that+permits+the+isolation+of+living+axons+and+dendrites+from+their+cell+bodies.">Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies.</a> J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).</li><li>Zheng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+role+for+intra-axonal+protein+synthesis+during+axonal+regeneration+from+adult+sensory+neurons.">A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).</li><li>Willis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transport+and+local+translation+of+cytoskeletal,+injury-response,+and+neurodegeneration+protein+mRNAs+in+axons.">Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons.</a> J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).</li><li>Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+process-localized+mRNAs+from+cultured+rodent+hippocampal+neurons.">Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).</li><li>Schoenmann, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+is+regulated+by+the+apoptotic+machinery+or+a+NAD+-sensitive+pathway+in+insects+and+mammals.">Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals.</a> J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).</li><li>Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIAP+regulates+caspase+activity+in+degenerating+axons.">XIAP regulates caspase activity in degenerating axons.</a> Cell Rep. 4, 751-763 (2013).</li><li>Ure, D. R., Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures.">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Minis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcriptomics-Dissection+of+the+mRNA+composition+in+the+axonal+compartment+of+sensory+neurons.">Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons.</a> Dev. Neurobiol. , (2013).</li><li>Niekerk, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+in+axons+triggers+retrograde+transport+of+the+RNA-binding+protein+La.">Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+roles+in+neuronal+development+and+function.">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Plating,+and+Maintenance+of+Dorsal+Root+Ganglion+Neurons+for+Monoculture+and+for+Coculture+with+Dorsal+Horn+Neurons.">Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Leach, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+primary+motor+and+sensory+neurons+in+defined+media+on+electrospun+poly-L-lactide+nanofiber+scaffolds.">The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthetic+pathways+delays+axonal+degeneration+after+axotomy.">Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy.</a> J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Parametri importanti da prendere in considerazione quando si adegua questa tecnica includono la popolazione neuronale che sarà studiato, il substrato, dimensione dei pori del filtro e superficie. Tutti questi parametri avranno un impatto la specificità, la qualità e la quantità della preparazione neurite ottenuto, e deve essere considerato con attenzione da parte dell&#39;utente finale. Negli esempi presentati in questo protocollo, l&#39;uso di neuroni DRG ha il vantaggio di estendere solo assoni, dando così una pu...

Il compartimento assonale dei neuroni mostra un buon grado di autonomia funzionale dal compartimento somato-dendritico. In neuroni di proiezione, assoni contengono la maggior parte della proteina 1,2 neuronale. Lo studio della fisiologia e fisiopatologia degli assoni ha avuto un impulso nella comunità neuroscientifica, perché recenti studi hanno dimostrato che inizi la disfunzione assonale sembra essere una caratteristica comune delle malattie neurodegenerative e dei disturbi neuropsichiatrici 3. Sembra probabile che una migliore comprensione dei meccanismi assonale esclusiva in condizioni normali e patologiche farà luce sui primi eventi che guidano erettile. Il presente protocollo descrive come utilizzare inserti di coltura recanti una membrana porosa (filtro) per ottenere grandi quantità di materiale assonale puro che è adatto per biochimica e analisi immunocitochimica. L&#39;uso del filtro inserti a studiare biologia assonale è stato realizzato da Steward ecolleghi 4 e ulteriormente sviluppati da Twiss e colleghi 5 alla sua configurazione attuale. La tecnica è ora in uso corrente da gruppi studiano diversi aspetti della assonale e dendrite biologia, con lievi modifiche in ciascun caso per ospitare per la popolazione di neuroni studiati, i trattamenti eseguiti e del tipo di analisi biochimiche usati 6-9. Il presente protocollo non intende accogliere tutte le alternative per una tale varietà di applicazioni, ma piuttosto di fornire un approccio semplice che è adatto per la maggior parte delle applicazioni. In particolare, il protocollo qui descritto utilizza un triplo strato che massimizza il rendimento assonale per le analisi biochimiche ed è più adatto per studiare i rivestimenti assonale degenerazione-altri descritti nella letteratura prodotta meno assoni che ritraggono e degenerano più rapidamente in caso di privazione di fattori trofici 9. In questa procedura, corpi cellulari neuronali rimangono isolati in cima alle wh filtroassoni ile passano attraverso i pori e crescono lungo la sua superficie di fondo. Assoni puro (esente della glia e contaminanti corpo cellule neuronali) che si sviluppano sulla superficie inferiore del filtro possono essere raccolti per analisi biochimiche o possono essere fissati in situ ed esaminati mediante tecniche immunocitochimiche 9. La procedura si basa sull&#39;utilizzo di neuroni sensoriali embrionali dai gangli della radice dorsale (DRG). DRG embrionali sono ampiamente usati per studiare biologia assonale perché neuriti da queste cellule subiscono quando mantenuto in fattore di crescita nervosa (NGF) crescita veloce e robusto in vitro, e perché rapidamente subiscono degenerazione quando privati ​​di questo fattore. Inoltre, i neuroni DRG mancano dendriti, in modo che tutti i neuriti raccolti da questo metodo sono puramente assoni. Inserti del filtro rappresentano un grande vantaggio rispetto ad altri approcci utilizzati per studiare gli assoni. Studi basandosi sull&#39;uso di microscopia per differenziare i processi che si verificano nel soma cella da quelli di unXON forniscono informazioni biochimiche limitate. Come altro esempio, sistemi di coltura compartimenti (ad esempio, camere Campenot 10 o dispositivi microfluidici 11) sono utili per approcci di imaging e per il trattamento differenziato dei compartimenti cellulari ma forniscono solo piccole quantità di materiale assonale, precludendo l&#39;uso di queste tecniche di analisi biochimiche che richiedono relativamente grandi quantità di campione. Inoltre, il loro uso richiede una formazione significativa così come i dispositivi specializzati, e sono in termini di tempo. Un altro approccio spesso utilizzato per isolare gli assoni da espianti è quello di rimuovere manualmente un centro di espianto (che contiene i corpi cellulari neuronali) prima della raccolta del campione assonale. Anche se questo può produrre grandi quantità di preparazioni assone arricchito, assoni di questa preparazione possono essere avvolti glia e rimuovere rapidamente organi 20 di espianto consecutivamente da 6 pozzetti (come esempio di un esperimento minima) richiede tempo e al limite della fattibilità. Al contrario, il metodo presentato qui produce abbondanti e pure preparati assonale che possono poi essere analizzati da virtualmente qualsiasi tecnica biochimica che viene comunemente utilizzato per analizzare lisati di cellule intere, come western blot, immunoprecipitazione 6, northern blot 5 spettrometria di massa 6, purificazione dell&#39;RNA 7,12,13, tra gli altri. Inoltre, il protocollo può essere applicato a tecniche di immunofluorescenza (IF), in quanto è possibile fissare assoni in crescita nella parte inferiore del filtro di esaminarli ulteriormente IF. Questo approccio facilita notevolmente l&#39;analisi dei processi specifici assonale poiché non esistono corpi cellulari nella preparazione finale. Questo è un vantaggio significativo in quanto un segnale alto immunofluorescenza da corpi cellulari spesso pregiudica esame e l&#39;analisi di un segnale più debole proveniente da strutture sottili come assoni. Due applicazioni del metodo di coltura per studiare assonale degenerazione are descritto; un modello di potatura di sviluppo e un modello di degenerazione lesioni indotte (comunemente indicato come la degenerazione walleriana). La modellazione di potatura sviluppo si basa sul fatto che i neuroni sensoriali in vivo competono per limitare quantità di NGF-bersaglio derivato e quelli non ricevono abbastanza neurotrofico supporto degenerato 14. Questo fenomeno può essere imitato in colture DRG embrionali ritirando NGF dal terreno di coltura, che, come accade in vivo, avvia degenerazione assonale seguito dalla distruzione corpo cellulare. Per modellare degenerazione Wallerian, il lato superiore del filtro con i corpi cellulari viene raschiata via. Gli assoni che erano cresciute sul lato inferiore del filtro diventare fisicamente separati dai corpi cellulari e successivamente subire il processo degenerativo rapido e stereotipico noto come degenerazione Walleriana 15, dal nome A. Waller che per primo ha segnalato il fenomeno nel 1850 16.

<table><tbody><tr><td>CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td><td>Charles River</td><td></td><td>In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td></tr><tr><td>Falcon cell culture inserts</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &amp;micro;m pore size, fits 6-well receiving plate</td></tr><tr><td>Falcon cell culture companion plates</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Receiving plates for inserts</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Used at 10 &amp;micro;g/ml in water. Take 100x stock from -80 &amp;deg;C and thaw O/N at 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol bovine collagen solution</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Can be replaced by DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&amp;prime;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, beta subunit)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGF antibody</td><td>Prepared in-house</td><td></td><td>As described in: Acheson, A. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. &lt;strong&gt;7&lt;/strong&gt;, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Commercial option</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DRG culture medium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium&lt;br/&gt; 2% B27 Neurobasal Supplement&lt;br/&gt; 2 mM l-Glutamine&lt;br/&gt; 1% Penicillin-streptomysin&lt;br/&gt; 10 &amp;micro;M FDU&lt;br/&gt; 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1x Laemmli sample buffer&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS&lt;br/&gt; 50 mM DTT&lt;br/&gt; 60 mM Tris (pH 6.8)&lt;br/&gt; 5% Glycerol&lt;br/&gt; 0.01% (w/v) Bromophenol blue</td></tr></tbody></table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Espianti gangli spinali dei topi E13.5 crescono ampiamente su filtri in sequenza rivestito con poli-D-lisina, laminina e collagene (Figura 1B, a sinistra), arrivando fino a due millimetri entro 2 giorni di coltura. Questa combinazione produce substrato di crescita particolarmente esuberante; altre combinazioni producono assoni che sono notevolmente più brevi (Figura 1B, a destra). Inoltre, DRG mantenuti sui filtri estendere assoni più e più a lungo rispetto DRG coltivate su plastica ...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica Uso dei filtri porosi

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Views.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

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Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ganglia that line the spinal column. Understanding the receptors and channels expressed by these sensory afferent neurons could lead to novel therapies for disease. The initial step is to identify the specific subset of sensory neurons of interest. Here we describe a method to identify afferent neurons innervating the muscles by retrograde labeling using a fluorescent dye DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate). Understanding the contribution of ion channels to excitation of muscle afferents could help to better control excessive excitability induced by certain disease states such as peripheral vascular disease or heart failure. We used two approaches to identify the voltage dependent ion channels expressed by these neurons, patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry. While electrophysiology plus pharmacological blockers can identify functional ion channel types, we used immunocytochemistry to identify channels for which specific blockers were unavailable and to better understand the ion channel distribution pattern in the cell population. These techniques can be applied to other areas of the nervous system to study specific neuronal groups.

Afferent sensory neurons signal sensory information from the periphery to the central nervous system. Identifying specific afferent neurons will help in understanding their physiology. We describe a method of retrograde labeling to identify afferent neurons, and study the voltage-gated ion channels in these neurons using patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry.

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Biologia dello sviluppo

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Progettazione di film di silicio poroso come elementi portanti del fattore di crescita del nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Bioingegneria

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

Source: Kaelberer, M. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53917">A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

Isolamento di cellule dai gangli sensoriali

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#8217;s IRB guidelines.
1. Sensory Ganglia Dissociation

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Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l'analisi biochimica Uso dei filtri porosi

Riepilogo

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