Damos las gracias a Hye Sook-Oh, Morello Joanne y Alan Collmer, Departamento de Patología Vegetal y Biología de las Plantas-Microbios, la Universidad de Cornell, valiosa para los debates. Damos las gracias a Jesse Munkvold comentarios sobre el artículo. El financiamiento fue proporcionado por el Programa Nacional de Ciencia Fundación Genoma Vegetal, el número de premios DBI-0605059 (GBM).

Parte 1: crecimiento de las plantas y el mantenimiento Plantas de Nicotiana benthamiana utilizado en el ensayo debe ser de 7 semanas de edad. Que se debe ajustar por lo menos 4-5 días antes de la prueba para eliminar todas las ramas axilares y flores. Es una buena idea para eliminar ramas axilares poco después de salir a fin de que las plantas sean más manejables. Parte 2: Cultivo bacteriano DIA 1: <ol><li> Placas o las culturas de todas las cepas utilizadas en el ensayo se inició al mismo tiempo. Para las especies de Pseudomonas. que incluyen dos inductores y 3 cepas de desafío, las bacterias en placas KBM racha que contienen los antibióticos apropiados de las existencias de glicerol congelado (Tabla 2). Una pequeña cantidad de bacterias debe ser esparcida en el centro de la placa. Incubar la placa a 30 ° C durante aproximadamente 18-24 horas. De Agrobacterium, iniciar un cultivo líquido en LB 2 ml de un plato fresco y crecer durante la noche a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> DIA 2: <ol start="2"><li> Por Pseudomonas, añadir 150-200 l de KBM líquido a las bacterias y los extendió sobre toda la placa con un esparcidor de vidrio estéril. Ponga la placa posterior en la incubadora y se deja crecer por otro 20-24 horas. Debe haber un césped bacteriano en la placa al día siguiente, lo que indica un buen crecimiento. De Agrobacterium, iniciar un cultivo secundario en alrededor de 50-10 ml de LB con 20 acetosiringona M y se deja crecer durante la noche a 20 horas a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> Parte 3: Plantas de Preparación para el ensayo DIA 2: <ol><li> Un día antes de la prueba de las plantas debe ser trasladado a una habitación a 22-24 ° C, la luz ~ 35-40% de humedad relativa y constante. </li><li> Marcar los círculos en las hojas que son al menos 1,5 cm de diámetro con un marcador negro grueso. De dos a cuatro círculos pueden ser marcados por hoja. Los círculos deben estar bien espaciados y, preferentemente, no cruzar una vena grande. Elegir bien amplió las hojas. Evite las hojas más viejas o las hojas que son difíciles o gruesa al tacto y evitar marcando los círculos en las partes bajas de la hoja. </li></ol> Círculos marcando un día antes de la prueba no es esencial para el protocolo. Sin embargo, se ahorra tiempo si hay un gran número de plantas que están siendo ensayadas, y hace más fácil para lograr una sincronización precisa entre la inducción de la PTI y las inoculaciones desafío. Parte 4: La inducción de la PTI DIA 3: <ol><li> Recoger las células de la placa en 10 mM de MgCl 2 para P. fluorescens y P. putida. De Agrobacterium, se centrifuga la cultura para recoger las células y resuspender en 10 mM de MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Repetir la centrifugación y se resuspenden en el MgCl2-MES solución. Medir la densidad óptica (DO) de las células a 600 nm. Ajuste la SAO a los valores finales requeridos como se describe en la Tabla 2. Pseudomonas debe ser finalmente resuspendido en 10 mM MgCl 2 y Agrobacterium en el MgCl2-MES solución. Un volumen total de 25 ml es suficiente para inocular alrededor de 40-50 puntos. </li><li> Infiltrarse en los inductores PTI en los círculos de pre-marcado en las hojas con una jeringa de 1 ml sin aguja. Anote el orden en que las plantas fueron infiltradas y el momento exacto en que la infiltración se inició. </li></ol> Parte 5: Desafío de la inoculación <ol><li> Prepare P. syringae pv. DC3000 tomate, Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 y $ pv tabaci. para el desafío, como se describe en el apartado 4.1 y la Tabla 2. </li><li> Siete horas después de la infiltración inductor, realizar la infiltración de desafío en el mismo orden de las plantas como la inducción se llevó a cabo. Por lo general, un punto en la periferia del círculo primera inoculación puede ser utilizado como el centro del círculo de la segunda inoculación. Si hay múltiples puntos en una hoja de continuación, asegúrese de que las infiltraciones no se superpongan. </li><li> Placa de diluciones seriadas de todos los cultivos utilizados para el ensayo en placas KBM o LB con los antibióticos apropiados para determinar el número exacto UFC. </li></ol> Parte 6: Puntaje para la descomposición del PTI Día 5: <ol><li> Busque la aparición de la muerte celular debido a la ETI en los lugares que fueron inoculados con Pst DC3000. La muerte celular en el interior del área de solapamiento de la infiltración indica el desglose de PTI y debe ser calificado como un fenotipo positivo. </li></ol> Día 7: <ol start="2"><li> Busque la aparición de la muerte celular debido a la enfermedad en los lugares que fueron inoculados con Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 o pv Ps. Tabaci </em&gt;. Puntuación de un fenotipo positivo de la misma manera como se describe en la parte 6.1. </li></ol> Cuando las plantas de control (que no debe verse comprometida por PTI) comienzan a mostrar la muerte celular en la zona de solapamiento de la infiltración, dejar de hacer nuevas observaciones. Parte 7: Los resultados representativos La figura 1 muestra el resultado de un ensayo cuando P. fluorescens fue utilizado como el inductor y Pst DC3000 como el desafío. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. P. fluorescens fue infiltrado en N. benthamiana hojas (círculo negro) para inducir la PTI y 7 horas más tarde, el acto fue impugnado con Pst DC3000 (círculo blanco). Plantas silenciadas por FLS2 mostró un desglose de PTI en la región donde P. fluorescens fue infiltrado (A), como se ve por la muerte celular. Las plantas de control que no fueron silenciados no mostró la muerte celular en la zona de solapamiento debido a la inducción de la PTI (B). Las flechas rojas indican la falta de presencia o de la muerte celular en el área de superposición de la infiltración. Las fotografías fueron tomadas dos días después de la infiltración. Por favor, <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <table border="1"><tbody><tr><td> PTI inductor </td><td> Provocando la muerte celular-desafío </td><td> La naturaleza de la muerte celular </td><td> Código </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv tomate (Pst). DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> Pf / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETI </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 6 </td><td> Enfermedad </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> Enfermedad </td><td> Agro / PTab </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Combinaciones de inducir la muerte celular PTI y que suscitan los microbios utilizados en el ensayo de la muerte celular por PTI. <table border="1"><tbody><tr><td> Cepa bacteriana </td><td> Selección del medio </td><td> OD final utilizada en el experimento </td><td> Correspondiente UFC / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB con rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0.02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 </td><td> KBM rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 veces la dilución de 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 veces la dilución de 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Las condiciones de cultivo y los niveles de inóculo utilizado en el ensayo. El OD y los correspondientes niveles UFC pueden variar entre diferentes marcas de espectrofotómetros.

<ol>
	<li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity.">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li><li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+immune+system.">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li><li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception.">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li><li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins.">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li><li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotiana+benthamiana:+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions.">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li><li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana.">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li></ol>

Ensayo de la muerte de la célula-basado puede ser utilizada para determinar la participación de un gen en el PTI. Por ejemplo, la pérdida de función de mutantes de un gen de interés se puede probar mediante este ensayo. De las cuatro combinaciones de inductor e inoculaciones desafío en la Tabla 1, es posible que sólo una combinación puede resultar en un fenotipo en el fondo de la planta. Hemos observado que las plantas silenciadas por FLS2 muestran un desglose del PTI en el Pf / DC y Pf/Q1-1 combinaciones de inductor e inoculaciones desafío (Tabla 1). Es esencial que las condiciones ambientales para el ensayo son lo más cercano posible a los descritos en la parte 3.1. La baja humedad provoca la muerte celular de proceder con demasiada rapidez, haciendo que el ensayo de difícil calificación. Si las condiciones descritas en el protocolo de no trabajar en su laboratorio, y luego tratar de alterar el nivel de inductor o inoculación de desafío. Otro parámetro que se puede modificar es el intervalo de tiempo entre la inducción y la provocación, aunque se ha encontrado que más cortos intervalos de tiempo causó que el ensayo se descomponen muy rápidamente en las plantas de control. Le recomendamos que por lo menos 4-5 plantas a prueba en un experimento y un fenotipo positivo se debe repetir por lo menos en experimentos independientes 3-4.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. </td></tr><tr><td>Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

assay for pathogen-associated molecular pattern (pamp)-triggered immunity (pti) in plants

Para percibir los patógenos potenciales en su entorno, las plantas utilizan receptores de reconocimiento de patrones (RRP) presentes en su membrana plasmática. PRR reconoce conserva las características microbianas llamado patógeno patrones moleculares asociados (PAMP) y esto lleva a la detección de PAMP disparado por la inmunidad (PTI), lo que efectivamente previene la colonización de los tejidos de la planta por no patógenos 1,2. El sistema más estudiado bien en PTI es la vía 3 FLS2-dependiente. FLS2 reconoce la flg22 PAMP que es un componente de la flagelina bacteriana. Patógenos éxito poseen factores de virulencia o efectores que pueden suprimir la PTI y permitir que el patógeno que causa la enfermedad 1. Algunas plantas, a su vez poseen los genes de resistencia que detectan los efectores o su actividad, lo que lleva a efectores activados por la inmunidad (ETI) 2. Se describe una celda de la muerte de ensayo basado en la PTI modificado a partir de Oh y Collmer 4. El ensayo fue estandarizado en el N. benthamiana, que se está utilizando cada vez más como un sistema modelo para el estudio de las interacciones planta-patógeno 5. PTI es inducida por la infiltración de una cepa no patógena de bacterias en las hojas. Siete horas después, una cepa bacteriana que causa la enfermedad o bien que se activa la ETI se infiltra en una zona de solapamiento de la zona de infiltración original. PTI inducida por la primera infiltración es capaz de retrasar o prevenir la aparición de la muerte celular debido a la infiltración segundo desafío. Por el contrario, la aparición de la muerte celular en la zona de solapamiento de la inoculación indica el desglose de PTI. Cuatro combinaciones diferentes de los inductores del PTI y las inoculaciones desafío fueron estandarizadas (Tabla 1). El ensayo fue probado en no callar N. benthamiana plantas que sirvieron de control y las plantas de silencio para FLS2 que se prevé que se compromete en su capacidad de desarrollar PTI.

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Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

Una célula de la muerte de ensayo basado en la PTI en plantas de Nicotiana benthamiana se describe.

Ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (PAMP)-Accionados Inmunidad (PTI) en las plantas

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

assay-for-pathogen-associated-molecular-pattern-pamp-triggered

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

27.1K vistas.  Boyce Thompson Institute for Plant Research. Una célula de la muerte de ensayo basado en la PTI en plantas de Nicotiana benthamiana se describe.

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The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

La prueba de infección de planta: Spray y mediada por la herida la inoculación con el patógeno de planta Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Investigación

Medio ambiente

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins with the ability to inhibit the host plant RNA silencing pathway. Unlike virus effector proteins, only several secreted effector proteins have showed the ability to suppress RNA silencing in bacterial, oomycete, and fungal pathogens, and the molecular functions of most effectors remain largely unknown. Here, we describe in detail a slightly modified version of the co-infiltration assay that could serve as a general method for observing RNA silencing and for characterizing effector proteins secreted by plant pathogens. The key steps of the approach are choosing the healthy and fully developed leaves, adjusting the bacteria culture to the appropriate optical density (OD) at 600 nm, and observing green fluorescent protein (GFP) fluorescence at the optimum time on the infiltrated leaves in order to avoid omitting effectors with weak suppression activity. This improved protocol will contribute to rapid, accurate, and extensive screening of RNA silencing suppressors and serve as an excellent starting point for investigating the molecular functions of these proteins.

Here, we present a modified screening method that can be extensively used to quickly screen RNA silencing suppressors in plant pathogens.

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Genética

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Inmunología e Infección

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Biología

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Medición automatizada de la respuesta estomática a la invasión bacteriana en Arabidopsis

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Autor destacado: Avance de la investigación estomática con la medición automatizada de la apertura

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (PAMP)-Accionados Inmunidad (PTI) en las plantas

Resumen

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Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

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