Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

A montagem in vivo é um método de clonagem independente de ligação que depende de enzimas intrínsecas de reparo de DNA em bactérias para montar fragmentos de DNA por recombinação homóloga. Este protocolo é eficaz em termos de tempo e custo, uma vez que são necessários poucos reagentes e a eficiência da clonagem pode chegar aos 99%.

A montagem in vivo (IVA) é um método de clonagem molecular que utiliza enzimas intrínsecas presentes em bactérias que promovem a recombinação intermolecular de fragmentos de DNA para montar plasmídeos. Este método funciona transformando fragmentos de DNA com regiões de 15-50 pb de homologia em cepas de Escherichia coli de laboratório comumente usadas e as bactérias usam a via de reparo independente de RecA para montar os fragmentos de DNA em um plasmídeo. Este método é mais rápido e econômico do que muitos métodos de clonagem molecular que dependem da montagem in vitro de plasmídeos antes da transformação em cepas de E. coli . Isso ocorre porque os métodos in vitro requerem a compra de enzimas especializadas e a realização de reações enzimáticas sequenciais que requerem incubações. No entanto, ao contrário dos métodos in vitro , o IVA não demonstrou experimentalmente montar plasmídeos lineares. Aqui compartilhamos o protocolo IVA usado por nosso laboratório para montar rapidamente plasmídeos e subclonar fragmentos de DNA entre plasmídeos com diferentes origens de replicação e marcadores de resistência a antibióticos.

A clonagem molecular engloba uma série de técnicas laboratoriais necessárias para produzir plasmídeos contendo DNA recombinante específico¹. Essas técnicas onipresentes geralmente atuam como um gargalo no fluxo de trabalho experimental². Muitas técnicas de clonagem molecular dependem da montagem de fragmentos de DNA in vitro usando uma série de reações enzimáticas antes da transformação em uma cepa hospedeira (por exemplo, Escherichia coli DH5a) para amplificação 3,4,5,6,7. Como os métodos de montagem de plasmídeos in vitro dependem de enzimas, a compra ou purificação de enzimas pode ser cara e demorada.

A montagem in vivo (IVA) é um método de clonagem molecular que se baseia na recombinação intermolecular de fragmentos de DNA em um hospedeiro adequado ^8,9,10,11,12. A base deste método foi a observação de que cepas de clonagem de E. coli comumente usadas poderiam mediar a recombinação intermolecular de um primer de fita simples com um plasmídeo clivado por enzimas de restrição¹³. O uso de PCR para gerar extremidades de DNA homólogas para montagem de plasmídeos em E. coli foi descrito na década de 1990 e esse método foi denominado PCR de recombinação ^3,14. A eficiência da PCR de recombinação foi relatada em aproximadamente 50%¹⁴. No entanto, esse método não foi amplamente adotado, provavelmente devido ao alto custo dos primers e ao risco de introdução de mutações indesejadas usando polimerases de baixa fidelidade para amplificar grandes fragmentos de DNA. Essas desvantagens foram significativas na década de 1990 e poderiam ser evitadas usando métodos de clonagem in vitro, como a clonagem mediada por enzimas de restrição.

Nos últimos anos, o custo dos primers diminuiu e novas polimerases comerciais aumentaram a fidelidade da amplificação por PCR. Como resultado, a PCR de recombinação foi revisitada como uma técnica de clonagem molecular rápida e econômica e renomeada como IVA 2,9,15,16. Com o aumento da viabilidade, o IVA foi explorado e o método foi otimizado para atingir eficiências de clonagem de até 99%¹⁶. As otimizações identificaram características do DNA homólogo, como número de pares de bases e temperatura de fusão, que maximizam a eficiência da recombinação in vivo ^2,16. Uma análise mais aprofundada mostrou que até 6 fragmentos de DNA variando de 150 bp a 7 kbp poderiam ser montados de forma eficiente por IVA¹⁵. Além disso, nosso grupo recentemente usou o IVA para montar uma série de plasmídeos com diferentes de resistência a antibióticos e origens de replicação¹⁷. Neste estudo, a clonagem IVA foi altamente eficiente (71-100%) com um pequeno número de clones testados para cada plasmídeo (n = 2)¹⁷. Aqui descrevemos o protocolo IVA usado por nosso laboratório.

1. Projete primers ou fragmentos de DNA com extremidades homólogas

1. Use um software de processamento de texto ou software especializado de análise de DNA para montar artificialmente o plasmídeo desejado.
   NOTA: Muitas vezes é útil codificar por cores fragmentos de DNA de diferentes fontes e destacar regiões homólogas que serão usadas nas etapas de montagem a jusante. Além disso, também é útil codificar por cores o DNA homólogo para garantir a montagem direcional.
2. Projete primers que se liguem a cada fragmento de DNA e contenham 15-50 pb da sequência de DNA homóloga (Figura 1)^2,15.
   1. Para aumentar a eficiência do IVA, certifique-se de que os fragmentos de DNA homólogos tenham temperaturas de fusão de 47-52 °C².
      NOTA: A temperatura de fusão pode ser determinada usando o software online¹⁸ ou a fórmula: Temperatura de fusão = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), onde n = número de G, C, A ou T na sequência ^6,19.
   2. Evite primers com sequências altamente repetitivas como CATCATCATCATCATCAT que codificam para uma etiqueta HIS, pois podem introduzir instabilidade²⁰. Se uma sequência final de aminoácidos repetitivos for necessária para aplicações como inserir uma etiqueta poli-HIS, use códons alternativos como CATCACCATCATCACCAC para diminuir a repetição da sequência de ácidos nucleicos.
      NOTA: Os primers podem ser encomendados de qualquer fornecedor preferido. Se os fragmentos de DNA forem sintetizados, as extremidades homólogas devem ser incorporadas ao fragmento de DNA sintetizado.

2. Amplificação de produtos de DNA contendo extremidades homólogas

1. Isole o DNA do plasmídeo ou os modelos de DNA genômico usando kits de isolamento de DNA padrão disponíveis comercialmente ou lise alcalina ^6,17.
2. Utilizar ADN molde (do passo 2.1) e iniciadores contendo regiões homólogas (passo 1.2) numa reação de PCR com uma polimerase de alta fidelidade disponível no mercado. Para limitar o transporte do molde de DNA em reações a jusante, use uma quantidade baixa de DNA molde (20 pg-1 ng) em cada reação. Consulte as recomendações do fabricante para componentes de mistura de reação de PCR específicos da enzima e condições recomendadas de ciclagem de PCR. Prossiga com a reação de PCR.
   1. Configure as reações de PCR (50 μL) para amplificar os fragmentos de DNA mostrados na Figura 2 para conter 100 μM de dNTPs, 0,2 μM de cada primer de DNA, DNA molde (50 pg de pSU19 e 1 ng de pSU18mCherry), 1x mistura de tampão de reação de PCR contendo Mg²⁺ (concentração final de 2 mM) e 1 U de DNA polimerase de alta fidelidade.
   2. Use um programa de ciclagem de PCR de touchdown para amplificar pSU19 e mCherry (Figura 2). Defina a etapa inicial de desnaturação em 95 ° C por 5 min, seguida por 10 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C-0.5 ° C por ciclo por 15 s e 72 ° C por 1 min e, em seguida, 20 ciclos adicionais de 95 ° C por 15 s, 50 ° C por 15 s e 72 ° C por 1 min. Complete o ciclo de PCR com uma etapa final de extensão a 72 °C por 10 min.
      NOTA: Se um esqueleto de plasmídeo for amplificado, ajuste a quantidade de molde de DNA com base no peso molecular: com ~ 20 pg / 1 kbp de DNA de plasmídeo por 50 μL de reação de PCR (50 pg de DNA para pSU19 (mostrado)). Além disso, ajuste os ciclos de PCR para minimizar o número de mutações introduzidas durante a amplificação: para amplificação de esqueletos de plasmídeo, apenas 20-25 ciclos de PCR são suficientes.
3. Quando a reação de PCR estiver completa, remova uma alíquota (2 μL) da reação de PCR, combine com o corante de carga (até a concentração de 1x) e separe os fragmentos de DNA por eletroforese em gel de agarose²¹. Use um transiluminador ultravioleta (UV) ou LED para visualizar fragmentos de DNA que migraram no gel de agarose. Determine se os produtos de PCR são únicos e compare os produtos com a escada de DNA para verificar se eles têm o peso molecular esperado (Figura 2). Se nenhum produto de PCR com o peso molecular correto for visualizado, consulte as recomendações do fabricante para otimizar a reação de PCR.
   NOTA: Quando os produtos de PCR não são únicos, mas há um fragmento de DNA abundante correspondente ao peso molecular esperado, uma reação de PCR adicional pode ser evitada.
4. Se houver vários fragmentos de DNA presentes no gel de agarose, excisar o fragmento de DNA correspondente ao peso molecular esperado do gel de agarose e usar um kit de extração de gel de agarose para recuperar o fragmento de DNA.
5. Para remover o DNA molde metilado das reações de PCR, adicione 1 μL de DpnI diretamente ao tubo de reação. Incube as reações a 37 ° C por 15 minutos durante a noite.
   NOTA: Esta etapa opcional é altamente recomendada para limitar a quantidade de DNA molde que é transportada nas reações a jusante. No entanto, esta etapa pode ser ignorada se concentrações muito baixas de DNA molde forem usadas na reação de PCR.
6. Use um kit de purificação de ácido nucleico para remover enzimas residuais, sais, dímeros de primer e outros produtos indesejados de DNA de baixo peso molecular resultantes de ensaios enzimáticos.
   NOTA: As etapas 2.1-2.6 podem ser ignoradas se fragmentos de DNA forem sintetizados.
7. Quantificar a concentração de ADN dos fragmentos de ADN purificados por espectrofotometria ou estimativa em gel.

3. IVA (Figura 3)

1. Calcule a quantidade de DNA necessária para cada reação IVA (recomenda-se 25-50 ng de DNA plasmidial). Use quantidades maiores de DNA de plasmídeo para plasmídeos com maior peso molecular (por exemplo, para plasmídeos de 2,3 kbp, use 25 ng de plasmídeo, mas quando os plasmídeos forem de 9 kbp, use 50 ng em cada reação). Calcule o volume de DNA inserido necessário para a reação; use uma proporção molar de 1:3 ou 1:5 de plasmídeo: insira o DNA.
   NOTA: Calculadoras biológicas on-line ou as fórmulas fornecidas abaixo podem ser usadas para calcular a quantidade molar de um fragmento de DNA de fita dupla e determinar a proporção molar de cada fragmento de DNA.
   Usamos a seguinte fórmula para calcular a quantidade molar de um fragmento de DNA de fita dupla: pmol = (peso em ng) × 1.000 / (pares de bases × 650 daltons). Além disso, as razões molares podem ser calculadas por: inserção de massa (g) = razão molar desejada entre inserto/plasmídeo × massa de plasmídeo (g) × razão entre inserção e comprimentos de plasmídeo⁶.
2. Combine o volume calculado de plasmídeo e insira o DNA em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mL e mantenha no gelo.
3. Transferir o plasmídeo e inserir a mistura de ADN do passo 3.2 para uma alíquota (25-100 μL) de E. coli descongelada e quimicamente competente (por exemplo, E. coli DH5a;²²).
   NOTA: O volume de células competentes utilizadas depende do volume do plasmídeo e da mistura de ADN inserido; Esta mistura não deve exceder 10% do volume das células competentes.
4. Prossiga com uma transformação de choque térmico²³.
   1. Incubar a mistura de E. coli quimicamente competente e DNA em gelo por 30 min.
   2. Transfira para um banho-maria a 42 °C por 1 min e, em seguida, transfira o tubo para gelo por 2 min.
   3. Transfira assepticamente o LB para o tubo para completar o volume para 1 mL.
   4. Transferir o volume de 1 ml para um tubo de cultura de vidro e colocá-lo numa incubadora agitada a 37 °C, 220 rpm ou à temperatura recomendada para a recuperação da estirpe bacteriana e/ou plasmídeo (intervalo típico de 25 °C-37 °C) e permitir a produção do marcador de selecção de antibióticos codificado por plasmídeo.
5. Após as células terem se recuperado por 30 min a 1 h, deposite uma alíquota (100 μL de 1.000 μL) da reação de transformação em meio de seleção sólido e use um espalhador de células estéril para dispersar a alíquota pela placa de cultura de ágar. Colete o restante das células transformadas por centrifugação (13.000 × g por 1 min), descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 100 μL de meio estéril e deposite em meio de seleção sólido como acima. Deixe o líquido absorver em meio sólido por 30 min, inverta as placas de cultura. e coloque-os em uma incubadora durante a noite na temperatura recomendada para a cepa bacteriana e/ou plasmídeo.

4. Triagem para montagem correta de plasmídeo

1. Após a incubação (etapa 3.5), remova as placas de cultura da incubadora e enumere as colônias por contagem direta se houver várias colônias bacterianas isoladas em cada placa de cultura. Selecione várias colônias (1-10) para triagem para determinar se elas contêm o plasmídeo montado desejado.
   1. Transferir meios de cultura estéreis suplementados com antibióticos apropriados para tubos de cultura estéreis (vidro ou plástico). Inocule o meio de cultura tocando 1 colônia com uma agulha de transferência estéril ou alça e transfira as células para o meio do tubo de cultura com a agulha de transferência. Coloque os tubos de cultura em uma incubadora agitável e incube por 16-18 h na temperatura recomendada para a cepa bacteriana e / ou plasmídeo (faixa típica de 25 ° C a 37 ° C).
2. No dia seguinte, isole o DNA do plasmídeo das culturas bacterianas por lise alcalina⁶ ou usando um kit de isolamento de plasmídeo disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
3. Determine se os plasmídeos estão montados corretamente.
   1. Quantificar a concentração de DNA dos plasmídeos isolados por espectrofotometria ou estimativa de gel.
   2. Utilizar uma alíquota (50-150 ng) de ADN plasmidial para uma reacção diagnóstica de digestão por restrição (10 μL de volume final). Selecione enzimas de restrição com base em onde se espera que clivem o DNA do plasmídeo montado.
      NOTA: Recomendamos duas reações separadas: (1) tratar o DNA do plasmídeo com uma enzima de restrição que deve clivar o plasmídeo em um único local e (2) tratar o DNA do plasmídeo com duas enzimas de restrição que devem extirpar todo ou parte do fragmento de DNA inserido. As enzimas de restrição estão disponíveis comercialmente e devem ser usadas seguindo as instruções do fabricante.
   3. Quando a reação da enzima de restrição estiver completa, combine com o corante de carregamento (até a concentração de 1x), carregue toda a mistura em um gel de agarose e separe os fragmentos de DNA por eletroforese em gel de agarose²¹. Use um transiluminador UV ou LED para visualizar os fragmentos de DNA que migraram no gel de agarose. Compare fragmentos de DNA restritos com a escada de peso molecular para determinar se eles são o(s) peso(s) molecular(is) esperado(s) (Figura 4). Tome nota dos plasmídeos com os padrões de restrição enzimática esperados (chamados clones positivos); Descarte os tubos contendo plasmídeos que não têm o padrão de restrição esperado (chamados clones negativos).
4. Para garantir que os clones positivos tenham a sequência de nucleotídeos esperada, envie uma alíquota de clones de plasmídeo positivos para sequenciamento.
   NOTA: Recomenda-se o sequenciamento de plasmídeo completo (por exemplo, sequenciamento de nanoporos).

Neste manuscrito, como exemplo de uso do IVA, seguimos o fluxo de trabalho do IVA fornecido para reclonar o quadro de leitura aberto mCherry no local de clonagem múltipla do plasmídeo pSU19 para gerar um plasmídeo idêntico ao pSU19mCherry (Figura 3)¹⁷. Os primers adequados para IVA foram projetados com base nas etapas 1.1 e 1.2 do protocolo. Em seguida, um kit de isolamento de plasmídeo foi usado para isolar pSU19 e pSU18mCherry,...

A etapa mais crítica para a clonagem bem-sucedida do IVA é o design do fragmento de DNA e do primer. A eficiência do IVA é muito melhorada quando os fragmentos homólogos são projetados para ter pelo menos 15 pb de comprimento com uma temperatura de fusão de aproximadamente 47-52 °C. Um estudo detalhado explorando a otimização do design do fragmento IVA foi publicado¹⁶. Outro passo importante para ter alta eficiência de clonagem é usar o mínimo possí...

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O HGB é financiado por um programa de Bolsas de Pós-Graduação do Canadá - Mestrado do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e um Prêmio de Doutorado do Reitor (Universidade de Saskatchewan). Este trabalho foi apoiado por um NSERC Discovery Grant (RGPIN-2021-03066), fundos iniciais (para JLT) da Universidade de Saskatchewan e Canada Foundation for Innovation John R. Evans Leaders Fund (Grant número 42269 para JLT). Os autores agradecem ao Sr. Eric Toombs por fornecer a fotografia da quantificação do DNA por espectroscopia UV.