Extração e Limpeza de Tecidos Preparação de Amostras de Cérebro-Medula Espinhal de Camundongos

Este estudo apresenta um protocolo para extrair e preparar amostras limpas de todo o cérebro e medula espinhal com sinais fluorescentes preservados, aumentando a eficiência experimental e a integridade dos dados para avançar na pesquisa em neurociência.

A pesquisa em neurociência focada no sistema nervoso central requer uma compreensão completa de vários fatores, incluindo distribuição celular, conectividade neuronal e dinâmica molecular. As metodologias tradicionais para investigar todo o cérebro e medula espinhal geralmente envolvem o isolamento, seccionamento e digitalização de cortes de tecido, seguidos pelo processo trabalhoso de reconstrução de imagens tridimensionais. Essa abordagem convencional pode ser demorada e complicada. Os avanços na limpeza de tecidos e nas técnicas de imagem de órgãos inteiros revolucionaram a análise de todo o cérebro e da medula espinhal. Para maximizar o potencial desses métodos inovadores, é essencial extrair e limpar amostras de cérebro, mantendo sua conexão com a medula espinhal. Este protocolo fornece um guia detalhado e sistemático para a preparação de amostras do cérebro conectadas à medula espinhal, descrevendo os procedimentos de extração e limpeza. Ao simplificar esses processos, essa abordagem aumenta significativamente a eficiência experimental e a integridade dos dados, promovendo avanços na pesquisa em neurociência e permitindo investigações mais abrangentes sobre as complexidades do sistema nervoso central.

O mapeamento e a análise precisos da distribuição nervosa fornecem informações valiosas sobre a organização estrutural e funcional do sistema nervoso central, abrindo caminho para estratégias terapêuticas inovadoras e aprimorando nossa compreensão geral dos mecanismos neurais. Atualmente, faltam tutoriais em vídeo abrangentes para orientar os pesquisadores na preparação e extração de amostras cerebrais conectadas à medula espinhal e na obtenção de uma limpeza bem-sucedida do tecido.

Existem várias abordagens de limpeza de tecido disponíveis: métodos de limpeza hidrofóbicos, hidrofílicos, baseados em hidrogel e de expansão de tecido ^1,2,3. A técnica de limpeza tecidual é amplamente aplicada no estudo de órgãos como baço⁴, pulmões⁵, músculo gastrocnêmio⁶, cérebro⁷, medula espinhal⁸ e rins⁹. Nosso protocolo fornecerá instruções detalhadas sobre como preparar amostras de cérebro inteiro conectadas à medula espinhal que foram marcadas com marcador fluorescente usando camundongos da cepa STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. Ele oferecerá orientação passo a passo para extração de amostras e descreverá o protocolo de limpeza usando kits hidrofílicos de limpeza de tecidos. Este protocolo ajuda os pesquisadores a dominar todo o processo, desde a extração da amostra da medula espinhal até a preparação e posterior digitalização. Isso não apenas aumentará a eficiência experimental, mas também garantirá a integridade e a qualidade das amostras, fornecendo dados mais precisos e confiáveis para apoiar a pesquisa em neurociência.

Em comparação com os métodos convencionais de seccionamento, imagem e reconstrução tridimensional ^10,11, a abordagem apresentada aqui oferece várias vantagens importantes, como (1) integridade estrutural aprimorada: ao manter a estrutura de todo o órgão, esse método reduz o risco de perda de informações críticas que podem ocorrer com o seccionamento¹²; (2) aquisição abrangente de dados: o uso de um kit de limpeza de tecidos permite o mapeamento detalhado de células que são difíceis de obter com técnicas tradicionais; (3) eficiência e precisão: o protocolo agiliza todo o processo, desde a extração da amostra até a imagem, reduzindo o tempo necessário para os procedimentos de imuno-histoquímica ou coloração e minimizando os erros associados ao corte e montagem¹³.

O protocolo supera as limitações dos métodos tradicionais de seccionamento, que muitas vezes resultam em dados incompletos e fragmentados. Ao preservar a conexão cérebro-medula espinhal intacta e utilizar métodos modernos de limpeza de tecidos, este protocolo fornece uma visão mais holística do sistema nervoso central, o que é crucial para a compreensão de mecanismos e funções neurais complexas. O objetivo principal deste método é permitir imagens abrangentes do sistema nervoso central, preparando amostras de todo o cérebro conectadas à medula espinhal, que foram marcadas com marcadores neuronais fluorescentes. Este protocolo visa facilitar a visualização detalhada de estruturas neurais e distribuições celulares usando métodos anatômicos avançados e técnicas de limpeza de tecidos.

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) e o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiaotong de Xangai. Aqui, camundongos machos da linhagem MJrs/J de 7-8 semanas de idade (origem C57BL/6J x CBA) foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados em gaiolas padrão (22 °C ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, alimentação e água ad libitum).

1. Perfusão

1. Anestesiar profundamente camundongos adultos usando tribromoetanol a 1,25% (0,02 mL / kg, consulte a Tabela de Materiais) administrado por injeção intraperitoneal usando uma seringa de 1 mL. Verifique a profundidade da anestesia pela resposta ao pinçamento do dedo do pé.
2. Fixe os membros do mouse na placa de acrílico branco usando grampos de aço. Corte a pele entre os dois fêmures do camundongo e continue cortando para cima até atingir o diafragma. Abra os dois lados do tórax através do diafragma para expor o coração usando uma tesoura e uma pinça reta.
3. Insira uma agulha de perfusão de 0,7 mm no ventrículo esquerdo. Faça uma incisão de 1-2 mm no apêndice atrial direito.
4. Perfunda com 1x PBS contendo 10 U/mL de heparina sódica a uma taxa de 10 mL/min com uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) para limpar completamente o sangue. O fígado ficando completamente pálido indica uma depuração bem-sucedida.
5. Perfundir com 50 mL de PFA a 4% pré-resfriado com uma bomba peristáltica a uma taxa de 10 mL/min. Monitore sinais como curvatura da cauda do rato e espasmos musculares.
   NOTA: A perfusão malsucedida pode afetar os processos de limpeza subsequentes.

2. Extração de amostras

1. Disseque cuidadosamente todo o cérebro e a medula espinhal usando tesouras e fórceps para evitar danificar a amostra.
2. Separe a pele nas costas e na cabeça do mouse usando uma tesoura oftálmica. Corte a coluna no ponto em que a linha que conecta as bordas traseiras superiores de ambos os membros se cruza com a coluna vertebral.
3. Remova o músculo e o tecido adiposo do pescoço e das costas do mouse para expor a coluna e o crânio. Corte ao longo da lacuna da linha média entre os lados esquerdo e direito da coluna e da medula espinhal da extremidade inferior do canal vertebral usando uma tesoura de vênus.
4. Remova a parte superior e os lados bilaterais da coluna cortada para expor a medula espinhal. Repita os passos até chegar à conexão com o cérebro.
5. Coloque a ponta de uma lâmina da tesoura de vênus entre o forame magno e o cérebro. Deslize e corte ao longo da sutura sagital média para abrir o crânio. Use uma pinça para remover o crânio e expor o cérebro.
6. Remova o tecido da medula espinhal do cérebro do camundongo da extremidade craniana usando uma pinça e uma tesoura de vênus.
   NOTA: Cortes ou danos à superfície podem ser exacerbados durante a limpeza subsequente, potencialmente causando danos imprevisíveis à amostra. Manuseie as amostras com cuidado.
7. Use uma pinça de dissecação para remover a membrana da medula espinhal sob o estereomicroscópio.
8. Prenda a amostra da medula espinhal cerebral à placa de fixação (consulte a Tabela de Materiais) usando suturas. Adicione pelo menos 20 vezes o volume da amostra de 4% de PFA e coloque-o em um shaker a 4 °C para agitação lenta. Fixe durante a noite por 16-24 h.
   NOTA: A fixação excessiva leva à reticulação excessiva de proteínas, reduzindo a eficiência de limpeza¹⁴. A fixação insuficiente ou tardia pode causar degradação do antígeno e destruição da morfologia do tecido.
9. Descarte o PFA e lave a amostra 3x com 1x PBS. Certifique-se de que o volume de PBS seja pelo menos 10x o volume da amostra, submergindo totalmente a amostra. Cada lavagem dura 2 h com agitação em um agitador a uma velocidade não inferior a 60 rpm para remover completamente o PFA residual.

3. Limpeza de tecido

NOTA: Aqui, um kit de limpeza de tecido é usado (consulte a Tabela de Materiais).

1. Preparar a solução de remoção de lípidos misturando a solução A e a solução B a uma proporção mássica de 9:1.
   NOTA: Recomenda-se que o volume da solução de remoção de lipídios seja superior a 20x o volume da amostra.
2. Coloque o tecido fixo em um tubo de centrífuga de 50 mL e adicione 50 mL da solução de remoção de lipídios. Coloque o tubo da centrífuga em um agitador a 37 °C, agitando suavemente a 60 rpm para remoção de lipídios. Troque a solução de remoção de lipídios diariamente por 3-5 dias. Para determinar a conclusão, coloque o tubo da centrífuga em uma caixa de luz com uma linha de escala. Se a linha da escala preta estiver claramente visível e não distorcida através da amostra, o processo está concluído.
3. Colocar a amostra em 20 ml de solução C num agitador a 25 °C, agitando a menos de 60 rpm para correspondência do índice de refração. Mudar a solução C após 24 h. Colocar a placa de cultura com a amostra totalmente imersa na solução C numa caixa de luz com uma linha de escala. Se a linha de escala preta estiver claramente visível e sem distorções através da amostra, o processo de correspondência estará concluído.
   NOTA: Para tecidos de camundongos adultos, a correspondência do índice de refração normalmente é concluída em 2 dias.

4. Incorporação de tecidos

1. Prepare a solução de gel com 147 g de solução C em um frasco de vidro de 200 mL, adicione 3,0 g de agarose, misture bem por vórtice, leve ao microondas até ferver e desligue imediatamente o microondas. Transferir o tubo de centrifugação para uma incubadora a 37 °C até que a agarose se dissolva.
   NOTA: Recomenda-se preparar a solução de gel fresca conforme necessário.
2. Incorpore a amostra limpa com uma camada de 2 mm de profundidade de solução de gel a 37 °C no molde e deixe esfriar em uma geladeira a 4 °C por 30 min até semi-solidificar. Coloque a amostra correspondente ao índice de refração no molde e adicione a solução de gel para ficar nivelada ou ligeiramente abaixo do topo da amostra.
3. Coloque o molde de volta na geladeira a 4 °C por 2 h. Adicione a solução de gel até o nível da superfície do molde. Cubra com uma lamínula. Acelere a solidificação no refrigerador a 4 °C por 2 h. Conservar a amostra incorporada durante a noite no frigorífico a 4 °C. Prossiga com a imagem o mais rápido possível.

5. Digitalização

1. Remova a lamínula com uma pinça e retire a amostra incorporada. Coloque a amostra em um tubo de 50 mL e adicione 30 mL de solução de imagem para submergir totalmente a amostra.
2. Aplique o adesivo 502 para fixar firmemente a amostra no porta-amostras. Fixe o suporte no dispositivo de imagem.
3. Execute o software de digitalização conforme descrito. Selecione o nível de ampliação de 4x na seção de ampliação. Clique no botão Calibração para ativar o modo de calibração.
4. Clique no botão Visualizar para entrar no modo de visualização. Clique no botão de movimento na direção Z para mover lentamente a amostra para cima a partir da parte inferior da câmara de amostra até que a folha de luz gerada passe pela amostra.
5. Selecione o canal de laser apropriado e a opção de modo de iluminação. Selecione a direção do caminho de varredura para a amostra. Clique no botão Auto Scan para iniciar a captura da amostra.

Este protocolo isola com sucesso todo o cérebro conectado à medula espinhal em camundongos machos da linhagem STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. Ele também torna as amostras transparentes, garantindo que os sinais fluorescentes sejam totalmente preservados e capturados, fornecendo imagens claras e detalhadas que mantêm a integridade da fluorescência original.

A Figura 1

O protocolo experimental proposto envolve o uso de camundongos cujos cérebros estão conectados à medula espinhal marcada com vírus de rastreamento neural fluorescente. Este protocolo fornece instruções abrangentes e detalhadas sobre a preparação de amostras de cérebro inteiro que permanecem conectadas à medula espinhal. O protocolo descreve meticulosamente cada etapa, garantindo que os pesquisadores possam replicar o processo com precisão.

Várias e...

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão Nº 82101249 e Nº 82471204 a XY Sun). Fundação de Pesquisa de Pós-Doutorado da China (concessão nº 2022M722125 para XY Sun).