This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Preparação de in-house Reagentes látex <ol><li> Preparação de solução salina tamponada com glicina (GBS) <ol><li> Adicionar 1,5 g de glicina, cloreto de sódio e 11,7 g de 100 ml de água destilada para uma proveta de vidro de 200 ml. </li><li> Misturar até dissolver-se utilizando um agitador magnético. </li><li> Transferir a mistura de 500 ml de medição de cilindro e adicionando água destilada, para perfazer um total de 200 ml. </li><li> Transferir a solução de volta para o copo de 200 ml, verificar o pH e ajustar para 8,2 com hidróxido de sódio 5 M. NOTA: O hidróxido de sódio é corrosivo, usar equipamento de protecção pessoal. </li><li> Filtrar esterilizar a solução com 0,22 mm e vários filtros de 60 ml seringas em um frasco de vidro com tampa de rosca ml preautoclaved 250. </li><li> Armazenar à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparação de GBS com 0,2% de albumina de soro bovino <ol><li> Adicionar 0,2 g de albumina de soro bovino (BSA) em pó e 100 ml de GBS para uma proveta de vidro de 200 ml e misturar até se dissolver utilizando um agitador magnético. </li><li> Filtraresterilizar a solução através de filtros de 0,22 mM utilizando várias seringas de 60 ml em um ml preautoclaved parafuso frasco de vidro tampado 250. </li><li> Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de reagentes Latex <ol><li> Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo. NOTA: rodada tubos de fundo são usados ​​para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. </li><li> Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro pneumocócica adequado ao reagente de látex a ser preparado (por exemplo, associação, grupo, o tipo ou o factor). Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Dilui-se partículas de látex de poliestireno 01:10 por adição de 120 ul de partículas de látex de 1,080 pi de solução salina fisiológica estéril. NOTA: Este pode ser feito em grandes volumes, mas deve ser feito fresco cada vez que os reagentes de látex são produzidas. </li><li> Adicionar 1000 mL da suspensão de látex 1:10 (preparado no passo 1.3.3) para o 1,000 ul de suspensão 1:40 de anti-soro (preparado no passo 1.3.2). Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Incubar a 37 ° C sobre uma roda de rotação lenta (por exemplo, 4 rpm para uma roda de 38,5 cm de diâmetro), durante 2 horas. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em 2 ml de solução salina estéril. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de GBS e delicadamente ressuspender o sedimento. </li><li> Pipetar a suspensão de látex em um rotulados 5 ml com tampa de rosca de tubo. Adicione mais 1 ml de GBS. </li><li> Adicionar 2 ml de GBS contendo 0,2% de BSA (w / v) (pH 8,2) (preparada no passo 1.2). Adicionar 40 ul de 10% (w / v) de solução de azida de sódio como conservante. NOTA: A azida sódica é perigoso se inalado, e é uma pele e dos olhos irritante. É desejável para adquirir uma solução preparada a 10% em vez do que a forma em pó, como o que minimiza o risco de exposição por inalação. Equipamento de proteção individual (incluindo luvas umóculos d respingo) deve ser usado quando manusear este reagente. Consulte a Ficha de Segurança para obter detalhes. </li><li> Reagentes de látex armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de látex controlo negativo <ol><li> Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo. NOTA: rodada tubos de fundo são usados ​​para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. </li><li> Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro de coelho normal. Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Proceda como nos passos 1.3.3 a 1.3.10 acima </li></ol></li></ol> 2 Controle de Qualidade (CQ) de látex Reagentes <ol><li> Traga reagente de látex para TR. Imediatamente antes da utilização, mistura suavemente o reagente de látex, invertendo o tubo várias vezes. </li><li> Verifique reagente para autoaglutinação pipetando 15 mL em uma lâmina de vidro e proceda como nos passos 4.7 e 4.8 abaixo. Não deve haver umgglutination das partículas de látex. O reagente deve aparecer branca e lisa. </li><li> Teste o reagente contra um painel de baixa passagem isolados de pneumococo. Use culturas recém-cultivadas preparados como no passo 3 O painel de isolados deve incluir isolados do sorotipo &#39;target&#39; (o sorotipo específico para o reagente a ser testada) e sorotipos &quot;não-alvo&quot; (isolados de outros sorotipos que não deve normalmente cruzam reagem com o reagente). Inclua pelo menos um isolado de cada alvo e não-alvo para cada sorotipo reagente látex passando por QC. Se houver apenas um alvo ou sorotipo não-alvo, teste de duas amostras diferentes do sorotipo particular. NOTA: O painel de teste deve incluir vários isolados de cada sorotipo, alguns dos quais são comuns na doença invasiva e / ou coleções de culturas de tipo. É preferível incluir uma carruagem isolados, uma vez que são muitas vezes mais exigente para o serótipo (dados não mostrados), assim, ainda mais a testar o Capacidadef os reagentes e garantir que os reagentes são provavelmente capazes de sorotipagem tanto invasivo e transporte isola. </li><li> Proceder com testes de reagentes de látex com alvo e pneumocócica não-alvo isolados de acordo com o método descrito nas etapas 3 e 4 abaixo. </li><li> Reagentes de controle de qualidade no momento da produção e, em seguida, pelo menos, anualmente. NOTA: Se um reagente não passa QC, o lote deve ser descartada e uma nova preparação feita. Em caso de falha de repetição QC recomendamos os reagentes ser produzidos utilizando os métodos alternativos descritos no Ortika et al. De 2013 8 e na discussão que se segue. </li></ol> 3 Preparação das Culturas pneumocócicas para sorotipagem <ol><li> Usando uma agulha esterilizada selecionar uma única colônia da pneumocócica e isolar este raia-se para um meio de ágar de sangue não selectivo sólida de modo que o inoculo primário cobre aproximadamente um terço da superfície da chapa. Streak para colónias isoladas. NOTA: As lâminas preparadas a partir de cavalo desfibrinado ou sangue de carneiro são adequados; mas as placas de sangue preparadas com sangue ou sangue de animais com citrato não são. </li><li> Incubar a placa S / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Observar o crescimento na placa para avaliar a pureza e que há um crescimento suficiente para serotipagem. Observação: Uma cultura pura do isolado de pneumococos é necessário para serotipagem. Na nossa experiência, confluentes, ou perto de crescimento confluente abrangendo aproximadamente um terço da superfície da placa é geralmente suficiente para completar a serotipagem. Como as culturas pneumocócicas podem ser propenso a autólise, culturas preparadas para sorotipagem deve ser testada dentro de 24 horas de subcultura. Não tome a placa de cultura de fora da incubadora mais do que 15 a 20 minutos antes da sorotipagem começa. </li></ol> 4 Realização de sorotipagem de aglutinação em látex <ol><li> Remova todos os reagentes de látex de geladeira e deixe-os a aquecer a temperatura ambiente por aproximadamentemadamente 30 min. Imediatamente antes da utilização, inverter cuidadosamente os tubos para misturar os reagentes. </li><li> Rotular uma lâmina de microscópio. </li><li> Coloque 15 mL de reagente de látex controle negativo sobre a lâmina de microscópio. </li><li> Usando um circuito descartável 1 ml estéril tomar uma varredura da cultura pneumocócica para que o ciclo é de aproximadamente meio cheio. </li><li> Suavemente manchar o inoculo sobre a superfície da lâmina próximo da gota de reagente de látex de controlo negativo. O inóculo deve ser visível sobre a lâmina de vidro. </li><li> Depressa e bem misturar o inóculo para o reagente de látex de controle negativo usando o loop. Certifique-se de que a queda não se espalhou mais longe do que seu tamanho inicial. </li><li> Pegue o slide, segurando-o em ambas as extremidades. Balance a deslizar para trás e para frente para 1 min. Ter o cuidado de manter o líquido em movimento, lentamente, e assegurar que o tamanho da gota não aumenta. NOTA: Como alternativa, use uma placa oscilante. </li><li> Observe a aglutinação macroscópica (ou seja, porolho nu) e compensação da suspensão contra um fundo preto. </li><li> Se o reagente de látex de controlo negativo não mostra nenhuma aglutinação ou de compensação continua testando a cultura, substituindo os reagentes de teste de látex para o reagente de látex de controlo negativo em passos 4,1-4,8 acima. Um laço fresco deve ser usado de cada vez. Prossiga com o teste dos reagentes de látex começando com as piscinas. </li><li> Teste cada um dos reagentes de látex &#39;pool&#39; em sucessão, até que um teste positivo é obtido. NOTA:. A ordem dos testes das piscinas podem ser feitas em &#39;rounds&#39; para refletir a incidência local dos sorotipos específicos (por exemplo, por meio de testes para as três piscinas mais prováveis ​​sobre o primeiro slide Se uma reação positiva não é obtido, em seguida, teste a próxima mais provável três das piscinas restantes na segunda corrediça, e assim por diante até que uma reacção positiva é obtido). Isto assegura que os serotipos mais comuns são testados em primeiro lugar, minimizando o tempo e os reagentes necessários. </li><li>Usando a chave do fabricante do anti-soro anti-soros individuais determinar quais são representados no conjunto positivo. </li><li> Teste cada um dos grupos ou tipos contidos na piscina positiva individualmente para determinar o &#39;grupo&#39; ou &#39;tipo&#39; como nos passos 4,1-4,8 acima. </li><li> Determinar o resultado por referência a chave do fabricante do anti-soro. Se um &#39;tipo&#39; é determinado (por exemplo, o sorotipo 5), então não há mais testes são necessários e este resultado é gravado. </li><li> Se um &#39;grupo&#39; é determinado (por exemplo, grupo 19), em seguida, referem-se à chave fabricantes para determinar os fatores a serem testados. Continuar os testes com os reagentes de látex &quot;fator&quot; individuais e determinar o sorotipo final (por exemplo, 19B sorotipo). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem pneumocócica. Comerciais pneumocócicas reagentes de aglutinação de látex estão disponíveis, mas que atualmente não fazem distinção todos os sorotipos de pneumococos conhecida 10,12. No entanto, reagentes de aglutinação de látex pode ser facilmente produzido em casa usando anti-soros comprado levantada contra antígenos capsulares de pneumococos específicos. No método aqui descrito, os anticorpos são passivamente ligado a partículas de látex para fazer um conjunto de reagentes de aglutinação de látex. Uma reacção positiva ocorre quando o látex anticorpos específicos ligados às partículas de látex atribuem aos antigénios sobre a cápsula polissacarídica do pneumococo isolar 18,19. As partículas de látex ligados aos anticorpos permite a reacção anticorpo-antigénio específico a ser visualizado sem ampliação. Aglutinação em látex é um método adequado para um elevado rendimento laboratóriosd também para locais com poucos recursos. As principais vantagens do método são de aglutinação em látex que não é necessário equipamento especializado para executar o teste, os reagentes têm um prazo de validade de pelo menos 2 anos, quando armazenados a 4 ° C, 8, e que é de baixo custo, simples e rápida de realizar. Serotipagem um isolado de pneumococos por aglutinação em látex leva aproximadamente 10 minutos, e até quatro reagentes de látex podem ser testadas em paralelo a uma lâmina. Além disso, se a prevalência de serotipos é conhecida para a configuração epidemiológica relevante, os testes podem ser realizados em rodadas começando com as piscinas que contêm os serotipos mais comuns de modo semelhante ao teste de Quellung 17. Esta abordagem minimiza o número de testes necessários para determinar o serotipo. O método também é altamente reprodutível entre diferentes operadores (dados não mostrados). Uma desvantagem de aglutinação em látex serotipagem é que a produção dos reagentes é demorado, tendo cerca de quatro horas; embora REAGE múltiplaes podem ser facilmente produzidos em paralelo. Além disso, alguns antígenos são comuns a diferentes sorotipos de pneumococo, resultando em reações cruzadas com alguns anti-soros (por exemplo, o sorotipo 29, 42 e Grupo 35). No entanto, estas reacções cruzadas estão bem caracterizados pelo uso comercial anti-soros (o que é normalmente pré-absorvido para remover os anticorpos de reacção cruzada mais problemáticos) e tabelas de reacção adicionais são fornecidos pelo fabricante, a fim de distinguir o que se encontra presente serótipo. Reagentes de látex pode também reagiram de forma cruzada se os anticorpos não estão alinhados adequadamente sobre as partículas de látex; estes são detectados como falhas QC. Na nossa experiência, rigoroso QC é central para o sucesso deste método, mesmo quando os anti-soros disponíveis comercialmente são usados ​​para a produção. QC demora aproximadamente 15 min por reagente e depende de um conjunto de QC apropriada isolados como descrito acima. O método aqui descrito resulta em reagentes que dão uma reacção positiva bem widiluir o período de teste. Na nossa experiência, os falsos positivos são raros, na prática, (dados não mostrados). Falsos negativos ocasionais são observadas; geralmente estes se relacionam com problemas conhecidos com um anti-soro específico (por exemplo, o sorogrupo 6 isolados não pode reagir com piscina B anti-soro), ou baixa regulação da expressão cápsula pelo isolado. Usando o algrorithm sorotipagem fornecido pelo fabricante também é importante, como na maioria dos casos, uma reação positiva ou negativa falsa levará a um resultado &quot;final cego &#39;. Nestes casos, e quando as reações são de difícil interpretação, recomendamos repetir-testes e / ou testes por um método alternativo, como a reação Quellung. Alguns solução de problemas é por vezes necessária para fazer reagentes de látex satisfatórios. No método aqui descrito, o anticorpo é ligado a partículas de látex, através de adsorção passiva 15,19, então uma variável crítica é a concentração de anticorpo utilizado, o que determina quão bema superfície das partículas de látex é coberto e o subsequente alinhamento dos locais activos de anticorpos 15,20. Por conseguinte, se o anticorpo em excesso insuficiente ou está ligado às partículas de látex, as reacções antígeno-anticorpo não será óptimo, e reagentes insatisfatórias podem ser produzidos 15,20,21. Como os títulos de anticorpos variar entre diferentes lotes de soros, um conjunto padrão de diluições pode não produzir os reagentes que um bom desempenho 8. Um ponto de partida útil é a utilização de uma diluição 1:40 do anti-soro, se este não é bem sucedida, diluir ainda mais o anti-soro. Em nossa experiência, isso geralmente resolve o problema 8. Em um pequeno número de casos reagentes podem apresentar aglutinação fraca que não é acompanhada de compensação da suspensão, quando testado com alvo isolados. Nestes casos, a diluição de anti-soro não melhora a qualidade do reagente, mas reagentes satisfatórios podem ser geralmente produzidos por omitindo a centrifugação e passos de lavagem 8,22 </sup&gt;. Revestidas de anticorpo partículas de látex são usados ​​comumente em microbiologia de diagnóstico para a detecção, identificação ou sorotipagem de muitos micróbios diferentes 15,20. Como tal, o método aqui descrito pode ser adequado para a preparação de reagentes de látex para outras finalidades, desde que os anti-soros adequados estão disponíveis e são adequados CQ adoptada.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em crianças menores de cinco anos de idade, particularmente em locais com poucos recursos de 1,2 em todo o mundo. Gamas de doença pneumocócica de infecções localizadas a condições de risco de vida, tais como pneumonia, sepse e meningite 1,2. Mais de 90 sorotipos de pneumococos foram identificados com base em diferenças na sua polissacarídeo capsular 3. As vacinas atuais direcionar o polissacarídeo capsular e fornecer proteção contra os principais sorotipos causadores de doença invasiva 4. Sorotipagem pneumocócica isolamentos é importante para avaliar o impacto da vacinação sobre a carruagem e doença, bem como proporcionar informações epidemiológicas mais amplo 5,6. O actual método &quot;padrão ouro&quot; para sorotipagem pneumocócica é o teste Quellung, mas é demorado e requer alguma habilidade para perform 7. Aglutinação em látex é um método de sorotipagem alternativa recomendada pela Organização Mundial da Saúde 7. Aglutinação em látex é rápido e simples de realizar, e é empregada em muitos laboratórios em todo o mundo 8-11. Importante, aglutinação em látex mostrou precisão comparável ao teste Quellung para sorotipagem pneumocócica 10,12-14. No geral, este método é ideal para locais com poucos recursos, bem como laboratórios de alto rendimento. Os reagentes de aglutinação de látex (&#39;reagentes de látex&#39;) são criados por meio da ligação de anticorpos a partículas de látex 15. Numa reacção positiva, estas partículas marcadas aglutinar na presença do antigénio específico. Reagentes de látex comerciais estão disponíveis para uma gama restrita de sorotipos. Reagentes de látex também pode ser preparada em casa usando anti-soros comercialmente disponível 10. Misturas de anti-soro (&quot;pools&quot;), bem como os anti-soros específicos para s pneumocócicaserogroups (por exemplo, grupo 19), os serotipos individuais (por exemplo, o serotipo 5), e a antigénios específicos (&quot;factores&quot;, por exemplo., factor de 19c reconhecimento do serotipo 19A) para a definição mais serotipos dentro grupos estão disponíveis 16. Este manuscrito descreve os principais passos na produção de reagentes de látex utilizando ligação passiva de anti-soros disponíveis comercialmente a partículas de látex. O controlo de qualidade (QC) os aspectos deste método encontram-se descritos, e um protocolo para o uso de reagentes de látex para serotipagem pneumocócica está incluído.

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Uma reacção positiva ocorre quando o látex de anticorpo específico de tipo ligado à partícula de látex liga-se a cápsula do pneumococo, e a aglutinação das partículas anticorpo marcado resulta 15. Figura 1A mostra uma reacção positiva, que é caracterizada por aglutinação e de limpeza de fundo suspensão. Uma reacção negativa é caracterizado por a suspensão reagente de aglutinação em látex remanescente suave e branco (Figura 1B). Os reagentes são optimizados de modo a que uma reacção positiva deve ser observada antes do fim do intervalo de tempo de um minuto (geralmente detectáveis ​​em cerca de 20 seg). Nós não recomendamos a leitura reações após o intervalo de tempo de 1 min. Muito ocasionalmente, exibir reacções de aglutinação fracas em torno da borda da gota que não é acompanhada por compensação da suspensão de fundo, ou aparecem &quot;fibroso&quot;, sem compensação de fundo (dados não mostrados). Estes são mais como<html> reações negativas ly. Em tais casos, é recomendável um novo ensaio e / ou investigação adicional utilizando outro método serotipagem (por exemplo, a reacção de Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. reações de aglutinação de látex positivos e negativos. Preparações dos pneumocócica isolar misturado com o reagente de aglutinação em látex, mostrando uma reação positiva (A) ou uma reação negativa (B). Aglutinação acompanhada por compensação do fundo é visto na reacção positiva (A) .há nenhuma aglutinação de látex com o reagente de controlo negativo ou de uma reacção de teste negativo (B). Fotografias 8 usada com permissão.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica.

Capsular sorotipagem de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por aglutinação em látex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K visualizações.  Murdoch Childrens Research Institute.  Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica. 

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Imunologia e Infecção

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Bioquímica

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Transporte pneumocócica experimental humana

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Medicina

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

A sorotipagem capsular de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando o Reaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

Glicoconjugate homogêneo produzido por incorporação combinada de aminoácidos não naturais e click-química para fins de vacina

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Bioengenharia

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Ensaio opsono-adesão para avaliar anticorpos funcionais no desenvolvimento de vacinas contra bacillus anthracis e outros patógenos encapsulados

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

Construindo Mutantes na Cepa 519/43 do Streptococcus pneumoniae do Serotipo 1

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Capsular sorotipagem de

Resumo

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