Os autores gostariam de agradecer o Dr. Werner Birgit por sua ajuda com a produção deste artigo vídeo. Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de CARREIRA NSF.

Parte 1: Preparação Experimental Procedimentos experimentais realizados em caranguejos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Universidade de Boston. Os animais são comprados dos laboratórios de Biologia Marinha (Woods Hole, MA) ou outro fornecedor e alojados em um aquário de água salgada aerada em uma sala exposta a um ciclo claro-escuro regulamentado. O esquema de iluminação é importante para entraining relógio circadiano do caranguejo e andar de bicicleta o olho diariamente entre seus estados diurnos e noturnos. Imediatamente antes de iniciar qualquer procedimento invasivo, o animal é resfriado em um balde de gelo por 10-15 minutos, até que seu movimento é lento e, em seguida, preso a uma plataforma de madeira com dois parafusos de aço inoxidável inserida no prosoma e dois na opisthosoma. A plataforma é ponderada por baixo com granito de modo a afundar na água. Após experimentos terminal o animal é sacrificado por imersão em pasta de gelo novamente e mielotomia o cérebro, que fica acima da boca, com um bisturi. Parte 2: Soluções Solução Limulus Ringer é composta de 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 ìm TES, HEPES 50 ìm e 10ml / L Pen-Strep mix (penicilina-estreptomicina, 10.000 unidades / ml) . Parte 3: Gravação Eletrorretinograma Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, vaselina, solução de Ringer, uma pipeta, um LED verde, uma câmara de gravação, parafusos de aço inoxidável, e um cotonete. <ol><li> Uma câmara à mão é usado para gravar o ERG (Figura 1A). O corpo da câmara é projetado para manter um reservatório de solução salina em contato com o olho. A tampa contém um fio de cloreto de prata para o acoplamento da solução condutora a um amplificador e um furo de pequeno porte para acomodar um LED. Um ultrabright LED com emissão de pico por volta de 520nm funciona melhor. </li><li> Para começar, a parte inferior da câmara é revestida com vaselina e garantiu sobre o olho com dois parafusos. </li><li> A câmara é então preenchido com solução salina e tampado com a tampa. </li><li> Depois de penhora câmara o caranguejo é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O cabo de LED é inserida na tampa de câmara. </li><li> A liderança do sinal é cortada ao fio, cloreto e o eletrodo referência é cortada para um dos parafusos implantados. </li><li> Ambos os terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial de alta impedância (X células 3x4, FHC Inc) para amplificação de sinal e amplificador de o filtro está definido para passar freqüências abaixo de 10Hz. </li><li> A saída do amplificador é alimentado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador. </li><li> Após a instalação a porta da gaiola está fechada para bloquear a luz da sala de atingir o animal. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa pisca o LED, registra o evocado ERG sinal, e mede a amplitude da resposta pico a pico. A escolha do paradigma de flash depende do objetivo experimental. Por exemplo, uma breve (100ms) pulso de 5V aplicada a cada 10 minutos para o LED evita efeitos de adaptação luz quando o monitoramento de mudanças circadiano na sensibilidade dos olhos. </li></ol> Parte 4: gravação do nervo óptico Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, fio, um trépano, solução de Ringer, fórceps, tesouras Vannas, uma câmara de gravação, uma pinça curva, sondas agulha fina, um maçante bisturi, tesouras cirúrgicas, e um eletrodo de sucção. <ol><li> Uma câmara à mão é usado para gravar as respostas do nervo óptico (Figura 1B). O interior da câmara é dois centímetros de diâmetro, bem aberto que tem uma abertura semicircular fina fenda na parede inferior para acomodar o nervo e isolá-lo do tecido circundante. </li><li> Antes de penhora câmara de uma agulha de calibre 16 é inserido entre os músculos da dobradiça para o coração e ~ 20cc de sangue é drenado do animal. Exsanguination não é necessária, mas torna a dissecção do nervo óptico mais fácil. </li><li> A localização do nervo óptico é estimado pelo desenho na carapaça de uma linha ligeiramente curva entre os olhos laterais e mediana. </li><li> Um buraco circular é então cortada na carapaça com uma trefina. O buraco é o mesmo diâmetro que a câmara também. O centro do buraco está localizado 2-3 cm anterior ao olho lateral e ligeiramente dorsal à linha para que o nervo percorre a porção ventral do poço. </li><li> Tecido conjuntivo é liberado até que o nervo é totalmente visível e livre de torno e subjacentes do tecido. </li><li> Um fio de linha é enrolada ao redor do nervo e puxou para dentro da câmara através da ranhura na parte inferior. Através desta mesma abertura do nervo é suavemente guiado para a câmara, puxando a corda. Ao mesmo tempo, a câmara também é inserido no furo. A câmara é então aposta a carapaçacom parafusos eo poço é preenchido com solução de Ringer. </li><li> Depois de penhora câmara o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O bem é visualizado sob um estereoscópio (SMZ-168, Jed Pella Inc) e algodão é preenchido em torno da abertura no fundo para evitar fugas de sangue e soro fisiológico para fora da câmara. </li><li> Tecido conjuntivo residual ao redor do nervo é removida com tesoura fina e pinça, ea câmara é abastecido com solução de Ringer fresco é. </li><li> Um nick é feita no vaso sanguíneo que encapsula o nervo e, através desta abertura que o nervo é cuidadosamente desheathed longo de seu comprimento com uma tesoura fina, pinças, sondas e agulhas. </li><li> Um feixe de fibras minúsculas é separado do nervo utilizando a sonda e corte no final mais afastada do olho para a gravação de fibras aferentes e no final mais próximo ao olho para a gravação de fibras eferentes. No vídeo o fim das gravações de fibra aferente é cortado. </li><li> Um eletrodo microsuction (AM Systems Inc) preenchidas com solução de Ringer é usado para a gravação do nervo óptico. A ponta do eletrodo é montado no feixe de nervos pelo fogo polimento final de um vidro de borosilicato 1 milímetro de diâmetro capilar. </li><li> A ponta do eletrodo é rebaixada para a câmara de bem com um manipulador manual (WPI Inc), eo feixe de fibras cortadas é sugado para a ponta. Sucção é fornecido por uma seringa Gilmont conectados ao eletrodo por meio de tubulação. </li><li> Uma conexão BNC fornece a liderança de sinal e um fio de cloreto de prata enrolada em torno do eletrodo para reduzir o ruído fornece a liderança de referência. Os dois terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial para a amplificação do sinal e filtragem de ruído (X células 3x4, FHC Inc). A saída do amplificador é enviado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) e interfaces digitais com um pico discriminador (APM, FHC Inc) que os registros de trens de pico. A luz pode ser entregue a uma única célula no olho através de um tubo de luz de fibra óptica ou para todo o olho através de um display de vídeo controlado por computador. </li></ol> Parte 5: gravação intra Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, uma em forma de L plataforma de acrílico com furos roscados, um suporte de microeletrodos com uma pipeta de vidro, parafusos de aço inoxidável, pinças e um bisturi fino. <ol><li> Uma placa de acrílico artesanais com furos pré-é usado para gravar as respostas intracelulares. Os furos são espaçados para a montagem de um micromanipulador motorizado (PPM5000, WPI Inc). A placa é anexado ao animal com dois parafusos na lateral e um na parte superior. </li><li> Após fixação da placa o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O microposicionador é parafusada na placa, com o seu braço móvel alinhado sobre o olho. </li><li> Um lote de micropipetas de vidro são puxados a partir de 1 mm OD vidro borossilicato e as pontas são backfilled via ação capilar, colocando o micropipetas em um pequeno frasco de solução de KCl 3M. </li><li> O resto das pipetas são preenchidos manualmente com a solução de sal e inserido em um suporte do eletrodo. </li><li> O suporte do eletrodo é conectado ao palco a cabeça de um amplificador intracelular (IR-283, Cygnus Technology Inc) aposta no braço microposicionador. </li><li> Uma seção pequena da retina (~ 1mm2) é exposto pelo corte de distância da interface córnea com uma lâmina de barbear. </li><li> Uma gota de solução de Ringer é colocado na retina exposta para evitar a secagem ea ponta micropipeta é avançada através da abertura no tecido da retina. </li><li> Quando a ponta entra na solução, o modo de injeção de corrente do amplificador intracelular está envolvido e impedância de eletrodo é medido. Micropipetas com impedância fora do intervalo de 20-70 MW são descartados. Aqueles nesta faixa são avançados em passos micron e empalado em células vibrando a ponta da pipeta eletronicamente ou mecanicamente. </li><li> Três tipos de células podem ser encontradas no olho. Retinular células apresentam apenas uma resposta despolarizante à luz, as células excêntrico mostram um trem de potenciais de ação montado em uma resposta despolarizante, e as células de pigmento não mostram nenhuma resposta clara a todos. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em Labview. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Sistemas de Cambridge Research). Os estímulos são entregues às células empalado com um tubo de fibra óptica ou exibição de vídeo. Respostas de tensão são observados no osciloscópio e digitalizados pelo programa para computador. </li></ol> Parte 6: Resultados Representante A ERG representativa é mostrado na Figura 2A. A forma de onda representa a elétrica resumiuresposta à luz dos principalmente a células fotorreceptoras retinular, uma vez que em muito ultrapassam as células excêntrico e são eletricamente acoplados a eles. Não há forma de onda componentes múltiplos de diferentes tipos de células da retina como com o ERG de mamíferos. Retorno de um relógio circadiano no cérebro Limulus modula as propriedades fisiológicas das células da retina em uma base diária, fazendo com que o curso amplitude e tempo do ERG para variar ao longo do tempo (1). Conforme mostrado na Figura 2B, ERG amplitude é maior durante a noite subjetiva do animal menor e durante o dia subjetiva. Um traço de representante de uma resposta de fibra do nervo óptico único para a luz é mostrado na Figura 3. Células excêntricas todos se comportam da mesma ordem, mostrando um aumento transitório na taxa de descarga pico seguido de uma decadência a um nível sustentado. A decadência taxa reflete a ação combinada de adaptação luz e aumento dependente da auto-inibição em células excêntricas (2). Outros padrões espiga, como a luz-dependente diminui na taxa, são vistos no cérebro Limulus, mas não o olho (3). Traços representativos da resposta de tensão de uma célula de células de pigmento, células retinular, e excêntrico à luz são mostrados na Figura 4. Apenas os dois últimos tipos de células da retina são visuais. O curso de amplitude e tempo de sua resposta depende da qualidade da gravação e da localização do eletrodo no interior da célula. Geralmente, o eletrodo penetra nas células de pigmento ou células retinular por causa de seu grande tamanho e número. Neste último caso, uma despolarização transitória que decai a um nível sustentado é gravado. A decadência é devido à adaptação de luz por células retinular (2). Se o eletrodo entra em uma célula excêntrico, grandes potenciais de ação são registrados no axônio (40-70mV) e potenciais de ação pequeno montado em uma forma de onda despolarizante (&lt;25mV) perto da soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Diagramas esquemático das câmaras utilizadas para a gravação eletrorretinograma (A) e gravação de nervo óptico (B). Bar é igual a 7mm de A e 5mm de B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Traço Exemplo de um ERG Limulus evocado por um pulso de 100ms LED 5V no escuro (A) ea flutuação pico-a-pico em ERG amplitude ao longo do tempo na escuridão constante (B). Escuridão foi iniciado no momento indicado pelo triângulo branco. O crescimento da amplitude do ERG durante o tempo indicado pelo triângulo preto é devido à adaptação de luz, que aumenta a sensibilidade do olho no escuro. A variação cíclica na amplitude do ERG depois disso é devido ao relógio interno do animal circadiano. Pontos no tempo B são cada 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Traço Exemplo de uma resposta do nervo óptico de fibra à luz brilhou em um único receptor ommatidial. Forma de onda acima do rastreamento mostra momento estímulo. Células excêntricas, cujos axônios dão origem a fibras nervosas, todas apresentam um padrão semelhante de disparar como este nas condições de iluminação do experimento (5 segundos o flash no escuro total). Codificação da retina com picos é um Limulus propriedade tem em comum com mamíferos, ao contrário de outros invertebrados. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="figura 4" /> Figura 4 traços Exemplo da resposta de tensão à luz dos três tipos de células presentes no olho Limulus lateral:. Células de pigmento (A), célula retinular (B), e célula excêntrico (C). A primeira célula é não-visual. Os dois últimos despolarizar em cima de um flash de luz. A despolarização é maior para as células retinular porque transdução da luz e enviar o sinal através de junções para a célula excêntrico, com alguma perda ao longo do caminho. Na célula excêntrico, potenciais de ação disparados pelo axônio são vistos andando sobre a despolarização devido à backpropagation pico na soma. A amplitude dos potenciais de ação tem sido atenuada na figura para melhor visualização do potencial despolarizante. O potencial de repouso das células é-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Nós ilustramos como realizar gravações ERG, gravações nervo óptico, e gravações de caranguejos-ferradura intra-in vivo. As técnicas de gravação cada fornecer informações diferentes sobre a base neural da visão, e todos eles podem ser usados ​​para estudar a função da retina em animais vivos graças aos olhos grandes do caranguejo e da carapaça dura. Atividade do nervo óptico pode até mesmo ser gravado a partir de animais se comportando livremente no oceano com a construção adequada de eletrodos ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

O caranguejo-ferradura americano, Limulus Polifemo é uma das mais antigas criaturas na terra, eo animal continua a desempenhar um papel indispensável na pesquisa biomédica. Não só o seu sangue contém células especiais que os cientistas usam para detectar bacteriotoxins em nossos medicamentos, mas seus olhos também contêm uma rede neural que tem proporcionado uma visão muito sobre os processos fisiológicos que operam em nosso sistema visual, como a adaptação de luz e inibição lateral. O caranguejo-ferradura continua a ser um modelo atraente para a investigação da visão porque o animal é grande e resistente para um invertebrado, seus neurônios da retina são grandes e de fácil acesso, seu sistema visual é compacto e extensivamente estudado, e seu comportamento visual é bem definida. Além disso, a estrutura eo funcionamento dos olhos são modulados em uma base diária por um relógio circadiano no cérebro do animal s. Em suma, o sistema visual de caranguejos-ferradura é bastante simples de ser entendido ainda complexo o suficiente para ser interessante. Neste vídeo apresentamos três paradigmas eletrofisiológicos para investigar as bases neurais da visão que podem ser realizados in vivo com Limulus. Eles estão gravando eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra. Eletrorretinograma (ERG) gravações medida com uma superfície do eletrodo a resposta resumiu elétrica de todas as células do olho para um flash de luz. Eles podem ser usados ​​para monitorar a sensibilidade global do olho para prolongar os períodos de tempo. Gravações nervo óptico medir a atividade spiking de fibras nervosas individuais com um eletrodo microsuction extracelular. Elas podem ser usadas para estudar as mensagens visuais transmitidas do olho para o cérebro, bem como relógio circadiano-alimentado de volta mensagens do cérebro para os olhos. Medida intra gravações com um microeletrodo intracelular as flutuações de tensão induzida pela luz em células individuais do olho. Elas podem ser usadas para elucidar os mecanismos celulares de processamento da retina.

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Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Neste vídeo podemos executar a gravação eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra-americano com o caranguejo-ferradura,<em&gt; Limulus Polyphemus</em&gt;. Esses paradigmas eletrofisiológicos pode ser usado para investigar as bases neurais da visão em um laboratório de pesquisa ou ensino.

Usando o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus, Em Vision Research

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K visualizações.  Boston University. Neste vídeo podemos executar a gravação eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra-americano com o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus. Esses paradigmas eletrofisiológicos pode ser usado para investigar as bases neurais da visão em um laboratório de pesquisa ou ensino.

Vídeo: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Biologia

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Um protocolo para o uso de Gene definir análise de enriquecimento para identificar o modelo Animal adequado para investigação de translação

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Usando o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus, Em Vision Research

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

A técnica de rim perfundidos rato isolado

Um protocolo para o uso de Gene definir análise de enriquecimento para identificar o modelo Animal adequado para investigação de translação

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI