Apoio da EB007279 subvenções e HL081273 dos EUA NIH é reconhecido agradecimento.

1. Descrição geral do protocolo de medição de oxigênio (Esta seção não tem nenhuma ação, mas é crucial para compreender o resto do papel. Pode ser filmado, por exemplo, como uma seqüência de slides um Ponto de alguns Power, acompanhada pela voz.) 1.1) A sonda é entregue para o meio de interesse, por exemplo, injetado no sangue ou líquido intersticial de um animal. 1.2) O objeto (superfície do tecido) é iluminado com a luz de comprimento de onda adequado a fim de promover a investigação sobre seu estado triplet animado. Tipicamente excitação ocorre através do mecanismo de um fóton. No entanto, no caso do especial de dois fótons avançada sondas, excitação pode ser feito através do mecanismo de dois fótons, que permite usar as sondas em aplicações de alta resolução da microscopia. Um fóton-excitação geralmente fornece uma resolução espacial menor, mais simples, mas requer instrumentação e pode ser usado em um único ponto medições com LED baseado em fibra óptica phosphorometers. 1,3 fosforescência) emitidos pela sonda se origina do estado triplete de vida longa. A molécula sonda deve ser especialmente concebido para dar rendimento quântico elevado do estado triplete e emitem fosforescência, em vez de fluorescência. Enquanto que no estado triplete, a sonda pode experimentar encontros colisão com as moléculas de oxigênio, que pode desactivar o estado triplete - &quot;. Quenching&quot; de um processo chamado Na ausência de oxigênio, a vida do estado triplete, e, portanto, a decadência fosforescência, é τ 0. Na presença de oxigênio, a vida de fosforescência (τ) é reduzido como resultado da extinção. Existe uma relação direta entre o tempo de vida do estado triplete e da quantidade de oxigênio no ambiente. Esta é a bem conhecida relação de Stern-Volmer, que liga a vida (τ) da fosforescência à concentração de oxigênio [O 2] (ou pressão parcial de oxigênio pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="equação" /> Em sistemas biológicos, o oxigênio é de longe o mais eficaz quencher de fosforescência, o que torna o método de têmpera fosforescência muito seletivos ao oxigênio. 1.4) A fim de medir o tempo de vida t, os fótons emitidos fosforescente são binned no tempo. Por exemplo, após o pulso de excitação, 200 fótons podem ser coletadas nos primeiros 15 microssegundos, 150 fótons coletados nos próximos 15 microssegundos, e assim por diante, até que não os fótons são coletados. Os números nas caixas plotados contra o tempo dar o decaimento de fosforescência, que é analisado para produzir o tempo de vida τ. Na imagem, este procedimento é aplicado em cada pixel da imagem, resultando em mapas vida fosforescência. Medições de vidas são insensíveis ao heterogeneidades de distribuição sonda ao longo do objeto, que é comum para amostras biológicas. Assim, vidas relatório apenas em oxigênio. Vidas τ são convertidos em concentrações de oxigênio utilizando a relação de Stern-Volmer. 2. Construção de sondas fosforescente Sondas fosforescente para medições de oxigênio em sistemas biológicos consistem de cromóforos fosforescente (núcleos), encapsulados em gaiolas construídas de dendrímeros - altamente regular polímeros hiper [3]. Dendrímeros proteger os núcleos a partir de interações com o meio ambiente e controle da taxa de difusão de oxigênio para os núcleos, tornando possível para otimizar a sensibilidade ea faixa dinâmica das sondas (constante k q na relação Stern-Volmer). Términos do dendrímeros são modificados com polietileno glicol quimicamente inerte hidrofílico (PEG) grupos, fazendo com que as sondas altamente solúvel em água e impedindo a sua interação com macromoléculas biológicas. Núcleos fosforescente das sondas estão Pt ou Pd complexos de porfirinas e porfirinas π-extended. π-Extended porfirinas são porfirinas em que anéis de pirrol são fundidos com fragmentos aromáticos externo. Extensão-π permite o ajuste das propriedades sondas espectroscópicas para satisfazer as exigências de uma aplicação de imagem em particular (por exemplo, a tomografia de microscopia vs). Como exemplo, descrevemos a síntese de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP têm bandas de absorção poderosa na parte extrema-vermelha do espectro de fosforescência e forte, adequado para medições de oxigênio biológico. A síntese de quatro PdAr TBP consiste das seguintes etapas: 2.1 Preparação) de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) por Lindsey condensação [5] de tetrahydroisoindole com benzaldeídos substituídos. Para uma solução M de 0,01 tetrahydroisoindole (1 eq) em CH &lt;sub&gt; 2 CL 2 do aldeído aromático (1 eq) foi adicionado sob argônio. A mistura de reação foi agitada por 10 min no escuro a RT BF 3 XlT 2 O (0,2 eq) foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por mais 2 h. DDQ (1 eq) foi adicionado, ea mistura foi deixada durante a noite, sob agitação contínua. A solução foi lavada com 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% HCl aq e finalmente com salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4, então concentrada no vácuo. O resíduo foi recristalizado de CH 2 Cl 2 - terc-butil éter mistura para dar Ar 4 TCHP como pó verde. Rendimentos são cerca de 50%. 2,2) Inserção de Pd para obter PdAr 4 TCHPs. Livre-base porfirinas (1 eq) foram tratados com PdCl 2 ou Pd (OAc) 2 (1,2 eq) em CH 3 CN refluxo na presença de excesso de Et 3 N (20 eq). A conversão foi monitorada por espectroscopia UV-vis (CH 2 Cl 2 de solvente-ácido acético) e considerado completo após a banda Soret de ditado em 468-472 nm desapareceu. A mistura foi autorizado a arrefecer, diluída com CH 2 Cl 2 e filtrada através de uma fina camada de Celite para remover Pd (0). O solvente foi evaporado, eo resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel usando CH 2 Cl 2 como solvente. Fração vermelho escuro foi coletado, o solvente foi evaporado para dar alvo PdAr 4 TCHPs no rendimento de quase quantitativa. 2.3) PdAr 4 TBP foram preparados por oxidação de PdAr 4 TCHPs com o excesso de duas vezes maior de DDQ (16 eq) em THF refluído. Durante refluxo, a cor passou de vermelho-escuro para verde-escuro. O solvente foi evaporado, o resíduo foi diluído com CH 2 Cl 2, lavada com 10% aq Na 2 SO 3, água e salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4 e concentrada no vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluente CH 2 Cl 2). A fração de verde-escuro primeiro foi coletado, concentrado no vácuo para dar 85-90% de pó como o azul-verde do PdAr4TBP. 2.4) grupos éster periférica de Pd-tetrakis (3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) foram hidrolisadas utilizando 10 vezes o excesso de KOH em 1% (v / v) de água / THF no rt. O solvente foi decantado do precipitado de sais de potássio formado de derivados do ácido carboxílico de PdAr4TBP é. Os sólidos foram dissolvidos em água, agitada por mais 2 h, acidificadas com conc. HCl para pH ~ 4-5. O precipitado obtido foi isolado por centrifugação, lavado com água e secas em vácuo. Proteger dendrons. Cada ramo individual do dendrímero é chamado dendron. Dendrons proteção são construídas de aril-glicina blocos (AG) de construção. Dendrons AG pode ser facilmente sintetizado a partir de matérias-primas baratas e isolados em alta pureza e rendimento por cromatografia em fase livre de métodos. Síntese de geração 2 (G2) AG dendron consiste das seguintes etapas: Síntese 2,4) dos blocos de construção, Boc-protegidos 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide e 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, utilizando do método haloacyl Fischer haleto. 2.5) Acoplamento dos blocos de construção usando CDMT / química acoplamento NMM peptídeo. 2.6) desprotegerem o grupo focal amino agitando a solução do dendron G2 em TFA por 2 h à temperatura 2.7) Para a montagem do dendrons maior geração, acoplamento / desproteção etapas são repetidas. Dendrímero montagem é conseguida pelo acoplamento do dendrons deprotected para PdAr4TBP (ou porfirina outros) usando a química acoplamento HBTU / DIPEA. 2.8) Em primeiro lugar, os grupos Boc-protetores são removidos do dendron. Por exemplo, Boc-protegidos dendron G3 (0,58 g) foi dissolvida em TFA (15 ml), ea mistura foi deixada para reagir à temperatura ambiente por 2h. O ácido foi removido por evaporação rotativa, produzindo a dendron como o TFA-sal. O resíduo foi dissolvido em NMP seco (10 ml) e algumas gotas de DIPEA foram adicionados, para extinguir os vestígios da TFA. 2.9) Antes de iniciar a reação de acoplamento, é fundamental para dissolver completamente o porfirina. Por exemplo, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) foi dissolvida em NMP seco (65 ml), sob aquecimento a 140 ° C por 10 min, sob fluxo de nitrogênio. 2.10) A solução foi resfriada à temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) foi adicionado, ea mistura foi agitada por 5 min. 2.11) DIPEA (0,35 ml) foi adicionado à mistura em uma parcela, imediatamente seguido por adição do solutina de TFA-sal da dendron em NMP (ver 2.8), ea mistura foi deixada sob agitação durante a noite. 2.12) A mistura foi vertida em aq 3%. NaCl (350 ml), sendo o precipitado resultante foi coletado por centrifugação e lavado com água, MeOH, e 2 Et O por suspensão repetitivos / centrifugação para produzir o alvo porfirina-dendrímero. 2.13) Para hidrolisar os grupos de éster de periféricos, o dendrímero foi tratado com NME 4 OH (~ 5 mM) em DMSO / MeOH mais de 20-60 min período, seguido de a remoção completa do solvente. Este procedimento nos permitiu gerar dendrímeros com número suficiente de grupos carboxilato dar solubilidade em água. Para completar a hidrólise, o dendrímero foi tratada com NaOH 0,1 N aquosa (overnight). Como resultado, pura porfirina-dendrímero ácidos carboxílicos podem ser isolados em rendimentos de 80-95%. Modificação da periferia dendrímero. Neste ponto, a partir da mesma porfirina-dendrímero, seja uma ou duas sondas de fótons podem ser sintetizados. No primeiro caso, todos os grupos carboxila periféricos são modificados com unidades PEG - uma metodologia conhecida como PEGylation. Neste último caso, vários grupos carboxila são primeiramente acoplado com cromóforos de dois fótons de antena (cumarina-343) modificados com etilenodiamina (EDA) linkers, seguido por PEGylation do carboxyls restantes [6]. Dendrímeros foram PEGylated usando monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. Prof. MW 1000) usando HBTU / DIPEA química acoplamento. 2.14) A uma solução do dendron em NMP (ou DMF) (1-10 mM) 1,25 vezes o excesso de HBTU foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 min. Excesso de 6,25 vezes maior de DIPEA foi adicionado, seguido pela adição imediata de 1,25 vezes o excesso de m-PEG-NH2. A mistura de reação foi agitada por 2 dias a rt. Éter etílico foi adicionado à mistura de reação, o precipitado formado foi separado por centrifugação e re-precipitado de THF pela adição de éter etílico. 2,15) Final de purificação foi alcançado com o tamanho-exclusão por cromatografia a coleta da fase de primeira frente. PEGylated porfirina-dendrímero foi dissolvido em uma pequena quantidade de THF (~ 15 ml) e carregado no topo de uma coluna cromatográfica preenchida com poliestireno SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). A coluna foi eluída com THF puro, ea banda de cor escura se movendo com a frente foi coletado. 2.16) THF foi removido em um evaporador rotativo, eo material remanescente foi seco em vácuo. 3. Caracterização sonda Caracterização fotofísicas inclui medições de espectros a sonda de absorção e emissão, fosforescência vidas τ 0 e Stern-Volmer oxigênio quenching constantes k q em condições fisiológicas. 3.1) O espectro de absorção e emissão são obtidos sob condições de ambiente usando a instrumentação padrão (espectrofotômetro e fluorímetro estável). ~ 1 mM soluções da sonda é usada. 3.2) Em seguida, a curva de calibração Stern-Volmer é obtido. Esta é a medida mais importante, porque nos permite relacionar a vida útil da sonda para a concentração de oxigênio. 3.3) A solução da sonda em tampão PBS (pH 7,2) é colocado em uma cubeta cilíndrica especial, que é posicionado dentro da câmara de temperatura controlada, localizado dentro de uma gaiola de luz impermeável com portas para excitação e emissão de fibras ópticas. As fibras são colocados em contato próximo com a cubeta dentro da câmara na geometria de ângulo reto. 3.4) A cuvete é fechado com uma tampa, no qual um eletrodo de oxigênio altamente sensíveis do tipo Clark (CK-eletrodo de oxigênio) é inserido. A rolha também contém duas portas agulha para entrada e saída de argônio. O eletrodo é imerso na solução, enquanto que as agulhas apenas prever o fluxo de fluxo de gás acima da superfície da solução. Na primeira, o argônio não está conectado à entrada. 3.5) A temperatura é definida para o valor desejado (tipicamente 36-37 ° C) ea solução é deixada sob agitação de equilíbrio. 3.6) A fibra de excitação é conectado à porta de excitação de um phosphorometer digital, operada por um PC. A fonte de luz na phosphorometer é um LED de alta potência, cuja produção é controlada por um 333 kHz D / A bordo. A fibra de emissão é ligado a outra porta óptica do phosphorometer, que é acoplado a um APD altamente sensível ao infravermelho (fotodiodo avalanche). A saída do diodo é amplificado e alimentado no canal A / D da placa de controle mesmo, o que permite a sincronização entre a excitação e os canais de emissão. 3.7) O controle de software albaixos geração de pulsos de excitação de qualquer comprimento desejado (por exemplo, 5 ou 10 ms), seguido da coleta de decaimento de fosforescência durante qualquer período arbitrário escolhido (tipicamente 2-3 ms). Tempo necessário para uma medição única vida é tipicamente 0,5-1 s, no entanto, as medições podem ser obtidas tão rapidamente quanto 10-20 por segundo. 3.8) A saída do eletrodo de oxigênio é amplificada e direcionada para outro A / D bordo no mesmo PC. Esta é uma placa de baixa freqüência (1 kHz máx), que é usado para gravar o eletrodo de corrente em períodos de tempo selecionado. O programa para gravar os dados do eletrodo é executado simultaneamente com o software phosphorometer. 3.9) Uma vez que a temperatura da solução é equilibrada, tanto phosphorometer o eletrodo e os programas são inicializados ao mesmo tempo para realizar as medições a cada 10 s. Suas saídas são registradas de forma síncrona em dois arquivos separados. Depois disso, o argônio é conectado à porta de entrada sobre a rolha cuvete. 3.10) Como argônio flui sobre a superfície da solução agitada, gradualmente substitui o oxigênio. Isso resulta em uma diminuição da corrente de eletrodo e um aumento no tempo de vida de fosforescência, que é medido pelo phosphorometer. Normalmente, o oxigênio é deslocado formar a solução totalmente após cerca de 2 h, durante o qual os dados são totalmente desconectado automaticamente em arquivos. 3.11) Após o final da corrida de titulação, os dados do eletrodo e as vidas fosforescência são importados para um programa de análise padrão (Origem Miocrocal por exemplo). A corrente do eletrodo depende linearmente da concentração de oxigênio, e para o eletrodo usado é praticamente zero em oxigênio zero. À pressão atmosférica, pO 2 é conhecido (cerca de 150 mm Hg). Assim, os dados do eletrodo podem ser diretamente convertidos para a escala de oxigênio, eo enredo da vida de fosforescência inversa x pO 2 pode ser construído. Este lote está equipado com uma linha reta pelo método dos mínimos quadrados para dar a têmpera kq de oxigênio constante como sua inclinação. Tempo de vida de fosforescência t0 é obtido a partir do encaixe mesmo (como o inverso do intercepto) ou diretamente a partir da medição em zero oxigênio. 3.12) Se necessário, a titulação é repetido utilizando uma solução da sonda na presença de albumina - uma proteína presente no plasma sanguíneo em altas concentrações, - a fim de imitar as condições reunidas no sistema real experimental (sangue de um animal in vivo). A obtenção de Stern-Volmer parcelas devem ser idênticas, se o dendrímero está protegendo o sensor de medição e grupos PEG isolar a sonda a partir dos contatos com a albumina. Caso contrário, a sonda e as proteínas no sangue irá interagir, e que levará a uma trama Stern-Volmer alteradas, causando ambigüidade nas medições de oxigênio. Constantes de calibração assim obtidos são usados ​​em experimentos com imagens em que as concentrações de oxigênio são um desconhecido a priori.

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<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abreviatura</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Nome completo</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Ácido trifluoroacético</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfato</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimetilsulfóxido</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-cloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthesis and calibration of phosphorescent nanoprobes for oxygen imaging in biological systems

Medição de oxigênio por quenching fosforescência [1, 2] consiste das seguintes etapas: 1) a sonda seja entregue para o meio de interesse (por exemplo, sangue ou líquido intersticial), 2) o objeto é iluminado com luz de comprimento de onda adequado a fim de excitar a sonda em seu estado triplet, 3) a fosforescência emitido é coletado, e respectiva evolução no tempo é analisado para produzir o tempo de vida de fosforescência, que é convertido para a concentração de oxigênio (ou pressão parcial, pO<sub&gt; 2</sub&gt;). A sonda não deve interagir com o ambiente biológico e em alguns casos a ser 4) excretado do meio após a conclusão da medição. Cada uma dessas etapas impõe exigências de projeto molecular das sondas fosforescentes, que constituem o único componente invasivo do protocolo de medição. Aqui nós revemos o projeto de dendríticas nanosensores fosforescente para medições de oxigênio em sistemas biológicos. As sondas consistem em Pt ou Pd porfirina baseado polyarylglycine (AG) dendrímeros, modificado perifericamente com polietileno glicol (PEG de) resíduos. Para a excitação de dois fótons eficaz, términos do dendrímeros podem ser modificados com dois fótons cromóforos antena, que captam a energia de excitação e canalizá-los para os núcleos triplet das sondas via intramolecular FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Descrevemos as propriedades fotofísicas chave das sondas e apresentar protocolos de calibração detalhado.

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Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Apresentamos os princípios de medições de oxigênio por quenching fosforescência e da revisão do projeto porfirina baseado nanosensores dendríticas para geração de imagens de oxigênio em sistemas biológicos.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Biology

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Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
neuro-metabolic-vascular relationship. Development of new pO2 measurement modalities with simultaneous monitoring of pO2 in larger fields of view with higher 
spatial and/or temporal resolution will enable greater insight into the functioning of the normal brain and will also have significant impact on diagnosis 
and treatment of neurovascular diseases such as stroke, Alzheimer's disease, and head injury.
Optical imaging modalities have shown a great potential to provide high spatiotemporal resolution and quantitative imaging of pO2 based on hemoglobin absorption in visible and near infrared range of optical spectrum. However, multispectral measurement of cerebral blood oxygenation relies on photon migration through the highly scattering brain tissue. Estimation and modeling of tissue optical parameters, which may undergo dynamic changes during the experiment, is typically required for accurate estimation of blood oxygenation. On the other hand, estimation of the partial pressure of oxygen (pO2) based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence should not be significantly affected by the changes in the optical parameters of the tissue and provides an absolute measure of pO2. Experimental systems that utilize oxygen-sensitive dyes have been demonstrated in in vivo studies of the perfused tissue as well as for monitoring the oxygen content in tissue cultures, showing that phosphorescence quenching is a potent technology capable of accurate oxygen imaging in the physiological pO2 range. 
Here we demonstrate with two different imaging modalities how to perform measurement of pO2 in cortical vasculature based on phosphorescence lifetime imaging. In first demonstration we present wide field of view imaging of pO2 at the cortical surface of a rat. This imaging modality has relatively simple experimental setup based on a CCD camera and a pulsed green laser. An example of monitoring the cortical spreading depression based on phosphorescence lifetime of Oxyphor R3 dye was presented. In second demonstration we present a high resolution two-photon pO2 imaging in cortical micro vasculature of a mouse. The experimental setup includes a custom built 2-photon microscope with femtosecond laser, electro-optic modulator, and photon-counting photo multiplier tube. We present an example of imaging the pO2 heterogeneity in the cortical microvasculature including capillaries, using a novel PtP-C343 dye with enhanced 2-photon excitation cross section.
Click here to view the related article <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/Details.php?ID=1731">Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a>

We present an experimental procedure for measuring the partial pressure of oxygen (pO2) in cerebral vasculature based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence. Animal preparation and imaging procedures were outlined for both large field of view CCD-based imaging of pO2 in rats and 2-photon excitation based imaging of pO2 in mice.

Medição oxigenação cerebral de sangue baseado em oxigênio-dependente Quenching de fosforescência

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

Neurociência

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Bioengenharia

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH oxidase has critical signaling functions that modulate the inflammatory response 1. Thus, the development of a method to measure in "real-time" the kinetics of NADPH oxidase-derived ROS generation is expected to be a valuable research tool to understand mechanisms relevant to host defense, inflammation, and injury.
Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the NADPH oxidase characterized by severe infections and excessive inflammation. Activation of the phagocyte NADPH oxidase requires translocation of its cytosolic subunits (p47phox, p67phox, and p40phox) and Rac to a membrane-bound flavocytochrome (composed of a gp91phox and p22phox heterodimer). Loss of function mutations in any of these NADPH oxidase components result in CGD. Similar to patients with CGD, gp91phox -deficient mice and p47phox-deficient mice have defective phagocyte NADPH oxidase activity and impaired host defense 2, 13. In addition to phagocytes, which contain the NADPH oxidase components described above, a variety of other cell types express different isoforms of NADPH oxidase.
Here, we describe a method to quantify ROS production in living mice and to delineate the contribution of NADPH oxidase to ROS generation in models of inflammation and injury. This method is based on ROS reacting with L-012 (an analogue of luminol) to emit luminescence that is recorded by a charge-coupled device (CCD). In the original description of the L-012 probe, L-012-dependent chemiluminescence was completely abolished by superoxide dismutase, indicating that the main ROS detected in this reaction was superoxide anion 14. Subsequent studies have shown that L-012 can detect other free radicals, including reactive nitrogen species 15, 16. Kielland et al. 16 showed that topical application of phorbol myristate acetate, a potent activator of NADPH oxidase, led to NADPH oxidase-dependent ROS generation that could be detected in mice using the luminescent probe L-012. In this model, they showed that L-012-dependent luminescence was abolished in p47phox-deficient mice.
We compared ROS generation in wildtype mice and NADPH oxidase-deficient p47phox-/- mice 2 in the following three models: 1) intratracheal administration of zymosan, a pro-inflammatory fungal cell wall-derived product that can activate NADPH oxidase; 2) cecal ligation and puncture (CLP), a model of intra-abdominal sepsis with secondary acute lung inflammation and injury; and 3) oral carbon tetrachloride (CCl4), a model of ROS-dependent hepatic injury. These models were specifically selected to evaluate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the context of non-infectious inflammation, polymicrobial sepsis, and toxin-induced organ injury, respectively. Comparing bioluminescence in wildtype mice to p47phox-/- mice enables us to delineate the specific contribution of ROS generated by p47phox-containing NADPH oxidase to the bioluminescent signal in these models.
Bioluminescence imaging results that demonstrated increased ROS levels in wildtype mice compared to p47phox-/- mice indicated that NADPH oxidase is the major source of ROS generation in response to inflammatory stimuli. This method provides a minimally invasive approach for "real-time" monitoring of ROS generation during inflammation in vivo.

NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in phagocytes. Because of the ephemeral nature of ROS, it is difficult to measure and monitor ROS levels in living animals. A minimally invasive method for serial quantification of ROS in living mice is described.

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Imunologia e Infecção

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Tempo-resolvido compostos orgânicos de Photophysical caracterização dos Triplet-colheita em um livre de oxigênio ambiente usando uma câmera de iCCD

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Química

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs O2 sensitive luminescent sensor foils (planar optodes) in combination with a specialized camera system for imaging luminescence lifetime in the frequency-domain. Planar optodes are prepared by dissolving the O2-sensitive indicator dye in a polymer and spreading the mixture on a solid support in a defined thickness via knife coating. After evaporation of the solvent, the planar optode is placed in close contact with the sample of interest - here demonstrated with the roots of the aquatic plant Littorella uniflora. The O2 concentration-dependent change in the luminescence lifetime of the indicator dye within the planar optode is imaged via the backside of the transparent carrier foil and aquarium wall using a special camera. This camera measures the luminescence lifetime (&#181;s) via a shift in phase angle between a modulated excitation signal and emission signal. This method is superior to luminescence intensity imaging methods, as the signal is independent of the dye concentration or intensity of the excitation source, and solely relies on the luminescence decay time, which is an intrinsically referenced parameter. Consequently, an additional reference dye or other means of referencing are not needed. We demonstrate the use of the system for macroscopic O2 imaging of plant rhizospheres, but the camera system can also easily be coupled to a microscope.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe the use of a novel, frequency-domain luminescence lifetime camera for mapping 2D O2 distributions with optical sensor foils. The camera system and image analysis procedures are described along with the preparation, calibration and application of sensor foils for visualizing the O2 microenvironment in the rhizosphere of aquatic plants.

Imagens vitalícias de Luminescence de O2 com um sistema de câmera baseado em domínio de frequência

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Biologia

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabricção assistida por microscopia de oxigênio acessível de esferoides multicelulares

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...