Sostegno delle sovvenzioni EB007279 e HL081273 dagli Stati Uniti NIH Si ringrazia.

1. Descrizione generale del protocollo di misurazione dell&#39;ossigeno (Questa sezione non ha alcuna azione, ma è cruciale per capire il resto della carta. Può essere girato, ad esempio, come una sequenza di alcune diapositive in Power Point, accompagnato dalla voce). 1.1) La sonda viene consegnato nel mezzo di interesse, ad esempio, iniettata nel fluido interstiziale sangue o di un animale. 1.2) L&#39;oggetto (superficie del tessuto), è illuminata con la luce di lunghezza d&#39;onda appropriata al fine di promuovere la sonda nel suo stato di tripletto eccitato. Tipicamente l&#39;eccitazione avviene attraverso il meccanismo di un fotone. Tuttavia, nel caso di speciale a due fotoni avanzata sonde, l&#39;eccitazione può essere fatto tramite il meccanismo a due fotoni, che consente l&#39;utilizzo delle sonde ad alta risoluzione applicazioni di microscopia. Un fotone di eccitazione generalmente fornisce risoluzione spaziale di meno, ma richiede una strumentazione più semplice e può essere utilizzato in un unico punto le misurazioni con LED a base di fibra ottica phosphorometers. 1.3) Fosforescenza emessa dalla sonda proviene dal longevo stato di tripletto. La molecola sonda deve essere appositamente progettato per fornire alta resa quantica dello stato di tripletto ed emettono fosforescenza invece di fluorescenza. Mentre in stato di tripletto, la sonda può sperimentare incontri collisione con le molecole di ossigeno, che può disattivare la stato di tripletto - &quot;. Tempra&quot;, un processo chiamato In assenza di ossigeno, la durata della stato di tripletto, e quindi della decadenza fosforescenza, è τ 0. In presenza di ossigeno, la durata fosforescenza (τ) è ridotta a causa della tempra. C&#39;è una relazione diretta tra la durata dello stato di tripletto e la quantità di ossigeno nell&#39;ambiente. Questo è il famoso rapporto Stern-Volmer, che collega la durata (τ) della fosforescenza di concentrazione di ossigeno [O 2] (o pressione parziale di ossigeno pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="equazione" /> Nei sistemi biologici, l&#39;ossigeno è di gran lunga il più efficace quencher di fosforescenza, che rende il metodo di spegnimento fosforescenza molto selettiva per l&#39;ossigeno. 1.4) Per misurare la t vita, i fotoni emessi fosforescenti sono cestinate nel tempo. Ad esempio, dopo l&#39;impulso di eccitazione, 200 fotoni possono essere raccolte nei primi 15 microsecondi, 150 fotoni raccolti nei prossimi 15 microsecondi, e così via, fino a quando non fotoni vengono raccolti. I numeri nelle celle rilevate in tempo dare il decadimento fosforescenza, che viene analizzato per produrre la durata τ. Nella diagnostica per immagini, questa procedura è applicata in ogni singolo pixel dell&#39;immagine, con conseguente mappe vita fosforescenza. Misure di vite sono insensibili alla eterogeneità della distribuzione della sonda durante l&#39;oggetto, che è comune per i campioni biologici. Così, solo su vite rapporto ossigeno. Durata τ sono convertite in concentrazioni di ossigeno con il rapporto Stern-Volmer. 2. Costruzione di sonde fosforescenti Sonde fosforescenti per misure di ossigeno nei sistemi biologici costituiti da cromofori fosforescente (nuclei), incapsulato in gabbie costruite con dendrimeri - hyperbranched polimeri altamente regolare [3]. Dendrimeri proteggere i nuclei dalle interazioni con l&#39;ambiente e controllare la velocità di diffusione di ossigeno al core, permettendo di ottimizzare la sensibilità e la gamma dinamica delle sonde (costante k q nel rapporto Stern-Volmer). Il capolinea del dendrimeri sono modificati chimicamente inerte con polietilene glicole idrofile (PEG) i gruppi, rendendo le sonde altamente solubile in acqua ed evitare le loro interazioni con macromolecole biologiche. Nuclei fosforescente delle sonde sono complessi Pt o Pd di porfirine e π-extended porfirine. π-Extended porfirine sono porfirine in cui si fondono anelli di pirrolo con frammenti aromatiche esterni. π-Extension permette la sintonizzazione delle sonde proprietà spettroscopiche per soddisfare le esigenze di una particolare applicazione di imaging (microscopia ad esempio contro la tomografia). Come esempio, si descrive la sintesi di tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (4 PdAr TBP) [4]. PdAr 4 TBP hanno bande di assorbimento potente nel lontano rosso parte della fosforescenza spettro e forte, adatto per le misure di ossigeno biologico. La sintesi di PdAr 4 TBP è costituito dai seguenti passaggi: 2.1) Preparazione di tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) da Lindsey condensa [5] di tetrahydroisoindole con benzaldehydes sostituito. Ad una soluzione 0,01 M di tetrahydroisoindole (1 eq) in CH &lt;sub&gt; 2 CL 2 l&#39;aldeide aromatica (1 eq) è stato aggiunto sotto argon. La miscela di reazione è stata agitata per 10 minuti al buio a temperatura ambiente BF 3 Xet 2 O (0,2 eq) è stato aggiunto, e la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per altre 2 h. DDQ (1 eq) è stato aggiunto, e la miscela è stata lasciata tutta la notte sotto agitazione continua. La soluzione è stata lavata con il 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq HCl e infine con acqua salata. La fase organica è seccato su Na 2 SO 4, quindi concentrato nel vuoto. Il residuo è stato ricristallizzato da CH 2 Cl 2 - ter-butil etere miscela per dare 4 TCHP come polvere verde Ar. Le rese sono circa il 50%. 2.2) Inserimento del Pd per ottenere PdAr 4 TCHPs. Free-base di porfirine (1 eq) sono stati trattati con 2 o pDC Pd (OAC) 2 (1.2 eq) in refluenti CH 3 CN, in presenza di un eccesso di Et 3 N (20 eq). La conversione è stata monitorata dalla spettroscopia UV-vis (solvente CH 2 Cl 2-AcOH) e considerata completa dopo la banda di Soret dettatura a 468-472 nm scomparso. La miscela è stato permesso di raffreddare, diluito con CH 2 Cl 2 e filtrato attraverso un sottile strato di Celite per rimuovere Pd (0). Il solvente è stato evaporato e il residuo è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando CH 2 Cl 2 come solvente. Frazione rosso scuro sono stati raccolti, il solvente è stato evaporato per dare obiettivo PdAr 4 TCHPs della resa quasi quantitativi. 2.3) PdAr 4 TBP sono stati preparati da ossidazione del PdAr 4 TCHPs con le 2 volte l&#39;eccesso di DDQ (16 eq) in THF riflusso. Durante il riflusso, il colore cambiato da rosso scuro al verde scuro. Il solvente è stato evaporato, il residuo è stato diluito con CH 2 Cl 2, lavati con il 10% aq Na 2 SO 3, acqua e salamoia. La fase organica è seccato su Na 2 SO 4 e concentrato nel vuoto. Il residuo è stato purificato mediante cromatografia su gel di silice (eluente CH 2 Cl 2). La prima frazione verde scuro è stato raccolto, concentrato nel vuoto per dare 85-90% di polvere di colore blu-verde PdAr4TBP è. 2.4) gruppi estere periferiche di tetrachis Pd-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) sono stati idrolizzati con 10 volte l&#39;eccesso di KOH in 1% (v / v) acqua / THF a rt. Il solvente è stato decantato dal precipitato di sali di potassio formato di derivati ​​dell&#39;acido carbossilico di PdAr4TBP è. I solidi sono stati sciolti in acqua, mescolato per ulteriori 2 ore, acidificato con conc. HCl a pH ~ 4-5. Il precipitato ottenuto è stato isolato per centrifugazione, lavate con acqua ed essiccato nel vuoto. Proteggere dendroni. Ogni singolo ramo del dendrimero si chiama dendron. Dendroni proteggere sono costruiti con aril-glicina (AG) blocchi costruttivi. Dendroni AG possono essere facilmente sintetizzati da economico materie prime e isolati in purezza ed elevate rese mediante cromatografia senza metodi. Sintesi di generazione 2 (G2) AG-dendron è costituito dai seguenti passaggi: 2.4) Sintesi degli elementi costitutivi, Boc-protetta 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide e 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, utilizzando il metodo Fischer haloacyl alogenuri. 2.5) Accoppiamento degli elementi costitutivi utilizzando CDMT / NMM chimica accoppiamento peptide. 2.6) rimozione della protezione del gruppo amminico focale agitando la soluzione del dendron G2 in TFA per 2 ore a RT 2.7) Per il montaggio del dendroni generazione superiore, aggancio / deprotezione passi sono ripetuti. Dendrimero gruppo si ottiene accoppiamento del dendroni deprotetto a PdAr4TBP (o porfirina altro) utilizzando la HBTU / DIPEA chimica accoppiamento. 2.8) In primo luogo, il Boc-gruppi di protezione vengono rimossi dal dendron. Per esempio, Boc-protetta dendron G3 (0,58 g) è stato sciolto in TFA (15 ml), e la miscela è stata lasciata reagire a temperatura ambiente per 2 ore. L&#39;acido è stato rimosso per evaporazione rotante, ottenendo il dendron come il TFA-sale. Il residuo è stato dissolto in secca NMP (10 ml) e qualche goccia di DIPEA sono stati aggiunti, per placare le tracce di TFA. 2.9) Prima di iniziare la reazione di accoppiamento, è fondamentale per sciogliere completamente la porfirina. Per esempio, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) è stato sciolto in secca NMP (65 ml) sotto il riscaldamento a 140 ° C per 10 minuti, sotto flusso di azoto. 2.10) La soluzione è stata raffreddata a temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) è stato aggiunto, e la miscela è stata agitata per 5 min. 2.11) DIPEA (0,35 ml) è stato aggiunto alla miscela in una porzione, immediatamente seguita dalla aggiunta del SOLUZIOsu di TFA-sale della dendron in NMP (vedi 2.8), e la miscela è stata lasciata una notte sotto agitazione. 2.12) La miscela è stata versata in 3% aq. NaCl (350 ml), e il precipitato risultante è stato raccolto per centrifugazione e lavato con acqua, MeOH, e Et 2 O da sospensione ripetitivi / centrifugazione cedere il bersaglio porfirina-dendrimero. 2.13) Per idrolizzano i gruppi esteri periferici, il dendrimero è stato trattato con NME 4 OH (~ 5 mm) in DMSO / MeOH nel periodo 20-60 min, seguito dalla rimozione completa solvente. Questa procedura ci ha permesso di generare dendrimeri con sufficiente numero di gruppi carbossilato per dare solubilità in acqua. Per completare l&#39;idrolisi, la dendrimero è stato trattato con NaOH 0.1N acquosa (una notte). Di conseguenza, puro porfirina-dendrimero acidi carbossilici possono essere isolati in 80-95% dei rendimenti. Modifica della periferia dendrimero. A questo punto, a partire dalla stessa porfirina-dendrimero, sia di uno o due fotoni sonde possono essere sintetizzati. Nel primo caso, tutti i gruppi periferici carbossilici sono modificate con le unità PEG - una metodologia nota come PEGilazione. In quest&#39;ultimo caso, diversi gruppi carbossilici sono prima accoppiato con due fotoni cromofori antenna (cumarina-343) modificato con etilendiammina (EDA) linker, seguita da PEGilazione del carboxyls rimanenti [6]. Dendrimeri sono stati pegilato con monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av.. MW 1000) utilizzando HBTU / DIPEA chimica accoppiamento. 2.14) Per una soluzione del dendron in NMP (o DMF) (1-10 mM) eccesso di 1,25 volte di HBTU è stato aggiunto, e la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per 10 minuti. Eccesso di 6,25 volte di DIPEA è stato aggiunto, seguito con l&#39;aggiunta immediata di un eccesso di 1,25 volte di m-PEG-NH2. La miscela di reazione è stata agitata per 2 giorni a temperatura ambiente. Etere etilico è stato aggiunto alla miscela di reazione, il precipitato formato è stato separato per centrifugazione e ri-precipitato da THF con l&#39;aggiunta di etere etilico. 2.15) purificazione finale è stato ottenuto con dimensioni-cromatografia esclusione dalla raccolta della fase di primo fronte. Pegilato porfirina-dendrimero è stato dissolto in una piccola quantità di THF (~ 15 ml) e caricato sulla sommità di una colonna cromatografica riempito di polistirolo SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). La colonna è stata eluita con puro THF, e la banda di colore scuro in movimento con la parte anteriore è stato raccolto. 2.16) THF è stato rimosso su un evaporatore rotante, e il restante materiale è stato essiccato a vuoto. 3. Sonda caratterizzazione Caratterizzazione fotofisiche comprende misurazioni di spettri di assorbimento e di emissione della sonda, fosforescenza durata τ 0 e Stern-Volmer ossigeno tempra costanti k q in condizioni fisiologiche. 3.1) Gli spettri di assorbimento e di emissione sono ottenuti in condizioni ambientali utilizzando strumenti standard (spettrofotometro e fluorimetro costante). ~ 1 microM soluzioni della sonda viene utilizzato. 3.2) Successivamente, il Stern-Volmer diagramma di taratura si ottiene. Questa è la misura più importante, perché ci permette di mettere in relazione la durata della sonda per la concentrazione di ossigeno. 3.3) Una soluzione della sonda nel tampone PBS (pH 7,2) si trova in una cuvetta speciale forma cilindrica, che viene posizionato all&#39;interno della camera a temperatura controllata, che si trova all&#39;interno di un leggero impermeabile gabbia con le porte per le fibre di eccitazione e di emissione ottica. Le fibre sono messi a stretto contatto con la cuvetta all&#39;interno della camera in angolo retto geometria. 3.4) La cuvetta è chiuso con un tappo, in cui una molto sensibile Clark-elettrodo ossigeno (CK-elettrodo ossigeno) viene inserito. Il tappo contiene anche due porte aghi per aspirazione e mandata di argon. L&#39;elettrodo è immerso nella soluzione, mentre gli aghi solo prevedere il flusso di flusso di gas al di sopra della superficie soluzione. In un primo momento, l&#39;argon non è collegato alla presa. 3.5) La temperatura è impostata al valore desiderato (in genere 36-37 ° C) e la soluzione viene lasciata sotto agitazione per il raggiungimento dell&#39;equilibrio. 3.6) La fibra di eccitazione è collegato alla porta eccitazione di un phosphorometer digitale, gestito da un PC. La sorgente di luce nel phosphorometer è un LED ad alta potenza, la cui uscita è controllato da un kHz D 333 / A a bordo. La fibra di emissione è collegata a un&#39;altra porta ottica del phosphorometer, che è accoppiato ad un APD altamente sensibili all&#39;infrarosso (valanga fotodiodo). L&#39;uscita del diodo è amplificato e alimentato in A / canale D del consiglio stesso controllo, che permette la sincronizzazione tra l&#39;eccitazione e canali di emissione. 3.7) Il software di controllo algenerazione di impulsi di eccitazione bassi di qualsiasi lunghezza desiderata (ad esempio 5 o 10 ms), seguita dalla raccolta di decadimento fosforescenza durante un qualsiasi periodo di arbitraria scelta (in genere 2-3 ms). Tempo necessario per una misura singola vita è tipicamente 0,5-1 s, tuttavia, le misurazioni possono essere ottenuti più rapidamente 10-20 al secondo. 3.8) L&#39;uscita del elettrodo ossigeno viene amplificato e diretto in un altro A / D a bordo sullo stesso PC. Questa è una scheda a bassa frequenza (1 kHz max), che viene utilizzato per registrare l&#39;elettrodo corrente in periodi di tempo selezionato. Il programma per la registrazione dei dati elettrodo funziona contemporaneamente con il software phosphorometer. 3.9) Una volta che la temperatura della soluzione è equilibrato, sia la phosphorometer ei programmi elettrodi vengono inizializzati allo stesso tempo di effettuare le misurazioni ogni 10 s. Le loro uscite sono registrati in modo sincrono in due file separati. Dopo di che, l&#39;argon è collegato alla porta di ingresso sul tappo cuvetta. 3.10) Come argon scorre sulla superficie della soluzione agitata, sostituisce a poco a poco ossigeno. Ciò si traduce in una diminuzione della corrente elettrodo e un aumento della vita fosforescenza, che è misurata dal phosphorometer. Di solito, l&#39;ossigeno è spostata la soluzione di tutto dopo circa 2 ore, durante i quali i dati sono registrati in modo completamente automatico in file. 3.11) Dopo la fine della corsa titolazione, i dati elettrodo e le durate fosforescenza sono importati in un programma di analisi standard (ad esempio Origine Miocrocal). L&#39;attuale elettrodo dipende linearmente concentrazione di ossigeno, e per l&#39;elettrodo utilizzato è praticamente zero a ossigeno zero. A pressione atmosferica, pO 2 è noto (circa 150 mm Hg). Così, i dati elettrodi possono essere direttamente convertiti alla scala di ossigeno, e la trama della vita inversa fosforescenza vs pO 2 può essere costruito. Questo grafico è dotato di una linea retta con il metodo dei minimi quadrati per dare il KQ tempra costante di ossigeno come la sua pendenza. Vita fosforescenza t0 è ottenuta dal fit stesso (come l&#39;inverso del intercetta) o direttamente dalla misurazione a zero ossigeno. 3.12) Se necessario, la titolazione è ripetuta utilizzando una soluzione della sonda in presenza di albumina - una proteina presente nel plasma sanguigno in alte concentrazioni, - al fine di emulare le condizioni incontrato nel sistema reale sperimentale (sangue di un animale in vivo). La ottenere Stern-Volmer trame dovrebbero essere identici se il dendrimero protegge la sonda bene e gruppi PEG isolare la sonda dai contatti con l&#39;albumina. In caso contrario, la sonda e le proteine ​​nel sangue interagisce, e che porterà ad un alterato Stern-Volmer complotto, causando ambiguità nelle misure di ossigeno. Costanti di calibrazione così ottenuti sono usati in esperimenti di imaging in cui le concentrazioni di ossigeno sono una sconosciuta a priori.

<ol>
	<li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence.">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li><li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems.">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li><li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins.">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li><li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited:+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions.">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li><li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen.">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li></ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abbreviazione</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Nome e cognome</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Acido trifluoroacetico</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium esafluorofosfato</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimetilsolfossido</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-cloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthesis and calibration of phosphorescent nanoprobes for oxygen imaging in biological systems

Misurazione dell&#39;ossigeno da tempra fosforescenza [1, 2] è costituito dai seguenti passi: 1) la sonda viene consegnato nel mezzo di interesse (es. sangue o liquido interstiziale), 2) l&#39;oggetto viene illuminato con luce di lunghezza d&#39;onda appropriata al fine di eccitare la sonda nel suo stato di tripletto, 3) la fosforescenza emessa è raccolta, e suo sviluppo nel tempo viene analizzato per produrre la vita fosforescenza, che viene convertita in concentrazione di ossigeno (o pressione parziale, pO<sub&gt; 2</sub&gt;). La sonda non deve interagire con l&#39;ambiente biologico e, in alcuni casi da 4) espulso dal supporto al completamento di misura. Ognuno di questi passi impone requisiti relativi alla progettazione molecolare delle sonde fosforescenti, che costituiscono l&#39;unica componente invasiva del protocollo di misurazione. Qui passiamo in rassegna la progettazione di dendritiche nanosensori fosforescenti per misure di ossigeno nei sistemi biologici. Le sonde sono costituite da Pt o Pd porfirina-based polyarylglycine (AG) dendrimeri, modificato marginalmente con polietilenglicole (PEG) i residui. Per un efficace eccitazione a due fotoni, capolinea del dendrimeri possono essere modificate con due fotoni cromofori antenna, che catturano l&#39;energia di eccitazione e smistarli verso i nuclei tripletta delle sonde tramite intramolecolari FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Ci descrivono le proprietà fotofisiche chiave delle sonde e del presente protocollo dettagliate sulla calibrazione.

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Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Vi presentiamo i principi delle misure di ossigeno da tempra fosforescenza e la progettazione commento su nanosensori dendritiche porfirina-based per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

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Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

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The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l'imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Utilizzando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) per sviluppare strumenti diagnostici

La normalizzazione nata per fluorescenza Tomografia Ottica proiezione per l'imaging tutto il cuore

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l'imaging dal vivo

Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging