Utilizzo dell'assemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza

L'assemblaggio in vivo è un metodo di clonazione indipendente dalla legatura che si basa su enzimi intrinseci di riparazione del DNA nei batteri per assemblare frammenti di DNA mediante ricombinazione omologa. Questo protocollo è efficiente in termini di tempo e costi, poiché sono necessari pochi reagenti e l'efficienza di clonazione può raggiungere il 99%.

L'assemblaggio in vivo (IVA) è un metodo di clonazione molecolare che utilizza enzimi intrinseci presenti nei batteri che promuovono la ricombinazione intermolecolare di frammenti di DNA per assemblare plasmidi. Questo metodo funziona trasformando frammenti di DNA con regioni di 15-50 bp di omologia in ceppi di Escherichia coli di laboratorio comunemente usati e i batteri utilizzano la via di riparazione indipendente da RecA per assemblare i frammenti di DNA in un plasmide. Questo metodo è più rapido ed economico di molti metodi di clonazione molecolare che si basano sull'assemblaggio in vitro di plasmidi prima della trasformazione in ceppi di E. coli . Questo perché i metodi in vitro richiedono l'acquisto di enzimi specializzati e l'esecuzione di reazioni enzimatiche sequenziali che richiedono incubazioni. Tuttavia, a differenza dei metodi in vitro , l'IVA non ha dimostrato sperimentalmente di assemblare plasmidi lineari. Qui condividiamo il protocollo IVA utilizzato dal nostro laboratorio per assemblare rapidamente plasmidi e subclonare frammenti di DNA tra plasmidi con diverse origini di replicazione e marcatori di resistenza agli antibiotici.

Il clonaggio molecolare comprende una serie di tecniche di laboratorio necessarie per produrre plasmidi contenenti DNA ricombinante specifico¹. Queste tecniche onnipresenti spesso agiscono come un collo di bottiglia nel flusso di lavoro sperimentale². Molte tecniche di clonaggio molecolare si basano sull'assemblaggio di frammenti di DNA in vitro utilizzando una serie di reazioni enzimatiche prima della trasformazione in un ceppo ospite (ad esempio, Escherichia coli DH5a) per l'amplificazione 3,4,5,6,7. Poiché i metodi di assemblaggio dei plasmidi in vitro si basano sugli enzimi, l'acquisto o la purificazione degli enzimi può essere costoso e dispendioso in termini di tempo.

L'assemblaggio in vivo (IVA) è un metodo di clonaggio molecolare che si basa sulla ricombinazione intermolecolare di frammenti di DNA in un ospite adatto 8,9,10,11,12. La base di questo metodo è stata l'osservazione che i ceppi di clonaggio recA comunemente usati di E. coli potrebbero mediare la ricombinazione intermolecolare di un primer a singolo filamento con un plasmide scisso da enzimi di restrizione¹³. L'uso della PCR per generare estremità omologhe di DNA per l'assemblaggio di plasmidi in E. coli è stato descritto negli anni '90 e questo metodo è stato chiamato PCR di ricombinazione ^3,14. L'efficienza della PCR a ricombinazione è stata riportata essere di circa il 50%¹⁴. Tuttavia, questo metodo non è stato ampiamente adottato, probabilmente a causa dell'alto costo dei primer e del rischio di introdurre mutazioni indesiderate utilizzando polimerasi a bassa fedeltà per amplificare grandi frammenti di DNA. Questi inconvenienti erano significativi negli anni '90 e potevano essere evitati utilizzando metodi di clonazione in vitro come la clonazione mediata da enzimi di restrizione.

Negli ultimi anni, il costo dei primer è diminuito e le nuove polimerasi commerciali hanno aumentato la fedeltà dell'amplificazione PCR. Di conseguenza, la PCR a ricombinazione è stata rivisitata come tecnica di clonaggio molecolare rapida ed economica e rinominata IVA 2,9,15,16. Con una maggiore fattibilità, l'IVA è stata ulteriormente esplorata e il metodo è stato ottimizzato per raggiungere efficienze di clonazione fino al 99%¹⁶. Le ottimizzazioni hanno identificato caratteristiche del DNA omologo, come il numero di coppie di basi e la temperatura di fusione, che massimizzano l'efficienza di ricombinazione in vivo ^2,16. Ulteriori analisi hanno dimostrato che fino a 6 frammenti di DNA che vanno da 150 bp a 7 kbp potrebbero essere assemblati in modo efficiente con IVA¹⁵. Inoltre, il nostro gruppo ha recentemente utilizzato l'IVA per assemblare una serie di plasmidi con diverse cassette di resistenza agli antibiotici e origini di replicazione¹⁷. In questo studio, il clonaggio dell'IVA è risultato altamente efficiente (71-100%) con un piccolo numero di cloni testati per ciascun plasmide (n = 2)¹⁷. Qui descriviamo il protocollo IVA utilizzato dal nostro laboratorio.

1. Progettare primer o frammenti di DNA con estremità omologhe

1. Utilizza un software di elaborazione testi o un software specializzato per l'analisi del DNA per assemblare artificialmente il plasmide desiderato.
   NOTA: Spesso è utile codificare a colori frammenti di DNA provenienti da fonti diverse ed evidenziare le regioni omologhe che verranno utilizzate nelle fasi di assemblaggio a valle. Inoltre, è anche utile codificare a colori il DNA omologo per garantire l'assemblaggio direzionale.
2. Progettare primer che si legano a ciascun frammento di DNA e contengono 15-50 bp della sequenza di DNA omologa (Figura 1)^2,15.
   1. Per una maggiore efficienza IVA, assicurarsi che i frammenti di DNA omologhi abbiano temperature di fusione di 47-52 °C².
      NOTA: La temperatura di fusione può essere determinata utilizzando il software online¹⁸ o la formula: Temperatura di fusione = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), dove n = numero di G, C, A o T nella sequenza ^6,19.
   2. Evita i primer con sequenze altamente ripetitive come CATCATCATCATCAT che codificano per un tag HIS in quanto possono introdurre instabilità²⁰. Se è necessaria una sequenza finale ripetitiva di amminoacidi per applicazioni come l'inserimento di un tag poly-HIS, utilizzare codoni alternativi come CATCACCATCATCACCAC per ridurre la ripetizione della sequenza di acidi nucleici.
      NOTA: I primer possono essere ordinati da qualsiasi fornitore preferito. Se i frammenti di DNA devono essere sintetizzati, le estremità omologhe dovrebbero essere incorporate nel frammento di DNA sintetizzato.

2. Amplificazione di prodotti a base di DNA contenenti estremità omologhe

1. Isolare il DNA plasmidico o i modelli di DNA genomico utilizzando i kit standard di isolamento del DNA disponibili in commercio o la lisi alcalina ^6,17.
2. Utilizzare DNA stampo (dal passaggio 2.1) e primer contenenti regioni omologhe (passaggio 1.2) in una reazione PCR con una polimerasi ad alta fedeltà disponibile in commercio. Per limitare il carryover del DNA stampo nelle reazioni a valle, utilizzare una bassa quantità di DNA stampo (20 pg-1 ng) in ciascuna reazione. Fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per i componenti della miscela di reazioni PCR specifiche per l'enzima e le condizioni consigliate per il ciclo PCR. Procedere con la reazione PCR.
   1. Impostare le reazioni PCR (50 μL) per amplificare i frammenti di DNA mostrati nella Figura 2 in modo che contengano 100 μM di dNTP, 0,2 μM di ciascun primer di DNA, DNA stampo (50 pg di pSU19 e 1 ng di pSU18mCherry), 1x miscela di tampone di reazione PCR contenente Mg²⁺ (concentrazione finale di 2 mM) e 1 U di DNA polimerasi ad alta fedeltà.
   2. Utilizzare un programma di ciclismo PCR touchdown per amplificare pSU19 e mCherry (Figura 2). Impostare la fase iniziale di denaturazione a 95 °C per 5 minuti, seguita da 10 cicli di 95 °C per 15 secondi, 55 °C-0,5 °C per ciclo per 15 secondi e 72 °C per 1 minuto, quindi 20 cicli aggiuntivi di 95 °C per 15 secondi, 50 °C per 15 secondi e 72 °C per 1 minuto. Completare il ciclo di PCR con una fase finale di estensione a 72 °C per 10 minuti.
      NOTA: Se una spina dorsale plasmidica deve essere amplificata, regolare la quantità di DNA stampo in base al peso molecolare: con ~20 pg/1 kbp di DNA plasmidico per 50 μL di reazione PCR (50 pg di DNA per pSU19 (mostrato)). Inoltre, regolare i cicli di PCR per ridurre al minimo il numero di mutazioni introdotte durante l'amplificazione: per l'amplificazione delle dorsali plasmidiche sono sufficienti solo 20-25 cicli di PCR.
3. Una volta completata la reazione di PCR, rimuovere un'aliquota (2 μL) della reazione di PCR, combinarla con il colorante di caricamento (fino a 1x la concentrazione) e separare i frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio²¹. Utilizzare un transilluminatore a raggi ultravioletti (UV) o LED per visualizzare i frammenti di DNA che sono migrati nel gel di agarosio. Determinare se i prodotti PCR sono unici e confrontare i prodotti con la scala del DNA per verificare se hanno il peso molecolare previsto (Figura 2). Se non vengono visualizzati prodotti per PCR con il peso molecolare corretto, fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per ottimizzare la reazione PCR.
   NOTA: Quando i prodotti PCR non sono unici ma c'è un abbondante frammento di DNA corrispondente al peso molecolare previsto, è possibile evitare un'ulteriore reazione PCR.
4. Se nel gel di agarosio sono presenti più frammenti di DNA, asportare il frammento di DNA corrispondente al peso molecolare previsto dal gel di agarosio e utilizzare un kit di estrazione del gel di agarosio per recuperare il frammento di DNA.
5. Per rimuovere il DNA stampo metilato dalle reazioni di PCR, aggiungere 1 μL di DpnI direttamente alla provetta di reazione. Incubare le reazioni a 37°C per 15 minuti o tutta la notte.
   NOTA: Questo passaggio facoltativo è altamente raccomandato per limitare la quantità di DNA stampo che viene trasportata nelle reazioni a valle. Tuttavia, questo passaggio può essere saltato se nella reazione PCR vengono utilizzate concentrazioni molto basse di DNA stampo.
6. Utilizzare un kit di purificazione degli acidi nucleici per rimuovere gli enzimi residui, i sali, i dimeri di primer e altri prodotti indesiderati a basso peso molecolare del DNA derivanti da saggi enzimatici.
   NOTA: I passaggi 2.1-2.6 possono essere saltati se vengono sintetizzati frammenti di DNA.
7. Quantificare la concentrazione di DNA dei frammenti di DNA purificati mediante spettrofotometria o stima su gel.

3. IVA (Figura 3)

1. Calcolare la quantità di DNA necessaria per ogni reazione IVA (si consigliano 25-50 ng di DNA plasmidico). Utilizzare quantità maggiori di DNA plasmidico per plasmidi con peso molecolare più elevato (ad esempio, per plasmidi di 2,3 kbp, utilizzare 25 ng di plasmide, ma quando i plasmidi sono 9 kbp, utilizzare 50 ng in ogni reazione). Calcolare il volume di DNA dell'inserto necessario per la reazione; utilizzare un rapporto molare 1:3 o 1:5 di plasmide:inserire DNA.
   NOTA: I biocalcolatori online o le formule fornite di seguito possono essere utilizzati per calcolare la quantità molare di un frammento di DNA a doppio filamento e determinare il rapporto molare di ciascun frammento di DNA.
   Utilizziamo la seguente formula per calcolare la quantità molare di un frammento di DNA a doppio filamento: pmol = (peso in ng) × 1.000 / (coppie di basi × 650 dalton). Inoltre, i rapporti molari possono essere calcolati da: inserto di massa (g) = rapporto molare inserto/plasmide desiderato × massa del plasmide (g) × rapporto tra l'inserto e le lunghezze del plasmide⁶.
2. Combinare il volume calcolato di plasmide e inserire il DNA in una provetta da microcentrifuga preraffreddata da 1,5 ml e conservare in ghiaccio.
3. Trasferire il plasmide e inserire la miscela di DNA dal passaggio 3.2 in un'aliquota (25-100 μL) di E. coli chimicamente competente (ad es. E. coli DH5a;²²).
   NOTA: Il volume delle cellule competenti utilizzate dipende dal volume del plasmide e della miscela di DNA da inserire; Questa miscela non deve superare il 10% del volume delle cellule competenti.
4. Procedere con una trasformazione per shock termico²³.
   1. Incubare la miscela di E. coli chimicamente competente e DNA su ghiaccio per 30 minuti.
   2. Trasferire a bagnomaria a 42 °C per 1 minuto, quindi trasferire il tubo nel ghiaccio per 2 minuti.
   3. Trasferire asetticamente LB nella provetta per portare il volume a 1 mL.
   4. Trasferire il volume di 1 mL in una provetta di vetro e metterlo in un incubatore con agitazione impostato a 37 °C, 220 giri/min o alla temperatura consigliata per il recupero del ceppo batterico e/o del plasmide (intervallo tipico da 25 °C a 37 °C) e consentire la produzione del marcatore di selezione antibiotica codificato dal plasmide.
5. Dopo che le cellule si sono riprese per 30 minuti a 1 ora, depositare un'aliquota (100 μL di 1.000 μL) della reazione di trasformazione su un terreno di selezione solido e utilizzare uno spandiconcime di cellule sterile per disperdere l'aliquota sulla piastra di coltura dell'agar. Raccogliere il resto delle cellule trasformate mediante centrifugazione (13.000 × g per 1 minuto), scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 μL di terreno sterile e depositare su un terreno di selezione solido come sopra. Lasciare assorbire il liquido in un terreno solido per 30 minuti, quindi capovolgere le piastre di coltura. e metterli in un'incubatrice per una notte alla temperatura consigliata per il ceppo batterico e/o plasmide.

4. Screening per il corretto assemblaggio dei plasmidi

1. Dopo l'incubazione (passaggio 3.5), rimuovere le piastre di coltura dall'incubatrice ed enumerare le colonie contando direttamente se ci sono diverse colonie batteriche isolate su ciascuna piastra di coltura. Selezionare diverse colonie (1-10) per lo screening per determinare se contengono il plasmide assemblato desiderato.
   1. Trasferire terreni di coltura sterili integrati con antibiotici appropriati in provette di coltura sterili (vetro o plastica). Inoculare il terreno di coltura toccando 1 colonia con un ago o un'ansa di trasferimento sterile e trasferire le cellule nel terreno della provetta di coltura con l'ago di trasferimento. Collocare le provette di coltura in un incubatore vibrante e incubare per 16-18 ore alla temperatura consigliata per il ceppo batterico e/o plasmide (intervallo tipico da 25 °C a 37 °C).
2. Il giorno successivo, isolare il DNA plasmidico dalle colture batteriche mediante lisi alcalina⁶ o utilizzando un kit di isolamento plasmidico disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
3. Determina se i plasmidi sono assemblati correttamente.
   1. Quantificare la concentrazione di DNA dei plasmidi isolati mediante spettrofotometria o stima su gel.
   2. Utilizzare un'aliquota (50-150 ng) di DNA plasmidico per una reazione di digestione di restrizione diagnostica (10 μL di volume finale). Selezionare gli enzimi di restrizione in base a dove si prevede che scinderanno il DNA plasmidico assemblato.
      NOTA: Raccomandiamo due reazioni separate: (1) trattare il DNA plasmidico con un enzima di restrizione che dovrebbe scindere il plasmide in un singolo sito e (2) trattare il DNA plasmidico con due enzimi di restrizione che dovrebbero asportare tutto o parte del frammento di DNA inserito. Gli enzimi di restrizione sono disponibili in commercio e devono essere utilizzati seguendo le istruzioni del produttore.
   3. Una volta completata la reazione dell'enzima di restrizione, combinare con il colorante di caricamento (fino a 1x la concentrazione), caricare l'intera miscela su un gel di agarosio e separare i frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio²¹. Utilizzare un transilluminatore UV o LED per visualizzare i frammenti di DNA che sono migrati nel gel di agarosio. Confrontare i frammenti di DNA ristretti con la scala del peso molecolare per determinare se sono i pesi molecolari previsti (Figura 4). Prendere nota dei plasmidi con i modelli di restrizione enzimatica previsti (chiamati cloni positivi); Scartare le provette contenenti plasmidi che non hanno il pattern di restrizione previsto (chiamati cloni negativi).
4. Per garantire che i cloni positivi abbiano la sequenza nucleotidica prevista, inviare un'aliquota di cloni plasmidici positivi per il sequenziamento.
   NOTA: Si raccomanda il sequenziamento dell'intero plasmide (ad esempio, il sequenziamento dei nanopori).

In questo manoscritto, come esempio di utilizzo dell'IVA, abbiamo seguito il flusso di lavoro IVA fornito per riclonare il frame di lettura aperto mCherry nel sito di clonazione multipla del plasmide pSU19 per generare un plasmide identico a pSU19mCherry (Figura 3)¹⁷. I primer adatti per l'IVA sono stati progettati sulla base delle fasi del protocollo 1.1 e 1.2. Quindi, è stato utilizzato un kit di isolamento plasmidico per isolare p...

La fase più critica per il successo della clonazione dell'IVA è la progettazione del frammento di DNA e del primer. L'efficienza dell'IVA è notevolmente migliorata quando i frammenti omologhi sono progettati per essere lunghi almeno 15 bp con una temperatura di fusione di circa 47-52 °C. È stato pubblicato uno studio dettagliato che esplora l'ottimizzazione della progettazione di frammenti IVA¹⁶. Un altro passo importante per avere un'elevata efficienza di c...

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

HGB è finanziato da un programma di master del Consiglio di ricerca sulle scienze naturali e l'ingegneria del Canada (NSERC) e da un premio di dottorato del preside (Università del Saskatchewan). Questo lavoro è stato sostenuto da un NSERC Discovery Grant (RGPIN-2021-03066), fondi di avviamento (a JLT) dell'Università del Saskatchewan e dal Canada Foundation for Innovation John R. Evans Leaders Fund (numero di sovvenzione 42269 a JLT). Gli autori ringraziano Eric Toombs per aver fornito la fotografia della quantificazione del DNA mediante spettroscopia UV.