Name: dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis
Uploaded: 2017-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis at JoVE.com

The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo são aprovados pela Universidade Keio Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC - número de aprovação: 09.221) e siga as orientações institucionais em Experimentação Animal da Universidade Keio para o uso de animais em pesquisa. amostras humanas foram isoladas de um cadáver doado ao Departamento de Anatomia da Faculdade de Medicina da Universidade de Keio, e foram utilizados de acordo com os regulamentos institucionais. 1. Isolamento de Auditivo Bulla e Capsule <ol><li> Euthanize camundongos em um frasco contendo uma plataforma acima toalhas de papel embebido em isoflurano ou sevoflurano até ventilação respiratória cessa por mais de um minuto e, em seguida, executar deslocamento cervical. Tenha cuidado para evitar o contato direto de camundongos com as toalhas de papel embebido. </li><li> Faça uma pequena incisão transversal no lado dorsal do pescoço e puxar a pele para além em direção a cabeça ea cauda usando as duas mãos para expor mu pescoço subjacentetecido LECS. </li><li> Decapitar os ratos na região cervical 14 cm usando tesouras cirúrgicas afiadas. </li><li> pele casca completamente em direção ao nariz. Cortar toda a pele, juntamente com o focinho e incisivos. </li><li> Insira tesouras na boca e cortar músculos masseter em ambos os lados. </li><li> Abrir a garra com cuidado e retire a língua e mandíbula inferior juntos. </li><li> Usando uma tesoura afiada, crânio da separação e da base do crânio em duas metades ao longo do plano sagital médio (Figura 1A, B). </li><li> Utilizando uma pinça, retire os hemisférios cerebrais e cerebelo e tronco encefálico. A bula auditiva e da cápsula estão localizados lateralmente ao cerebelo e tronco cerebral. Note-se que a bolha auditivo é ainda mais lateralmente à cápsula auditiva (figura 1C, D). </li><li> Dissecar a bula e da cápsula com o osso do crânio circundante (Figura 1E). </li><li> Transfira a amostra para um prato contendo fosfato-salino tamponado (PBS) pH 7,4, à TA. </li><li> vocênder uma dissecação microscópio binocular, utilize uma pinça para separar os ossos e tesouras circundantes para cortar o limite solta ao redor da bolha e da cápsula (Figura 1F). Os ossos ao redor removidos são o basioccipital (fronteira ventral), exoccipital (fronteira ventro-posterior), supraoccipital (borda posterior), parietal (fronteira dorsal) interparietal, esquamosal (fronteira dorso-anterior), alisphenoid (borda anterior) e basiesfenóide (beira antero-ventral) ossos. Note-se que o processo styliform (SP), que apoia a abertura timpânica da trompa de Eustáquio 41, é distinto do processo estilóide do osso temporal. </li></ol> 2. Isolamento de Auditivo Ossículos: martelo, bigorna e estribo <ol><li> Martelo <ol><li> Utilizando as duas pequenas tesouras e pinças, remover a parte da lateral do canal auditivo externo para o sulco timpânico de modo que a membrana timpânica é visível (Figura 2A, B). </li><li> Remover parte da membrana timpânica e osso timpânico perto do malleal processus brevis (apófise orbicular, ver Discussão), tanto no ventral (pontilhada) e posterior (#) paredes (Figura 2C). O músculo do tímpano martelo e tensor deve agora ser exposto (Figura 2D, E). </li><li> Levantar o martelo (Figura 2F) e cortar o músculo tensor do tímpano com a borda chanfrada de uma agulha G 27 (Figura 2G). Note-se que o manubrium malleal fixado firmemente à membrana timpânica, como é visto em outros mamíferos. </li><li> Retire a membrana timpânica cuidadosamente do manubrium, que é frágil. Retirar o osso timpânica para revelar os três ossículos auditivos. </li><li> Deslocar o martelo da bigorna na articulação ossicular (Figura 2H). </li><li> Isolar o martelo pela fratura do processo anterior, no goniale. </li></ol></li><li> Bigorna e estribo <ol><li> isolar tele bigorna, cortando o ligamento posterior da bigorna no curto crus (Figura 3A). </li><li> Isolar o estribo, cortando a artéria estapediano perto do estribo com a borda chanfrada de uma agulha G 27 (Figura 3B, C). Se necessário, cortar o tendão do músculo estapédico no processo muscular do estribo com a agulha. </li><li> Inserir uma agulha de costura (ou um pino de marcação) no forame obturador do estribo e levante o estribo. Depois de remover o estribo, a abertura da janela oval deve ser claramente visível (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 3. Incorporação de Auditivo Bulla e Capsule <ol><li> Preparação para a incorporação em blocos de parafina <ol><li> Isolar a bula e da cápsula como descrito na Seção 1. </li><li> Cortar a extremidade anterior da bolha (o processo styliform) para fora com uma tesoura, e mergulhar a bula cápsula em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS a 4 °C, e permitir que o fixador para entrar na bula. Se o ar fica preso na bula, removê-lo com uma agulha e seringa. Deixar a bula e cápsula no fixador a 4 ° CO / N num rotor tubo. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> Lavar uma vez com PBS. </li><li> Descalcificação bula e da cápsula por uma semana a 4 ° C em 10% de di-hidrato de sal de dissódio do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-2Na), 100 mM de base Tris, pH 7,0, num tubo de 2 mL. Alterar o buffer a cada dois dias. </li><li> Lavar uma vez com PBS. As amostras podem ser armazenadas em 70% de etanol em água a 4 ° C. Opcionalmente, a transferência para 70% de etanol através de uma série de álcoois graduados (30%, 50%, 70% em água). </li><li> Num processador de tecido, desidratar as amostras numa série graduada de soluções de etanol (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, cada um 1H), claras em xileno (4x, cada 1 h a 40 ° C), e infiltrar-se amostras com a cera de parafina fundida 42. Opcionalmente, xileno substituto com clearin tecido comercialg de solução (por exemplo, histo-claro). </li><li> Descarregar amostras do processador, e removê-los de suas fitas cassetes. </li><li> Em um sistema de console de tecido a incorporação, lugar espécimes em moldes cheios de cera de parafina derretida. Prossiga para a incorporação (Seção 4). </li></ol></li><li> Preparação para inclusão em blocos congelados (método de filme de Kawamoto) 43 <ol><li> Isolar a bula e da cápsula como descrito na Seção 1. </li><li> Cortar a extremidade anterior da bolha (o processo styliform) para fora com uma tesoura, e mergulhar a bula cápsula em fixador (2% ou 1% de PFA em vez de 4% em PBS para preservar a antigeni cidade) a 4 ° C. Se houver ar preso em bula, removê-lo usando uma agulha e seringa. Deixar a bula e cápsula no fixador a 4 ° CO / N num rotor tubo. </li><li> Lavar bula e cápsula rapidamente em PBS e mergulhar imediatamente no composto de crio-incorporação líquido a 4 ° C. </li><li> Importante: Remova as bolhas de ar se houver no meioe ouvido externo através de aspiração por uma agulha, e por adição do composto com a incorporação de uma pinça. Prossiga para a incorporação (Seção 4). </li></ol></li></ol> 4. Orientação Sample and Embedding NOTA: O conjunto bula e cápsula deve ser providenciado com uma orientação particular, durante a incorporação de cortar secções desejadas. Os procedimentos descritos abaixo são utilizados para secção o martelo em várias orientações. <ol><li> Longitudinal (parasagittal) de corte do martelo <ol><li> Coloque o lado lateral da bula ou conduto auditivo externo para baixo em parafina quente (ou composto-incorporação crio). Ajustar a orientação de modo que o pescoço e transversal lâmina do martelo são paralelas ao fundo horizontal do prato de encastre (Figura 4A - C). Note-se que a membrana timpânica é inclinado segundo um ângulo de aproximadamente 30 ° em relação à vertical na cabeça de rato (Figura 4A; Figura 59 em Kampen <suP&gt; 44). </li></ol></li><li> Corte horizontal do martelo <ol><li> Coloque a crista dorsal horizontal em parafina quente (ou composto-incorporação crio). Ajustar a orientação da bolha e da cápsula de modo que o pescoço e transversal lâmina do martelo são perpendiculares ao fundo do prato de encastre (Figura 4D - F). </li></ol></li><li> Seccionamento Frontal (secções transversais) do manúbrio e da membrana timpânica 5 <ol><li> Coloque a manubrium malleal em parafina quente (ou compostos à incorporação de crio) de tal modo que é perpendicular ao fundo do prato de incorporação. </li></ol></li><li> Arrefecer o bloco a temperaturas adequadas para endurecer a cera de parafina em um sistema de console tecido incorporação (em alternativa, usar composto incorporação crio em um banho de gelo seco / hexano). </li><li> bloco de tecido processo e seções de corte utilizando procedimentos de rotina. Por exemplo, seções mancha de parafina com hematoxilina e eosina (H &amp; #38; E), safranina O (para a cartilagem), ou para a actividade de fosfatase ácida (TRAP) resistente a tartarato (por osteoclastos) 3, ou por imuno-histoquímica. Criosecções descalcificadas são adequados para rotulagem óssea usando fluorocromos 14, alizarina para o cálcio, e imunofluorescência 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui, apresentamos um método útil para isolar a bula auditiva e cápsula em ratos pós-natais. Antes da P12, os tecidos são frágeis e podem ser danificados durante o isolamento. Após P12, o bula auditiva e da cápsula pode ser facilmente isolado a partir de tecidos circundantes. Dissecando a bula da cabeça antes do corte tem várias vantagens. Em primeiro lugar, cavitação pós-natal e do crescimento da bula auditiva ocorrer mais ativamente da P6 em diante e são completos por P14 50. O tecido mesenquimal entre a membrana timpânica e parede coclear é substituído por ar através do processo de cavitação. O ar resultante na cavidade do ouvido médio pode impedir o contato entre os tecidos e líquidos durante a fixação, descalcificação e incorporação. É mais fácil para remover o ar da bula auditiva isolada, cortando o final (processo styliform) anterior ao invés de tentar fazê-lo na bula não isolado. Em segundo lugar, a orientação do martelo (e a membrana timpânica) não é verticalna cabeça. É, portanto, mais fácil de secção do martelo em planos desejados pela incorporação da bula auditiva isolada e cápsula em uma determinada orientação. Uma vez isolado, bula auditiva e cápsulas são úteis para numerosas análises. Por exemplo, de alta resolução de raios-X micro-CT pode revelar morfologia microestrutura do osso, tais como capilares osteogênicos no martelo 14. O microscópio de dissecação stereofluorescence é uma ferramenta poderosa para avaliar visualização das estruturas em ratinhos que expressam proteínas fluorescentes do repórter no ouvido médio ou interno 33. Além disso, pode ser realizada uma variedade in vivo ou ex vivo de fluorescência métodos de marcação e detecção de imunofluorescência de montagem inteira. A microscopia de fluorescência folha de luz também é útil para a análise tridimensional 51. Embora não seja descrito aqui, diversas estruturas anatômicas associado com a bula auditiva e da cápsula, como os nervos periféricos, vasos sanguíneos, emembrana timpânica no ouvido médio também pode ser avaliada usando esse protocolo. Note-se que o seccionamento de parafina requer descalcificação do tecido ósseo antes de incorporação e, portanto, não permite a análise de mineralização. Em contraste, o método de Kawamoto filme 43 usado para preparar secções congeladas pode ser realizada sem descalcificação e é adequado para estudos de mineralização utilizando técnicas de rotulagem de osso in vivo ou coloração especial, tais como coloração Alizarina. condições Cryo-seccionamento deve ser otimizada de acordo com base na idade mouse. Por exemplo, uma temperatura inferior fresco no interior da câmara criostato é recomendado para amostras mais velhas do rato para minimizar os danos para as secções. No rato, o termo correto para a protuberância semi-esférica de destaque do martelo é &quot;apófise orbicular&quot;. No entanto, o termo &quot;processus brevis&quot; tem sido amplamente utilizada para indicar a apófise orbicular para mais thum duas décadas, especialmente entre rato biólogos do desenvolvimento 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; originalmente se referia ao processo lateral (processus lateral), que difere da apófise orbicular. Em seres humanos, um processo lateral semelhante a uma ligeira projecção cónica forma geral a linha de ligação à membrana timpânica, que se estende a partir da fúrcula (não visto na Figura 6B, vista medial). Em ratinhos, o processo lateral é também uma projecção do manubrium na extremidade oposta ao umbo 48. Os pars flácida da membrana timpânica está acima do processo lateral do martelo. apófise orbicular não é aparente no martelo humano.

Os três ossículos auditivos do ouvido médio, ou seja, martelo, bigorna e estribo, formam uma cadeia auditiva específica de mamíferos que transmite som a partir da membrana timpânica ao ouvido interno, ou cóclea 1,2. Função auditiva pode ser avaliada em ratos medindo Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) limiares 3-6, e vibração do martelo atrás da membrana timpânica pode ser monitorado usando Laser Doppler vibrometria (LDV) 7. Ao combinar ABR, LDV e medidas Produto de Distorção de Emissões Otoacústicas (EOAPD), perda auditiva condutiva pode ser discriminado de deficiência neurossensorial 8. são necessários modelos animais de condições de orelha, dada a importância da audição e a saúde do ouvido para o bem-estar dos pacientes de todas as idades. Por exemplo, otite média é uma infecção no ouvido extremamente comum visto em lactentes e crianças humanas, e, otite média aguda grave e suas complicações podem ocorrer se a condição não for tratada com antimicrobianos apropriados 9. Modelos de rato de otite média pode ser útil na compreensão da patogênese e no desenvolvimento de tratamentos 10,11. Ossículos murino, que (com excepção da parte goniale do martelo) são formados por ossificação endocondral 12,13, são altamente relevantes para o estudo do metabolismo ósseo e morfogênese. Em primeiro lugar, seu pequeno tamanho permite a análise de alta resolução de ossos com um periósteo intacto usando raios-X ou microscopia de fluorescência 14. Em segundo lugar, o metabolismo ósseo anormal, como a reabsorção óssea excessiva ou deficiente, ou interações deficientes entre as células ósseas 15, pode ser analisado como um contribuinte potencial de perda auditiva 3,4,7. Em terceiro lugar, a morfogénese ossículo anormal é relatada em vários ratinhos deficientes em genes, tais como animais que faltam Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, os receptores da hormona da tiróide (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 e outros 1,31, ou em camundongos com superexpressão Hoxa2 32. Finalmente, apesar de seu pequeno tamanho, estruturas associado com ossículos, como músculos e articulações 33 34,35 são acessíveis. ossículos do rato são menores do que ossículos humanos, mas é digno de nota que a orelha média do rato não é uma versão em miniatura de sua contraparte humana. Por exemplo, em ratos, a artéria estapediano, que passa através do anel do estribo, persistir ao longo da vida 36, enquanto que em seres humanos, a artéria estapediano embrionária desaparece durante a gestação. Além disso, a morfologia do martelo do rato difere da do the osso humano (ver Figura 6). Em camundongos, a bula auditiva (timpânica) encerra a cavidade do ouvido médio cheio de ar, enquanto que em seres humanos, as células aéreas da mastóide compostas de osso trabecular no osso temporal abriga os ossículos, em vez de uma bolha 37. Em ambas as espécies, a cápsula auditiva (cápsula ótica, labirinto ósseo) encerra a cóclea e canais semicirculares do ouvido interno. Biologia comparada e evolutiva do ouvido médio tem sido extensivamente revisado 38-40. O protocolo fornecido abaixo primeira descreve como dissecar a bula auditiva e cápsula, que consistem principalmente de orelha média e orelha interna, respectivamente. Este protocolo também demonstra como isolar o martelo, bigorna e estribo da bula auditiva. Finalmente, ele mostra como orientar a bula auditiva e da cápsula para embutir em preparação para o seccionamento de tecidos de ossículos auditivos.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Glass Jar</td><td>Various</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>14 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Extra fine scissors-straight</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine Forceps Angled 45&lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>for routine dissection</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>for movies&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection needle 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Marking Pin</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blade</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Stainless containers</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Silane coated slide (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue Embedding Console System</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&amp;nbsp;</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sliding microtome for paraffin</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Path Blade+pro for hard tissue</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>for paraffin section</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Various</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin&amp;nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

Na maioria dos mamíferos, ossículos auditivos no ouvido médio, incluindo o martelo, bigorna e estribo, são os menores ossos. Nos ratos, uma estrutura óssea chamada a bula auditiva abriga os ossículos, enquanto a cápsula auditiva envolve o ouvido interno, ou seja, a cóclea e canais semicirculares. ossículos murino são essenciais para a audição e, portanto, de grande interesse para os pesquisadores da área de otorrinolaringologia, mas seu metabolismo, desenvolvimento e evolução são altamente relevantes para outros campos. Metabolismo ósseo alterada pode afetar a função auditiva em ratos adultos, e vários ratos gene deficiente mostram mudanças na morfogênese dos ossículos auditivos no útero. Embora ossículos auditivos murino são minúsculos, sua manipulação é viável se se compreende a sua orientação anatômica e estrutura 3D. Aqui, descrevemos como dissecar a bula auditiva e cápsula de ratos pós-natais e em seguida isolar ossículos individuais através da remoção de parte da bula. Nós também discutir como emcama da bolha e da cápsula em orientações diferentes para gerar parafina ou secções congeladas adequados para a preparação de secções longitudinais, horizontais, ou frontais do cabo do martelo. Finalmente, enumerar as diferenças anatômicas entre mouse e ossículos auditivos humanos. Estes métodos seriam úteis na análise dos aspectos patológicos, de desenvolvimento e evolutivas de ossículos auditivos e da orelha média em camundongos.

Este protocolo apresenta um método para isolar ossículos do rato bula auditivo. Em primeiro lugar, a bolha e cápsula são dissecados como uma peça única a partir do crânio (Figura 1). A bula dissecado é então utilizado para preparar o martelo (Figura 2) e a bigorna e estribo (Figura 3). Marcos da bula auditivo e cápsula são o processo styliform na extremidade anterior da bolha, a crista dorsal, do canal semicircular anterior, e a fossa subaquata (Figura 1F). Tomografia (TC) Microcomputed revela ossículos na bula auditiva, bem como as orientações óptimas para seccionamento longitudinal e horizontal desses ossículos (Figura 4). Para realizar o corte de parafina longitudinal do martelo, a bula e cápsula foram descalcificadas em EDTA a 4 ° C durante uma semana, incorporado em um pabloco raffin na orientação mostrada na Figura 4 A - C, seccionados a 4 mm, e em seguida corados com H &amp; E. O martelo ligado à membrana timpânica na bula auditiva revelou ossificação endocondral em curso no P14 (Figura 5A). Para visualizar a nova formação óssea, calceína (30 mg / g de peso corporal) foi peritoneal injetado em um rato P20 e bula e da cápsula foram isolados 24 h mais tarde, no P21. A amostra sem descalcificação foi incorporado congelada e, em seguida, criosseccionada a 6 uM, utilizando uma película adesiva com base no método de Kawamoto 43. Depois de coloração nuclear com DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole), a secção foi observado sob um microscópio de fluorescência. Sinais calceína (verde) revelou neoformação óssea no martelo (m), bula e na cápsula (Figura 5B). Para realizar o corte horizontal do martelo, a bula auditivo isolado a partir de um ratinho com 5 semanas de idade, foi incorporado congelado sem descalcificação (para oOrientação veja a Figura 4D - F), criosseccionada a 6 mm utilizando o método de Kawamoto, e corados com H &amp; E. Corte horizontal da brevis malleal processus (MPB) também mostra a cóclea (Figura 5C). Uma visão medial dos ossículos auditivos certos isolados de um rato P31 mostra características típicas do martelo mouse (ou persa 45 espada-like) manubrium, um processus brevis proeminente (apófise orbicular ou seja, o &quot;delta-gaivota-asa-como&quot; , ver discussão), e a lâmina transversal (Figura 6). Note-se que o processo anterior (processus anterior) foi fracturada no procedimento de dissecção em torno do goniale e foi separada a partir do anel timpânica (ectotimpánico). Esta amostra representativa exibe uma joint incudomalleolar intacta entre o martelo ea bigorna, enquanto a joint incudostapedial é deslocado. inserções tendinosas e na mallealprocessos musculares estapedianos são detectáveis (Figura 6A, asteriscos). Figura 6B compara mouse e ossículos auditivos humanos com a mesma ampliação. diferenças entre as espécies, com excepção de tamanho, incluem o seguinte. O manubrium malleal é ala-como em ratos, mas semelhante a um clube em seres humanos. O ângulo entre o eixo anatómico (ou o eixo de rotação, a linha através do processo anterior do martelo e a curta da bigorna) e a fúrcula é muito menor em ratinhos e os dois são quase paralelas, em oposição a aproximadamente perpendicular em seres humanos 6,46-48. Em ossículos humanos, estudos vibrometric revelam que a joint incudo-maleolar é móvel ao invés de funcionalmente fixo 49. O martelo do mouse exibe uma ampla, fina e plana da lâmina transversal não aparente em humanos 47. Em ratinhos, o anterior processus funde a ossos membranosos, ou seja, a goniale e o tímpanoC anel, enquanto que em humanos a anterior processus é reduzida a um pequeno espícula de osso 41. O estribo de ratos e seres humanos também é diferente: em ratos, o crus anterior é curvo e crus posterior é mais direto ao passo que nos seres humanos, o crus anterior é mais direto do que o crus posterior. Vale a pena notar que a cabeça do martelo em relação ao tamanho do corpo é maciçamente ampliado em espécies como a toupeira de ouro, o que demonstra variabilidade significativa nas relações alométricas de &quot;os mais pequenos&quot; ossos 48. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Figura 1. Dissecção da Auditivo Bulla e Capsule. (A) O crânio de um rato P31 é dividido em direito e metades esquerda. Um, anterior; P, posterior; G, para a esquerda; R, direita. (B) face medial da metade direita do, cabeça pele cortada. Cx, córtex cerebral; Cb, cerebelo; Bs, brainstem. D, dorsal; V, ventral. (C) Remoção de cérebro com uma pinça. (D) Vista medial da cápsula auditiva no crânio direita. A crista dorsal (setas) fica entre a fossa média craniana (mcf) e da fossa posterior do crânio (PCF) e separa dorso-superfícies anterior e ventro-posterior da cápsula auditiva. barra de escala, 2 mm. (E) Maior ampliação da bolha auditiva e da cápsula (vista medial). Co, cóclea; VII, do nervo facial; VIII, vestibulocochlear nervo; AC, anterior (superior) canal semicircular; Sf, fossa subaquata, que abriga o paraflóculo cerebelar. barra de escala, 1 mm. (F) Micrografia da bula auditiva isolada e cápsula (vista medial). Sp, processo styliform. barra de escala, 1 mm. (A - E), rato P31. (F), rato P33. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Figura 2. Dissecção do Malleus. (A) vista ventrolateral de uma bolha auditiva direita e cápsula. O sulco timpânico (ST, a seta a tracejado) é o local de ligação da membrana timpânica. O lateral do osso para o ST é parte do ouvido externo, e medial óssea para o ST forma o fundo da cavidade do ouvido médio. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista após a remoção do canal auditivo externo para revelar a membrana timpânica (TM), incluindo os pars flácida (PF) e pars tensa (PT). (C) A remoção de partes do osso timpânico (linhas pontilhadas e #) perto do malleal processus brevis (MPB). m, martelo; mM, manubrium malleal. A seta, bolha de ar na cavidade do ouvido médio pode ser visto através da membrana timpânica. (D) do martelo exposto. cabeça do martelo é indicado. Pontilhadolinha indica a superfície articular da bigorna. (E) tendão do músculo tensor do tímpano (TT) ligado ao cabo do martelo. (F) O tensor do tímpano é puxado quando o martelo é levantado. *, Processo muscular. (L) tensor do tímpano é cortada usando uma agulha. (H) três ossículos auditivos após a remoção da membrana timpânica. A joint incudo-maleolar é deslocado. m, martelo; i, bigorna; s, estribo; Vá, goniale (fundido com o anel martelo e timpânica, TR). Todas as barras de escala, de 0,5 mm. (A, H), rato P33. (B - G), rato P31. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Figura 3. Dissecção da bigorna e estribo. (A) Incus eestribo após a remoção do martelo. A artéria estapediano (SA) passa através do estribo (s). A linha pontilhada indica a superfície articular da bigorna. Note-se que o curto crus (ICB, crus breve) da bigorna (I) é fixado pelo ligamento cruzado posterior (não mostrado). Asterisk, o processo muscular do estribo. (B) do estribo após a remoção da bigorna. ponta da agulha é usada para cortar a artéria estapediana (SA). Seta, direção do fluxo sanguíneo. A linha pontilhada indica a superfície articular do estribo. (C) A artéria estapediana é removido a partir do estribo. X indica a extremidade cortada da artéria estapédico (SA). (D) A janela oval (Ow, fenestra ovalis ou vestibuli fenestra) é visível após a remoção do estribo. RW, janela redonda (rotunda fenestra ou cochleae fenestra). Barras de escala, de 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Figura 4. Orientação do Auditivo Bulla e Capsule durante Incorporação para Longitudinal (parasagittal, A - C) e horizontal (D - E) Seccionamento do Malleus. (A - C) O pescoço e transversal lâmina do martelo está colocada paralelamente ao fundo do prato de incorporação. (A) Vista lateral: Imagem micro-CT para mostrar a incorporação do martelo direita na bula (pseudocolored azul). O martelo e bigorna são pseudocolored verde. A linha a tracejado, o plano de corte desejado. linha sólida, parte inferior da incorporação de prato. m, martelo; pontas de seta, dorsal da crista. M, medial; G, lateral; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista de cima: imagem Micro-CT. Note-se que a extremidade anterior da (processo styliform) bolha foi removida. i, bigorna. (C) Vista de cima: micrografia (tomado com umafiltro de cor). AC, anterior (superior) canal semicircular; Sf, fossa subaquata; Sp, processo styliform. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (D - F) O brevis processus do martelo é colocado perpendicular ao fundo do prato de incorporação. (D) Vista lateral: Imagem Micro-CT para mostrar a incorporação do martelo direita. A linha a tracejado, o plano de corte desejado. linha sólida, parte inferior da incorporação de prato. (E) Vista de cima: imagem Micro-CT. mM, manubrium malleal. (F) acima Ver: micrografia (tomado com um filtro de cor). Barras de escala, de 1 mm. Imagens micro-TC foram obtidos a uma resolução do voxel de 5 um, tal como descrito anteriormente 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Figura 5. Histologia. (A) coloração de H &amp; E. Longitudinal (parasagittal) seção do martelo parafinado direita (m) na bula auditiva (linha pontilhada) no P14. TM, membrana timpânica. Rotulagem óssea (B) calceína. corte longitudinal do, martelo congelada descalcificada esquerda (m) na bula auditiva no P21. Contracorante, DAPI. (C) coloração de H &amp; E. secção horizontal do brevis congelado, descalcificadas deixou malleal processus (MPB) na bula auditiva e da cápsula (mouse com 5 semanas de idade). Co, cóclea. Barras de escala, de 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Figura 6. Medial Vista do Auditivo ossículos. (A) ossículos auditivos direito de P31 mouse. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. barra de escala, 1 mm. malleus cabeça (Caput mallei, Capitulum mallei); pescoço (Collum mallei); lâmina (lâmina transversal); mM (Manúbrio mallei); asterisco preto (processo muscular do martelo); MPa (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); corpo da bigorna (Corpus incudis); ICB (breve Crus, short crus, processo curto); ICL (longum Crus, muito crus, processo longo); IPL (lenticularis Processus, processo lenticular, Sylvian apófise); cabeça do estribo (Caput stapedis); asterisco branco (processo muscular do estribo); SCA (anterius Crus, crus anterior); SCP (Crus posterius, crus posterior); base (stapedis Base, platina); SOF (forame obturador, forame intercrural). (B) ossículos auditivos direito de um 76-year-old fêmea humana (cortesia do Departamento de Anatomia da Faculdade Universidade Keio de Medicina). Os ossículos do rato P31 (inferior direito) são gravadas com a mesma ampliação que o utilizado para ossículos humanos. Curvsetas ed indicar o ângulo entre o eixo anatômico eo manubrium (linhas pontilhadas). barra de escala, 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissecção da Auditivo Bulla em ratos pós-natais: Isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K visualizações.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Vídeo: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Bioengenharia

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neurociência

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicina

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Crioseccionamento e imunocoloração do tecido do ouvido interno de camundongos: dos estágios embrionário ao adulto

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Biologia do Desenvolvimento

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Cirurgia de implante coclear e gravações de resposta eletricamente evocado auditivo do tronco encefálico em camundongos C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissecção do saco endolinfático de camundongos

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissecção do saco endolinfático de camundongos

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

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Resumo

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Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Dissecção do saco endolinfático de camundongos

Dissecção do saco endolinfático de camundongos