Os autores são gratos a H. Eisen, Gubbels M., K. van Grinsven, Guillen E., A. Drake, Mahajan V., Gao P. e G. Yap para discussões frutíferas e reagentes. Somos gratos a J. Dausman, Flannery R. e J. Jackson para a assistência com a gestão da colônia mouse. Somos gratos a P. Wisniewski para FACSorting. EMF foi apoiado pelo Programa Human Frontiers Science. RJ foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde concede RO1-HD045022 e R37-CA084198. HLP foi suportado por concessões do National Institute of Health.

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al. Ciência 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolamento de células do doador Antes T específicos ou células B podem ser usados ​​como células do doador para gerar modelos de ratos transnuclear, ratos precisam ser infectado por um patógeno de interesse ou imunizados com um antígeno de interesse. Uma vez que temos utilizado células CD8 + específicas para Toxoplasma gondii, o protocolo a seguir irá descrever a geração eo isolamento dessas células e precisa ser adaptado de acordo com interesses pessoais. <ol><li> Cistos são derivados de um homogenato de cérebro de rato (cerca de 40) são injetados intra-peritoneally em BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) camundongos, que permite o isolamento de ambos H-2 b e H-2 d restrito células T CD8 +. </li><li> No pico da resposta imune, o rato infectado é sacrificados, o baço isolados e colocados em um prato contendo 6 mL de glóbulos vermelhos (RBC) tampão de lise. </li><li> Usando os lados fosco de duas lâminas de cobertura, o baço é cuidadosamente chão e incubadas no tampão de lise RBC por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 14 mL PBS, filtrar a suspensão de células através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo de 50 mL falcon e centrifugar por 5 min a 300g. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 1 mL de PBS e transferir para um tubo Eppendorf 1,5 mL. Centrifugar por 5 min em 300g e remover o sobrenadante depois. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 50 mL PBS, adicione anticorpos fluorescente etiquetado para identificar o tipo de células de interesse (por exemplo, CD3, B220, CD8 e CD4), e fluorescente etiquetado MHC-I tetrâmero (MHC-II tetrâmero de células CD4 T) carregados com o peptídeo de interesse para a suspensão de células e incubar por 30 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1 mL de PBS, centrifugue por 5 min a 300 g, ressuspender sedimento em 3 ml de PBS, e filtrar a suspensão de células através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo. </li><li> Executar FACSorting definindo as portas rigorosamente (Figura 1B). </li></ol> 2. Transferência nuclear de células somáticas Existem alguns protocolos para somáticas. O aqui descrito faz uso de ovócitos preso em Metáfase II e da inibição da segunda divisão meiótica utilizando citocalasina B. Portanto células do doador são necessários que estão em fase G0/G1. <ol><li> Preparação de oócitos <ol><li> Camundongos fêmeas da BDF1 fundo são injetados intra-peritoneally com 5IU PMS rato por cinco horas - sete horas. </li><li> Cerca de 47 horas depois, cada rato é injetado intra-peritoneally com HCG 5IU. </li><li> Prepare um prato de cultura (KSOM-AA cai sob óleo) para os ovócitos no mesmo dia como a injeção de HCG e colocá-los em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO 2. Além disso, preparar as agulhas necessárias para SCNT (7μm para enucleação e 4 ou 5m de transferência nuclear de núcleos de linfócitos) por carregá-los com mercúrio. </li><li> Euthanize ratos e isolar ovidutos sobre 13h após HCG (aproximadamente 8:00). Recolher os ovidutos em 1-2 gotas de HCZB. </li><li> Um por um movimento do oviduto em uma queda contendo M2 w / Hialuronidase. Nick oviduto a cuidadosamente com uma pinça e passar o oócito-cumulus complexo para a queda. Afinal oócito-cumulus complexos foram isolados, o prato é incubada a 37 ° C. </li><li> Depois de 2-5 min (o tempo exato depende do lote de Hialuronidase) recolher os ovócitos, lave em HCZB e placa-los em KSOM-AA gotas. </li></ol></li><li> Enucleação de ovócitos <ol><li> Use a tampa de uma placa de Petri para preparar o prato TNCS. Configure o microscópio, e os micromanipulador. </li><li> Lavar a agulha enucleação (7 mm) em PVP antes de começar com enucleação. </li><li> Para enucleação, coloque um grupo de ovócitos (10-30) em uma gota de HZCB com citocalasina B (5 mg / mL). Durante a incubação (min. 5 min) line-up os oócitos horizontalmente. </li><li> Tome um ovócito e colocá-lo na frente da agulha segurando. Fixar o óvulo para a agulha segurando pela aplicação de um vácuo. Utilizando a agulha de enucleação, por sua vez o ovócito até o cromossomo eixo complexas (CSC, muitas vezes chamado de &quot;núcleo&quot;) está na posição de 3 horas. </li><li> Usando piezo-pulso penetrar na zona pelúcida cuidadosamente, sem danificar o óvulo. Lugar a abertura da agulha adjacente ao fuso-Metáfase II e aplicar vácuo. O &quot;núcleo&quot; deve mover lentamente para dentro da agulha, ea membrana deve selar-se uma vez que é completamente removido. </li><li> Transferir os oócitos enucleados de volta para as gotas KSOM-AA, e lavá-los várias vezes. E repetir oetapas de nucleação com um novo grupo de oócitos. Continue até que todos os ovos são enucleados ou até cerca de 11:00. </li></ol></li><li> Transferência Nuclear <ol><li> Para a transferência nuclear, troca a agulha enucleação (7 mm) com uma agulha de transferência nuclear (4 ou 5 mm) e lave-o com PVP. </li><li> Coloque as suas células de interesse (por exemplo, células CD8 + T) em uma queda com PVP, misture bem e incubar por um mínimo de 10 min. </li><li> Coloque um grupo de oócitos enucleados (10-30) em uma gota de HCZB com citocalasina B (2,5 mg / mL). Durante a incubação (min. 5 min) line-up oócitos na horizontal, utilizando a agulha de transferência nuclear. </li><li> Pegar uma célula doadora da suspensão de células-PVP e aspire-lo em-e-out até a membrana externa foi quebrada (fragmentos da membrana e citoplasma deve ser visível). Se necessário, um piezo-pulso pode ser aplicada. Uma vez que um núcleo foi isolado, movê-lo um pouco acima na agulha, e continuar a pegar núcleos até que você tenha 10-30. </li><li> Mover-se para a queda contendo os oócitos enucleados alinhados. Fix um ovócito para a agulha segurando pela aplicação de vácuo. Coloque a agulha de transferência nuclear (o núcleo deve ser longe da abertura) adjacente à zona pelúcida e aplicar piezo-pulse até que a agulha atravessou a zona pelúcida. Cuidadosamente mover um núcleo para a ponta da agulha, introduza a agulha do oócito até a ponta da agulha é 2 / 3 dentro. Aplique uma pequena pressão negativa, de modo que um pouco da membrana do oócito está na agulha. </li><li> O próximo passo é muito importante, pois é o único momento em que o óvulo é realmente &quot;aberto&quot;. Aplicar um único pulso de piezo, empurre o núcleo para fora da agulha através da aplicação de pressão positiva, cuidadosamente puxe a agulha para que a ponta é de cerca de 1 / 3 no ovócito, e em seguida, aplicar pressão negativa e continuar a puxar a agulha para selar o ovócito. Repita este passo com cada ovócito. </li><li> Depois de todos os oócitos de um grupo ter recebido um núcleo, que são lavadas e cultivadas em KSOM-AA mídia. Repita este procedimento com todos os ovócitos. </li><li> Após o último grupo foi culturas em KSOM-AA para um mínimo de 30 min, o SCNT-embriões são transferidos para gotas de mídia Ca-livre ativação contendo SrCl2. </li><li> Após 6 horas de ativação, a quantidade de pseudo-pronúcleo (PPN)-positivo SCNT-embriões é determinada. Os embriões são, então, lavadas e cultivadas em KSOM-AA cai para 3,5 dias adicionais até que tenham alcançado o estágio de blastocisto. </li><li> Drogas ou produtos químicos de escolha (como Tricostatina A) podem ser adicionados à ativação e meios de cultura. </li></ol></li></ol> 3.Derivation de células-tronco embrionárias Os blastocistos SCNT pode ser usado tanto para transferi-los para pseudo-grávida do sexo feminino (também conhecida como clonagem direta ou one-step) ou para derivar células-tronco embrionárias (também conhecida como clonagem indireta ou duas etapas). Uma vez que é muito mais eficiente para gerar células-tronco embrionárias, escolhemos o procedimento em duas etapas. No caso de o cientista está interessado na clonagem direta, a blastocistos podem ser transferidos diretamente para pseudo-grávida fêmeas, conforme descrito na seção 5. Existem muitos protocolos descrevendo a derivação de células-tronco embrionárias. O aqui descrito é uma técnica padrão, que utiliza células alimentadoras e soro fetal bovino. <ol><li> O segundo dia após a transferência nuclear, preparar uma placa de 96-U-bem para a derivação de células ES. </li><li> Adicionar 100 mL de gelatina em cada poço de uma placa de 96-U-bem, incubar por um mínimo de 10 min, e removê-lo depois. </li><li> Descongelar células alimentador e ressuspender em um volume de meio de acordo ESD, por exemplo, células de alimentação equivalente a uma área de 25 cm 2 são ressuspenso em 10 ml de meio de ESD e 200 mL da suspensão de células é adicionado em cada uma das gelatina-bem tratados. </li><li> Coloque a placa em uma incubadora e cultura a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Após 3,5 dias, os embriões devem estar no estágio de blastocisto. </li><li> Prepare um prato estéril bactérias por plaqueamento algumas gotas médias de células ES e thyrode ácido. </li><li> Os blastocistos são primeiro transferidos das gotas KSOM-AA em gotas contendo meio de célula normal ES e lavadas duas vezes. </li><li> Transferir cuidadosamente um grupo de blastocistos (blastocistos 10/05) em uma gota de ácido thyrode e manter lá até que a zona pelúcida se dissolveu. </li><li> Os blastocistos são então transferidos para uma gota com meio ES, lavados duas vezes, e em seguida colocado no alimentador revestido-96-U-bem placa (um blastocisto em um bem). </li><li> Os embriões são então cultivadas por 5-7 dias em uma incubadora a 37 ° CO C, 5% 2 sem perturbá-los. Isto dá ao embrião a um tempottach para a camada de alimentação, e para formar uma conseqüência. </li><li> Prepare placas de 24 poços, por alimentadores de chapeamento em meio ESD em todos os poços, por exemplo, ressuspender o equivalente a 50 alimentador cm 2 em 12 ml de meio de ESD, e adicionar 500 mL da suspensão de células em cada poço. </li><li> Remova cuidadosamente o meio ESD da placa de 96-U-bem com os embriões, lavar cada cavidade duas vezes com 250 mL Hepes (ou PBS), adicionar 50 mL Tripsina e incubar por aproximadamente 5 min a 37 ° C. </li><li> Pipeta cima e para baixo várias vezes, até que caiu distante conseqüência de uma suspensão de uma única célula de transferência em uma placa de 24 poços e incubar a 37 ° CO C, 5% 2., </li><li> Se derivação ESC foi bem-sucedida, colônias ESC deve ser visível após 7-10 dias. </li></ol> Injeção 4.Blastocyst A injeção de blastocistos é uma técnica de rotina para gerar qualquer tipo de modelo de camundongo transgênico. É importante mencionar que a injeção de blastocistos ea sua posterior transferência para pseudo-grávida fêmeas precisa ser cronometrado bem. <ol><li> Primeiro camundongos fêmeas com TPM e HCG como descrito na seção 2.1. Após a injeção de HCG colocar camundongos fêmeas, juntamente com os ratos do sexo masculino (um feminino e um masculino do rato por gaiola). </li><li> No dia seguinte, verifique as fêmeas para plugues. Isso é contado como 0.5dpc (dias pós-coito). </li><li> Embriões fertilizados são então isolados do oviduto conforme descrito na seção 2.1, e cultivadas em KSOM-AA para o adicional de 3 dias. </li><li> Prepare células ES no dia da injeção de blastocisto (3.5dpc). </li><li> Remova o meio de células-tronco embrionárias, lave duas vezes com Hepes (ou PBS), adicione Tripsina e incubar por 5 min a 37 ° C. </li><li> Ressuspender as células tripsinizados com meio ES, placa em um prato, e incubar por 45-60 min a 37 ° C, 5% de CO 2 para reduzir a quantidade de células alimentadoras (feeder células aderem mais rapidamente do que as células ES). </li><li> Transferir a suspensão celular através de um filtro de células (40 ou 70 mm) em um tubo, e centrifugar por 5 min a 1000 rpm. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender pellet celular em 500 mL de médio ES e armazenar no gelo até ser necessário. </li><li> Prepare a tampa de um prato estéril bacteriana por gotas de revestimento contendo PVP e HCZB. </li><li> Prepare uma agulha M 15, carregando com o mercúrio, colocando-o em posição e lavá-lo com PVP. </li><li> Coloque um grupo de blastocistos (10-30 blastocistos) em uma queda com HCZB, e adicione 50-50 mL suspensão de células ES (depende da concentração) em mais uma gota de HCZB. </li><li> Pick up células ES (5-10 células) com a agulha de injeção. </li><li> Mover-se para a queda com a blastocistos. Alinhar os blastocistos horizontalmente, e fixar uma holding com a agulha através da aplicação de vácuo. </li><li> Utilizando a agulha de injeção de transformar o blastocisto até que a massa celular interna (ICM) está na posição de 9 horas. </li><li> Coloque a agulha de injeção em três horas, certifique-se que não há células-tronco embrionárias na ponta da agulha, e aplicar piezo-pulse até que a agulha de injeção penetra na zona pelúcida e do trofectoderma no blastocoel. </li><li> Liberação de uma células ES poucos (15/05 células), de modo que as células ES ater ao ICM. Continue até que todos os blastocistos de um grupo tenham sido injetados com células-tronco embrionárias. </li><li> Após um grupo de blastocistos terminar, lave-os duas vezes em KSOM-AA e mantê-los em uma gota com KSOM-AA até que todos os blastocistos são injetados. </li></ol> 5. Transferência de Embriões A transferência de embriões em fêmeas grávidas pseudo-representa um procedimento cirúrgico, que precisa ser realizado com muito cuidado e de acordo com as diretrizes do instituto do pesquisador. <ol><li> Anestesiar ratos destinatário do sexo feminino, shave quadrante inferior direito, e desinfectar. </li><li> Tesoura aberta usando a pele, e separar o peritônio da pele. </li><li> Localizar o ovário através do peritônio (mancha vermelha), e abrir o peritônio próximo ao ovário. </li><li> Usando uma pinça, cuidadosamente pegar o oviduto e retirar o útero. </li><li> Pegar um grupo de cerca de 10 blastocistos com um capilar ligado a uma pipeta na boca. </li><li> Fixar o útero com uma pinça, um soco nele toda pequena com uma pequena agulha, e inserir o capilar com o blastocistos para o lúmen do útero. </li><li> Cuidadosamente liberação dos embriões no útero, e remover o seu capilar. </li><li> Empurrar o útero de volta para a cavidade abdominal. </li><li> Localizar as bordas do peritônio e fechá-lo com alguns pontos. </li><li> Feche a pele do rato com alguns grampos. </li><li> Para dor pós-operatória, administrar 5 carprofeno mg por mg de peso corporal. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Nuclear de células somáticastransferência de células pré-definido em T B6CF1 fundo. Números absolutos e relativos de embriões gerados a partir de células CD8 + T e células estaminais embrionárias derivadas de blastocistos TNCS. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análise de fluxo de Representante citometria de camundongos quiméricos injetados com células-tronco embrionárias TNCS. Portão e número (por cento ao total de células CD8 + T) indica a presença de específicos células T CD8 + em camundongos quiméricos.

<ol>
	<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+recombination.">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li><li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li><li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type.">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li></ol>

Nós mostramos aqui que SCNT pode ser usado para gerar ratos a partir de células T transnuclear pré-definidas especificidade. Embora não seja mostrado aqui, a técnica também deve ser usado para gerar ratos a partir de células B transnuclear pré-definidas especificidade. Uma coisa importante a considerar é a tensão e sexo do mouse, que é infectados ou imunizados e usado para isolar T ou células B de interesse. Como as células T e B têm uma eficiência muito baixa reprogramação em geral, recomendamos a utilização de híbridos F1 do haplótipo desejado. Porque a célula doadora também determina o sexo, recomendamos o uso de T ou células B de camundongos machos. Isso significa que apenas homens ratos quiméricos iria transmitir o TCR ou BCR através da linha germinativa, com camundongos machos sendo mais fácil e rápido para se reproduzir. Tomados em conjunto, pensamos que a reprogramação epigenética via SCNT representa uma poderosa ferramenta para gerar um novo tipo de modelos de mouse, que será de grande vantagem para o campo imunológico.

<table><tbody><tr><td>Red Blood Cell lysis Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Human Chorionic Gonadotropin (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Type IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Customized medium</td></tr><tr><td>Ca-free medium for activation</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Customized medium</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5mM = 1000x</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Holding needle</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Injection and transfer needles</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Mouth pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>or something similar</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>or something similar</td></tr><tr><td>Wound Clip Applicator</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Wound Clips</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15%</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200mM = 100x</td></tr><tr><td>Non-essential Aminoacids</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;l in 500ml</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>MEK inhibitor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

transnuclear mice with pre-defined t cell receptor specificities against toxoplasma gondii obtained via scnt

Linfócitos, como as células T, são submetidos a genética V (D) recombinação J, para gerar um receptor com uma certa especificidade 1. Camundongos transgênicos para um reorganizados antígeno-específica do receptor de células T (TCR) têm sido uma ferramenta indispensável para estudar o desenvolvimento de células T e função. No entanto, tais TCRs são geralmente isolados a partir de células T relevantes após longo período de cultura, muitas vezes após estimulação antigênica repetida, o que inevitavelmente seleciona para as células T com alta afinidade. Integração genômica aleatória da TCR α e β-corrente e de expressão de não-endógenos promotores podem levar a variações no nível de expressão e cinética. Reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas fornece uma ferramenta para gerar células-tronco embrionárias e camundongos a partir de qualquer célula de interesse. Conseqüentemente, quando SCNT é aplicada às células T de especificidade conhecida, estes rearranjos genéticos V (D) J são transferidos para as células-tronco embrionárias SCNT (CES) e os ratos deles derivados, enquanto marcas epigenéticas são repostas. Nós demonstramos que as células T com pré-definidos especificidades contra o Toxoplasma gondii pode ser usado para gerar modelos de ratos que expressam o TCR específicas de seus loci endógena, sem experimentalmente introduziu modificação genética. A relativa facilidade e rapidez com que tais modelos transnuclear pode ser obtido é promissor para a construção de modelos de outras doenças.

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

14.1K visualizações.  Whitehead Institute for Biomedical Research. Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Genética

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Pesquisa do câncer

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imagem 3-D e Análise de Neurônios Infected<em&gt; In Vivo</em&gt; Com<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Neurociência

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Biologia

Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and the detection of specific serum autoantibodies. Although the potential mechanism is still not clear, the risk of Hashimoto's thyroiditis is related to genetic and environmental factors. At present, there are several types of models of autoimmune thyroiditis, including experimental autoimmune thyroiditis (EAT) and spontaneous autoimmune thyroiditis (SAT).
EAT in mice is a common model for HT, which is immunized with lipopolysaccharide (LPS) combined with thyroglobulin (Tg) or supplemented with complete Freund's adjuvant (CFA). The EAT mouse model is widely established in many types of mice. However, the disease progression is more likely associated with the Tg antibody response, which may vary in different experiments.
SAT is also widely used in the study of HT in the NOD.H-2h4 mouse. The NOD.H2h4 mouse is a new strain obtained from the cross of the nonobese diabetic (NOD) mouse with the B10.A(4R), which is significantly induced for HT with or without feeding iodine. During the induction, the NOD.H-2h4 mouse has a high level of TgAb accompanied by lymphocyte infiltration in the thyroid follicular tissue. However, for this type of mouse model, there are few studies to comprehensively evaluate the pathological process during the induction of iodine.
A SAT mouse model for HT research is established in this study, and the pathologic changing process is evaluated after a long period of iodine induction. Through this model, researchers can better understand the pathological development of HT and screen new treatment methods for HT.

Several types of animal models of Hashimoto's thyroiditis have been established, as has spontaneous autoimmune thyroiditis in the NOD mouse. H-2h4 mice are a simple and reliable model for HT induction. This article describes this approach and evaluates the pathological process for a better understanding of the SAT murine model.

Geração de um modelo de tireoidite autoimune espontânea em camundongos

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and ...

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Resumo

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