This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Preparación de internos Reactivos de látex <ol><li> Preparación de glicina salina tamponada (GBS) <ol><li> Añadir 1,5 g de glicina, 11,7 g de cloruro de sodio y 100 ml de agua destilada a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml. </li><li> Mezclar para disolver utilizando un agitador magnético. </li><li> Transferir la mezcla a 500 ml cilindro de medición y añadir agua destilada para hacer un total de 200 ml. </li><li> Transferir la solución de nuevo a la taza de 200 ml, comprobar el pH y ajustar a 8,2 con hidróxido de sodio 5 M. NOTA: El hidróxido de sodio es corrosivo, usar equipo de protección personal. </li><li> Filtro de esterilizar la solución con 0,22 M filtros y varias jeringas 60 ml en una botella de vidrio ml preautoclaved tornillo de tope 250. </li><li> Guarde a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparación de GBS con 0,2% de albúmina de suero bovino <ol><li> Añadir 0,2 g de albúmina de suero bovino (BSA) en polvo y 100 ml de GBS a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml y mezclar para disolver utilizando un agitador magnético. </li><li> Filtroesterilizar la solución a través de filtros de 0,22 M utilizando varias jeringas de 60 ml en un ml preautoclaved tornillo de botella de vidrio cubiertas 250. </li><li> Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> La preparación de reactivo de látex <ol><li> Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior. NOTA: redondo tubos de fondo se utilizan para minimizar la sedimentación de partículas que pueden afectar el apego anticuerpo. </li><li> Con una pipeta P1000 con puntas estériles añaden 975 l de EGB en el tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir 25 l de antisuero neumocócica apropiado para el reactivo de látex está preparando (es decir, la piscina, grupo, tipo o factor). Invierta cinco veces para mezclar. </li><li> Diluir partículas de látex de poliestireno 1:10 añadiendo 120 l de partículas de látex para 1.080 l de solución salina fisiológica estéril. NOTA: Este puede hacerse en volúmenes más grandes, pero debe hacerse de nuevo cada vez que se producen los reactivos de látex. </li><li> Añadir 1,000 l de la suspensión de látex 1:10 (preparado en el paso 1.3.3) a los 1,000 l de suspensión 1:40 antisuero (preparado en la etapa 1.3.2). Invierta cinco veces para mezclar. </li><li> Incubar a 37 ° C en una rueda que gira lentamente (por ejemplo, 4 rpm para una rueda de 38,5 cm de diámetro) durante 2 horas. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 1100 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento en 2 ml de solución salina estéril. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 1100 x g. Descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de GBS y resuspender suavemente el pellet. </li><li> Pipetear la suspensión de látex en una etiqueta rosca de 5 ml tubo tapado. Agregar otro 1 ml de GBS. </li><li> Añadir 2 ml de GBS que contiene 0,2% de BSA (w / v) (pH 8,2) (preparado en el paso 1.2). Añadir 40 l de 10% (w / v) de azida sódica como conservante. NOTA: La azida sódica es peligroso en caso de inhalación, y es un irritante de la piel y los ojos. Es deseable comprar una solución preparada al 10% en lugar de la forma en polvo, ya que esto minimiza el riesgo de exposición por inhalación. Equipo de protección personal (guantes incluidos ungafas d salpicaduras) se deben utilizar para la manipulación de este reactivo. Consulte la hoja de datos de seguridad para obtener más información. </li><li> Reactivos de látex Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de látex control negativo <ol><li> Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior. NOTA: redondo tubos de fondo se utilizan para minimizar la sedimentación de partículas que pueden afectar el apego anticuerpo. </li><li> Con una pipeta P1000 con puntas estériles añaden 975 l de EGB en el tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir 25 l de antisuero de conejo normal. Invierta cinco veces para mezclar. </li><li> Proceda como en los pasos 1.3.3 al 1.3.10 arriba </li></ol></li></ol> 2. Control de Calidad (QC) de látex Reactivos <ol><li> Llevar reactivo de látex a RT. Inmediatamente antes de su uso, mezclar suavemente el reactivo de látex invirtiendo el tubo varias veces. </li><li> Compruebe reactivo para autoaglutinación pipeteando 15 l sobre un portaobjetos de vidrio y proceder como en los pasos 4.7 y 4.8 a continuación. No debe haber ungglutination de las partículas de látex. El reactivo debe aparecer en blanco y liso. </li><li> Pruebe el reactivo frente a un panel de pocos pases aislamientos de neumococo. Utilice las culturas recién crecido preparados como en el paso 3 El panel de cepas debería incluir aislamientos del serotipo &#39;target&#39; (el serotipo específico para el reactivo está probando) y serotipos &#39;no objetivo&#39; (cepas de otros serotipos que normalmente no debe cruzar reaccionar con el reactivo). Incluya al menos una cepa de cada objetivo y no objetivo serotipo para cada reactivo de látex someterse QC. Si sólo hay un objetivo o serotipo no objetivo, probar dos cepas diferentes del serotipo particular. NOTA: El panel de prueba debe incluir varios aislamientos de cada serotipo, algunos de los cuales son comunes en la enfermedad invasiva y / o colecciones de cultivos tipo. Es preferible incluir algún carro aislados, ya que a menudo son más exigentes al serotipo (datos no presentados), con lo que la prueba aún más la capacidad of los reactivos y asegurar que los reactivos son probablemente capaces de serotipificación tanto invasiva y el carro aislados. </li><li> Proceder con la prueba de reactivos de látex con neumocócica objetivo y no objetivo aislamientos según el método descrito en los pasos 3 y 4 a continuación. </li><li> Reactivos de control de calidad en el momento de la producción y al menos anualmente a partir de entonces. NOTA: Si un reactivo no pasa QC, el lote debe ser desechado y una nueva preparación hecha. En el caso de fallo de repetición QC recomendamos los reactivos pueden producir usando los métodos alternativos descritos en Ortika et al., 2013 8 y en la discusión a continuación. </li></ol> 3 Preparación de las Culturas antineumocócicas para Serotipificación <ol><li> Utilizando un asa estéril seleccionar una sola colonia de la antineumocócica aislar y consecutivas esto en un sólido de agar sangre no selectivo de modo que el inóculo primario cubre aproximadamente un tercio de la superficie de la placa. Racha de colonias individuales. NOTA: Las placas preparadas a partir de caballo desfibrinada o sangre de oveja son adecuados; pero las placas de sangre preparadas con sangre humana o sangre de animal tratado con citrato no lo son. </li><li> Incubar la placa O / N a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. </li><li> Observar el crecimiento en la placa por la pureza y evaluar que hay un crecimiento suficiente para serotipificación. NOTA: Un cultivo puro de la cepa neumocócica es necesaria para la serotipificación. En nuestra experiencia, confluente, o cerca de la confluencia de crecimiento que cubre aproximadamente un tercio de la superficie de la placa es generalmente suficiente para completar la serotipificación. Como las culturas neumocócicas pueden ser propensos a la autolisis, cultivos preparados para serotipificación deben probarse dentro de las 24 horas de la subcultura. No tome la placa de cultivo de la incubadora más de 15 a 20 min antes de que comience el serotipado. </li></ol> 4. Realización Serotipificación látex aglutinación <ol><li> Retire todos los reactivos de látex de la nevera y deje que alcancen la temperatura ambiente durante aproxmadamente 30 min. Inmediatamente antes de su uso, invertir suavemente los tubos para mezclar los reactivos. </li><li> Etiquetar un portaobjetos de microscopio. </li><li> Coloque 15 l de reactivo de látex de control negativo en el portaobjetos de un microscopio. </li><li> El uso de un bucle de 1 l desechable estéril tomar un barrido de la cultura neumocócica manera que el bucle es de aproximadamente la mitad. </li><li> Manchar suavemente el inóculo sobre la superficie de la corredera cerca de la gota de reactivo de látex control negativo. El inóculo debe ser visible en el portaobjetos de vidrio. </li><li> Rápidamente ya fondo mezclar el inóculo en el reactivo de látex control negativo utilizando el bucle. Asegúrese de que la caída no se propaga más allá de su tamaño inicial. </li><li> Recoge la diapositiva, sujetándola por ambos extremos. Rock the slide de ida y vuelta durante 1 min. Tenga cuidado para que el líquido se mueve lentamente, y asegurarse de que el tamaño de la gota no aumenta. NOTA: Como alternativa, utilice un rockero plato. </li><li> Observar la aglutinación macroscópica (es decir, pora simple vista) y la limpieza de la suspensión contra un fondo negro. </li><li> Si el reactivo de látex de control negativo no muestra aglutinación o compensación continuar probando la cultura, en sustitución de los reactivos de látex de prueba para el reactivo de látex de control negativo en los pasos 4.1 a 4.8 anteriormente. Un bucle fresco debe ser utilizado cada vez. Proceda con la prueba de los reactivos de látex que comienzan con las piscinas. </li><li> Pon a prueba cada uno de los reactivos de látex &#39;pool&#39; en la serie hasta que se obtenga un resultado positivo. NOTA:. El orden de las pruebas de las piscinas se pueden hacer en &quot;rounds&quot; para reflejar la incidencia local de serotipos particulares (por ejemplo, mediante pruebas de las tres piscinas más probables en la primera diapositiva Si no se obtiene una reacción positiva, entonces prueba los próximos tres más probable de las piscinas restantes de la segunda corredera, y así sucesivamente hasta que se obtiene una reacción positiva). Esto asegura que los serotipos más comunes se prueban primero, minimizando el tiempo y reactivos necesarios. </li><li>Uso de la tecla del fabricante antisueros determinar qué antisueros individuales están representados en el grupo positivo. </li><li> Pon a prueba cada uno de los grupos o tipos que figuran en la piscina positivo individual para determinar el &#39;grupo&#39; o &#39;tipo&#39; como en los pasos 4.1 a 4.8 anteriormente. </li><li> Determinar el resultado por referencia a la tecla del fabricante antisueros. Si se determina que un &quot;tipo&quot; (por ejemplo, el serotipo 5), entonces no se necesita más pruebas y este resultado se registra. </li><li> Si se determina que un &quot;grupo&quot; (por ejemplo, grupo 19), a continuación, hacer referencia a la clave de los fabricantes para determinar los factores que deben ser evaluados. Continuar las pruebas con los reactivos de látex individuales &#39;Factor&#39; y determinar el serotipo final (por ejemplo, el serotipo 19B). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación neumocócica. Neumocócicas reactivos de aglutinación de látex comerciales están disponibles, pero en la actualidad no diferencian todo neumocócica conocida serotipos 10,12. Sin embargo, los reactivos de aglutinación de látex pueden ser fácilmente producidos en la empresa utilizando antisueros comprado levantado contra los antígenos capsulares de neumococos específicos. En el método descrito aquí, los anticuerpos se unen a pasivamente partículas de látex para hacer un conjunto de reactivos de aglutinación de látex. Una reacción positiva de látex se produce cuando los anticuerpos específicos unidos a las partículas de látex se unen a antígenos en la cápsula de polisacáridos del neumococo aislar 18,19. Las partículas de látex unidos a los anticuerpos permiten la reacción específica antígeno-anticuerpo para ser visualizado sin aumento. Aglutinación de látex es un método adecuado para laboratorios de alto rendimiento de unD también para entornos de escasos recursos. Principales ventajas del método de aglutinación de látex son que no se requiere equipo especializado para realizar la prueba, los reactivos tienen una vida útil de al menos 2 años cuando se almacena a 4 ° C 8, y que es barato, sencillo y rápido de realizar. Serotipificación un aislado neumocócica por aglutinación de látex tarda aproximadamente 10 min, y hasta cuatro reactivos de látex se puede probar en paralelo por una diapositiva. Además, si la prevalencia de los serotipos es conocido por el ajuste epidemiológica pertinente, las pruebas pueden llevarse a cabo en rondas empezando con las piscinas que contienen los serotipos más comunes de manera similar a la prueba de Quellung 17. Este enfoque minimiza el número de ensayos necesarios para determinar el serotipo. El método también es altamente reproducible entre diferentes operadores (datos no presentados). Una desventaja de la serotipificación de aglutinación del látex es que la producción de los reactivos es mucho tiempo, teniendo aproximadamente 4 horas; aunque múltiples ReageNTS puede ser fácilmente producido en paralelo. Además, algunos antígenos son comunes a través de diferentes serotipos de neumococo, resultando en reacciones cruzadas con algunos antisueros (por ejemplo, el serotipo 29, 42 y el Grupo 35). Sin embargo, estas reacciones cruzadas están bien caracterizados utilizando antisueros comerciales (que generalmente se preabsorbió para eliminar los anticuerpos de reacción cruzada más problemáticas) y tablas de reacción adicionales se proporcionan por el fabricante con el fin de distinguir qué serotipo está presente. Reactivos de látex también pueden cruzar reaccionar si los anticuerpos no están alineados correctamente en las partículas de látex; éstos son detectados como fallas de control de calidad. En nuestra experiencia, riguroso control de calidad es fundamental para el éxito de este método, incluso cuando se utilizan antisueros disponibles comercialmente para la producción. QC tarda aproximadamente 15 min por reactivo y se basa en un conjunto de control de calidad apropiado aislados como se describe anteriormente. El método aquí descrito da lugar a reactivos que dan una reacción positiva así widelgada el periodo de prueba. En nuestra experiencia, los falsos positivos son raros en la práctica (datos no mostrados). Se observan reacciones negativas falsas ocasionales; por lo general se relacionan con problemas conocidos con un antisuero en particular (por ejemplo, el serogrupo 6 aislados no pueden reaccionar con piscina B antisuero), o regulación a la baja de la expresión de la cápsula por el aislado. Usando el algrorithm serotipificación proporcionado por el fabricante es también importante, ya que en la mayoría de los casos una reacción positiva o negativa falsa dará lugar a un resultado &quot;extremo ciego &#39;. En estos casos, y cuando las reacciones son difíciles de interpretar, se recomienda repetir la prueba-y / o ensayo por un método alternativo tal como la reacción de Quellung. Algunos de solución de problemas en ocasiones se requiere para hacer los reactivos de látex satisfactorios. En el método descrito aquí, el anticuerpo se une a partículas de látex a través de adsorción pasiva 15,19, por lo que una variable crítica es la concentración de anticuerpo utilizado, que determina qué tan bienla superficie de las partículas de látex se cubre y la posterior alineación de los sitios activos de anticuerpos 15,20. En consecuencia, si el exceso de anticuerpo insuficiente o está unido a las partículas de látex, las reacciones antígeno-anticuerpo no será óptima, y los reactivos pueden ser insatisfactorios producido 15,20,21. Como los títulos de anticuerpos varían entre los diferentes lotes de antisueros, un conjunto estándar de diluciones puede no producir los reactivos que se desempeñan bien 8. Un punto de partida útil es el uso de una dilución 1:40 de antisuero, y si esto no tiene éxito, diluir el antisuero más. En nuestra experiencia, esto generalmente se resuelve el problema 8. En un pequeño número de casos reactivos pueden mostrar aglutinación débil que no vaya acompañado de la limpieza de la suspensión cuando se prueba con destino aísla. En estos casos diluir el antisuero no mejora la calidad del reactivo, pero los reactivos satisfactorios por lo general pueden ser producidos por la omisión de la centrifugación y etapas de lavado 8,22 </sup&gt;. Partículas de látex recubiertas de anticuerpo se utilizan comúnmente en microbiología de diagnóstico para la detección, identificación o el serotipado de muchos microbios diferentes 15,20. Como tal, el método descrito aquí puede ser adecuado para la preparación de reactivos de látex para otros fines, siempre antisueros adecuado está disponible y los procedimientos de control de calidad adecuados son adoptados.

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los niños menores de cinco años de edad, sobre todo en entornos de escasos recursos en todo el mundo 1,2. Rangos de enfermedad neumocócica de infecciones localizadas a condiciones que amenazan la vida tales como la neumonía, sepsis y meningitis 1,2. Más de 90 serotipos de neumococo se han identificado sobre la base de las diferencias en su polisacárido capsular 3. Las vacunas actuales se dirigen al polisacárido capsular y proporcionan protección contra los principales serotipos causantes de enfermedad invasiva 4. Serotipificación neumocócica aislamientos es importante para evaluar el impacto de la vacunación en el carro y la enfermedad, así como proporcionar información epidemiológica más amplia de 5,6. El método actual &quot;estándar de oro&quot; para la serotipificación neumocócica es la prueba Quellung, pero es mucho tiempo y requiere cierta habilidad para perform 7. Aglutinación de látex es un método serotipificación alternativa recomendada por la Organización Mundial de la Salud 7. Aglutinación de látex es rápido y fácil de realizar, y se emplea en muchos laboratorios en todo el mundo 8-11. Es importante destacar que, de aglutinación de látex ha demostrado una precisión comparable a la prueba Quellung para serotipificación neumocócica 10,12-14. En general, este método es ideal para entornos de escasos recursos, así como laboratorios de alto rendimiento. Reactivos de aglutinación del látex (&#39;reactivos de látex&#39;) son creados por la unión de anticuerpos a partículas de látex 15. En una reacción positiva, estas partículas marcadas se aglutinan en presencia de antígeno específico. Reactivos de látex comerciales están disponibles para un rango limitado de serotipos. Reactivos de látex también se pueden preparar en casa utilizando comercialmente disponibles antisueros 10. Las mezclas de antisueros (&#39;piscinas&#39;), así como antisueros específicos para s neumocócicaserogroups (por ejemplo, grupo 19), los serotipos individuales (por ejemplo, el serotipo 5), y a los antígenos específicos (&quot;factores&quot;, por ejemplo., factor de reconocimiento de serotipo 19A 19C) para definir aún más serotipos dentro de los grupos están disponibles 16. Este manuscrito describe los pasos principales en la producción de reactivos de látex utilizando fijación pasiva de antisueros disponibles comercialmente a las partículas de látex. Se describen los controles de calidad (QC) aspectos de este método, y un protocolo para el uso de reactivos de látex para la serotipificación neumocócica está incluido.

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Una reacción positiva de látex se produce cuando el anticuerpo específico del tipo unido a la partícula de látex se une a la cápsula del neumococo, y la aglutinación de las partículas de anticuerpo marcado se produce 15. Figura 1A muestra una reacción positiva que se caracteriza por aglutinación visible y la limpieza de los antecedentes suspensión. Una reacción negativa se caracteriza por la suspensión de reactivo de aglutinación de látex blanco restante suave y (Figura 1B). Los reactivos se optimizan de manera que una reacción positiva se debe observar antes de que el final del intervalo de tiempo de un minuto (normalmente detectable en aproximadamente 20 segundos). No se recomienda la lectura de las reacciones después del intervalo de tiempo de 1 min. Muy ocasionalmente, reacciones muestran aglutinación débil alrededor del borde de la gota que no vaya acompañado de la limpieza de la suspensión de fondo, o aparece &#39;viscosa&#39; sin compensación fondo (datos no mostrados). Estos son como más<html> reacciones negativas ly. En tales casos, se recomienda volver a probar y / o una mayor investigación utilizando otro método serotipificación (por ejemplo, la reacción de Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. reacciones de aglutinación de látex positivos y negativos. Preparaciones del neumocócica aislamiento natural mezclaron con el reactivo de aglutinación de látex que muestra una reacción positiva (A) o una reacción negativa (B). Aglutinación acompañado por compensación de los antecedentes se ve en la reacción positiva (A) es .There aglutinación no visible con el reactivo de control negativo o de látex en una reacción negativo de la prueba (B). Fotografías 8 usan con permiso.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Pruebas de aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación Streptococcus pneumoniae, y también ha sido ampliamente aplicada en microbiología de diagnóstico. Este manuscrito describe la producción interna de los reactivos de aglutinación de látex, procedimientos de control de calidad y la aplicación de esta técnica para la serotipificación neumocócica.

Capsular Serotipificación de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por partículas de látex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K vistas.  Murdoch Childrens Research Institute.  Pruebas de aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación Streptococcus pneumoniae, y también ha sido ampliamente aplicada en microbiología de diagnóstico. Este manuscrito describe la producción interna de los reactivos de aglutinación de látex, procedimientos de control de calidad y la aplicación de esta técnica para la serotipificación neumocócica. 

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Investigación

Inmunología e Infección

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Bioquímica

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Carriage Experimental neumocócica Humanos

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Medicina

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsular serotipificación de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de la Reacción Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualización de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

Glycoconjugate homogéneo producido por la incorporación combinada de aminoácidos antinaturales y la química de clics para fines de vacunas

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Bioingeniería

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

Construcción de mutantes en el serotipo 1 Streptococcus pneumoniae cepa 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Capsular Serotipificación de

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