Agradecemos a Hye Sook-Oh, Joanne Morello e Alan Collmer, Departamento de Fitopatologia e Biologia Vegetal-Microbe, Cornell University, pelas valiosas discussões. Agradecemos a Jesse Munkvold para comentários sobre o artigo. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation Programa Genoma Plant, número prêmio DBI-0605059 (GBM).

Parte 1: O crescimento das plantas e manutenção Nicotiana benthamiana plantas utilizada no ensaio deve ser de cerca de 7 semanas de idade. Eles devem ser aparadas pelo menos 4-5 dias antes do ensaio para remover todos os ramos axilares e flores. É uma boa idéia para remover ramos axilares logo depois que eles surgem de forma a tornar as plantas mais facilmente gerenciáveis. Parte 2: cultura bacteriana DIA 1: <ol><li> Placas ou culturas de todas as estirpes utilizadas no ensaio são iniciadas ao mesmo tempo. Para a Pseudomonas spp. que incluem dois indutores e 3 cepas desafio, bactérias raia em placas KBM contendo os antibióticos adequados de estoques congelados glicerol (Tabela 2). Uma pequena quantidade de bactérias deve ser espalhado no centro do prato. Incubar as placas a 30 ° C por cerca de 18-24 horas. Para Agrobacterium, iniciar uma cultura líquida em duas LB ml de uma placa nova e crescer durante a noite a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> 2 º DIA: <ol start="2"><li> Por Pseudomonas, adicione 150-200 mL de KBM líquido para as bactérias e espalhe-os sobre a placa inteira usando um espalhador de vidro estéril. Coloque o prato de volta na incubadora e deixá-lo crescer por mais 20-24 horas. Deve haver um gramado bacteriana na placa no dia seguinte, indicando um bom crescimento. Para Agrobacterium, iniciar uma cultura secundária em cerca de 50-10 ml LB com 20 mM acetosyringone e deixá-lo crescer durante a noite para 20 horas a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> Parte 3: Estações Preparação para o ensaio 2 º DIA: <ol><li> Um dia antes do ensaio as plantas devem ser movido para um quarto em 22-24 ° C, luz ~ 35-40% de umidade relativa e constante. </li><li> Mark círculos em folhas que são pelo menos 1,5 cm de diâmetro com um marcador preto grosso. Dois a quatro círculos podem ser marcados por folha. Os círculos devem ser bem espaçadas e de preferência não atravessar uma grande veia. Escolha bem-expandida folhas. Evitar que as folhas velhas ou folhas que são difíceis ou grossa ao toque e evitar a marcação círculos nas partes inferior da folha. </li></ol> Círculos marcando um dia antes do experimento não é essencial para o protocolo. No entanto, ele economiza tempo se houver um grande número de plantas que estão sendo analisadas, e faz com que seja mais fácil de conseguir o sincronismo preciso entre a indução da PTI e inoculações desafio. Parte 4: Indução da PTI DIA 3: <ol><li> Colher as células a partir da placa em 10 mM MgCl 2 para P. fluorescens e P. putida. Para Agrobacterium, centrifugar a cultura para coletar células e ressuspender em 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Repetir a centrifugação e ressuspender em solução de 2-MES MgCl. Medir a densidade óptica (DO) das células a 600 nm. Ajustar o ODS para os valores finais necessários conforme descrito na Tabela 2. Pseudomonas deve ser finalmente ressuspenso em 10 mM MgCl 2 e Agrobacterium na MgCl 2-MES solução. Um volume total de 25 ml é suficiente para inocular cerca de 40-50 pontos. </li><li> Infiltrar no PTI indutores para os círculos pré-marcadas nas folhas utilizando uma seringa de 1 ml sem agulha. Anote a ordem em que as plantas foram infiltradas eo tempo exato em que a infiltração foi iniciada. </li></ol> Parte 5: inoculação Desafio <ol><li> Prepare P. syringae pv tomate. DC3000, Pst DC3000 Δ hopQ1-1 e Ps pv. tabaci para o desafio, tal como descrito na parte 4.1 e Tabela 2. </li><li> Sete horas após a infiltração indutor, executar a infiltração desafio na mesma ordem de plantas como a indução foi feito. Geralmente, um ponto na periferia do círculo primeira inoculação pode ser usado como o centro do círculo segunda inoculação. Se há pontos múltiplos em uma folha, em seguida, certifique-se as infiltrações não se sobrepõem. </li><li> Diluições placa de série de todas as culturas utilizadas no ensaio de KBM ou LB placas contendo os antibióticos apropriados para determinar o número exato UFC. </li></ol> Parte 6: A pontuação para repartição do PTI Dia 5: <ol><li> Olhe para o surgimento de morte celular por ETI os pontos que foram desafiados com Pst DC3000. Morte celular dentro da área de sobreposição de infiltração indica uma repartição dos PTI e deve ser marcado como um fenótipo positivo. </li></ol> Dia 7: <ol start="2"><li> Olhe para o surgimento de morte celular devido à doença nos locais que foram desafiados com Pst DC3000 Δ hopQ1-1 ou pv Ps. Tabaci </em&gt;. Pontuação para um fenótipo positivo da mesma maneira como descrito na parte 6.1. </li></ol> Quando as plantas controle (que não deve ser comprometida por PTI) começam a mostrar a morte celular na área de sobreposição de infiltração, parar de fazer quaisquer observações adicionais. Parte 7: resultados Representante A Figura 1 mostra o resultado de um ensaio quando P. fluorescens foi usado como indutor e DC3000 Pst como o desafio. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. P. fluorescens foi infiltrada em N. benthamiana folhas (círculo preto) para induzir a PTI e 7 horas depois, o local foi desafiado com Pst DC3000 (círculo branco). Plantas silenciadas para FLS2 mostrou um colapso da PTI na região onde P. fluorescens foi infiltrada (A), como visto por morte celular. Plantas controle que não foram silenciadas não mostrou a morte celular na área de sobreposição devido à indução da PTI (B). Setas vermelhas indicam ausência ou presença de morte celular na área de sobreposição de infiltração. Fotografias foram tiradas dois dias após a infiltrações. Por favor, <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <table border="1"><tbody><tr><td> Indutor PTI </td><td> Morte celular provocando desafio </td><td> Natureza da morte celular </td><td> Código </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv tomato (Pst). DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> Pf / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETI </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 </td><td> Doença </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> Doença </td><td> Agro / ptab </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Combinações de PTI induzir e morte celular provocando micróbios usados ​​no ensaio para a morte celular PTI. <table border="1"><tbody><tr><td> Estirpe bacteriana </td><td> Meio de seleção </td><td> Finais OD usado em experimento </td><td> CFU correspondente / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM Ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM Ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0,02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 de diluição de 0,1 vezes </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 de diluição de 0,1 vezes </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Condições de cultura e níveis de inóculo utilizado no ensaio. O OD e níveis correspondentes UFC pode variar entre diferentes marcas de espectrofotômetros.

<ol>
	<li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity.">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li><li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+immune+system.">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li><li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception.">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li><li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins.">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li><li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotiana+benthamiana:+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions.">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li><li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana.">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li></ol>

A célula de ensaio de morte podem ser usadas para determinar o envolvimento de um gene no PTI. Por exemplo, perda de função mutantes para um gene de interesse pode ser testado com este ensaio. Das 4 combinações de indutor e inoculações desafio dada na Tabela 1, é possível que apenas uma combinação pode resultar em um fenótipo em seu fundo de plantas. Temos observado que as plantas silenciadas para FLS2 mostrar uma avaria do PTI na Pf / DC e Pf/Q1-1 combinações de indutor e inoculações desafio (Tabela 1). É essencial que as condições ambientais para o ensaio são o mais próximo possível às descritas na parte 3.1. A baixa umidade provoca a morte celular para continuar rápido demais, tornando o ensaio difícil de marcar. Se as condições descritas no nosso protocolo não funcionam em seu laboratório, em seguida, tentar alterar o nível de indutor ou inoculação desafio. Outro parâmetro que pode ser modificado é o intervalo de tempo entre indução e desafio, embora tenhamos encontrado que as lacunas de tempo mais curto fez com que o ensaio de quebrar muito rapidamente em plantas controle. Recomendamos que, pelo menos, 4-5 plantas ser testado em um experimento e um fenótipo positivo deve ser repetido em pelo menos 3-4 experimentos independentes.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. </td></tr><tr><td>Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

assay for pathogen-associated molecular pattern (pamp)-triggered immunity (pti) in plants

Para perceber patógenos potenciais em seu ambiente, as plantas usam receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) presentes nas membranas seu plasma. PRRs reconhecer recursos microbianos conservada chamado patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs) e isso leva à detecção de PAMP disparado imunidade (PTI), o que efetivamente previne a colonização de tecidos vegetais por patógenos não 1,2. O sistema mais bem estudado no PTI é a via de três FLS2-dependente. FLS2 reconhece a flg22 PAMP que é um componente dos flagelos bacterianos. Patógenos de sucesso possuem fatores de virulência ou efetores que pode suprimir PTI e permitir que o patógeno para causar a doença 1. Algumas plantas, por sua vez possuem genes de resistência que detectam efetores ou sua atividade, o que leva a efetoras disparado imunidade (ETI) 2. Descrevemos uma célula de ensaio da morte-based para PTI modificado a partir Ah, e Collmer 4. O ensaio foi padronizado em N. benthamiana, que está sendo usado cada vez mais como um sistema modelo para o estudo da planta-patógeno interações 5. PTI é induzida pela infiltração de uma cepa não-patogênica bacteriana em folhas. Sete horas depois, uma cepa bacteriana que causa a doença tanto ou que ativa ETI é infiltrado em uma área de sobreposição da zona de infiltração original. PTI induzida pela infiltração primeiro é capaz de retardar ou prevenir o aparecimento de morte celular, devido à infiltração segundo desafio. Por outro lado, a aparência de morte celular na área de sobreposição de inoculação indica uma repartição dos PTI. Quatro combinações diferentes de indutores do PTI e inoculações desafio foram padronizados (Tabela 1). O ensaio foi testado em não-silenciadas N. benthamiana plantas que serviram como controle e plantas silenciadas para FLS2 que estava previsto para ser comprometida em sua capacidade de desenvolver PTI.

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Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

Uma célula de ensaio de morte com base em plantas para PTI Nicotiana benthamiana é descrito.

Ensaio para Pathogen-Associated Padrão Molecular (PAMP) Triggered-Imunidade (PTI) em Plantas

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

assay-for-pathogen-associated-molecular-pattern-pamp-triggered

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

27.1K visualizações.  Boyce Thompson Institute for Plant Research. Uma célula de ensaio de morte com base em plantas para PTI Nicotiana benthamiana é descrito.

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The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Ambiente

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins with the ability to inhibit the host plant RNA silencing pathway. Unlike virus effector proteins, only several secreted effector proteins have showed the ability to suppress RNA silencing in bacterial, oomycete, and fungal pathogens, and the molecular functions of most effectors remain largely unknown. Here, we describe in detail a slightly modified version of the co-infiltration assay that could serve as a general method for observing RNA silencing and for characterizing effector proteins secreted by plant pathogens. The key steps of the approach are choosing the healthy and fully developed leaves, adjusting the bacteria culture to the appropriate optical density (OD) at 600 nm, and observing green fluorescent protein (GFP) fluorescence at the optimum time on the infiltrated leaves in order to avoid omitting effectors with weak suppression activity. This improved protocol will contribute to rapid, accurate, and extensive screening of RNA silencing suppressors and serve as an excellent starting point for investigating the molecular functions of these proteins.

Here, we present a modified screening method that can be extensively used to quickly screen RNA silencing suppressors in plant pathogens.

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Genética

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patossistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Imunologia e Infecção

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Biologia

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Medição Automatizada da Resposta Estomática à Invasão Bacteriana em Arabidopsis

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa estomática com medição automatizada de abertura

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Ensaio para Pathogen-Associated Padrão Molecular (PAMP) Triggered-Imunidade (PTI) em Plantas

Resumo

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Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patossistema

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Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

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