Extraction and Tissue Cleaning Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples(쥐의 뇌-척수 샘플의 추출 및 조직 세척 준비)

이 연구는 형광 신호가 보존된 상태에서 세척된 전뇌 및 척수 샘플을 추출 및 준비하여 실험 효율성과 데이터 무결성을 향상시켜 신경 과학 연구를 발전시키는 프로토콜을 제시합니다.

중추신경계에 초점을 맞춘 신경과학 연구는 세포 분포, 뉴런 연결성 및 분자 역학을 포함한 다양한 요인에 대한 철저한 이해를 필요로 합니다. 전체 뇌와 척수를 조사하기 위한 전통적인 방법론은 종종 조직 절편을 분리, 절편 및 스캔한 후 3차원 이미지 재구성의 노동 집약적인 프로세스를 포함합니다. 이러한 기존 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 번거로울 수 있습니다. 조직 투명화 및 전체 장기 이미징 기술의 발전은 전체 뇌와 척수 분석에 혁명을 일으켰습니다. 이러한 혁신적인 방법의 잠재력을 극대화하려면 척수와의 연결을 유지하면서 뇌 샘플을 추출하고 제거하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜은 척수에 연결된 뇌 샘플을 준비하기 위한 상세하고 체계적인 가이드를 제공하며, 추출 및 세척 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 프로세스를 간소화함으로써 이 접근 방식은 실험 효율성과 데이터 무결성을 크게 향상시켜 신경 과학 연구의 발전을 촉진하고 중추 신경계의 복잡성에 대한 보다 포괄적인 조사를 가능하게 합니다.

신경 분포에 대한 정확한 매핑과 분석은 중추 신경계의 구조적 및 기능적 조직에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 혁신적인 치료 전략을 위한 길을 닦고 신경 메커니즘에 대한 전반적인 이해를 향상시킵니다. 현재 연구자들이 척수에 연결된 뇌 샘플을 준비 및 추출하고 성공적인 조직 제거를 달성하는 데 도움이 되는 포괄적인 비디오 자습서는 부족합니다.

소수성(hydrophobic), 친수성(hydrophilic), 하이드로겔 기반(hydrogel-based), 조직 확장 투명화법(tissue-expansion clearing method) 등 여러 가지 조직 투명화 방법을 사용할 수 있습니다 ^1,2,3. 조직 정화 기술은 비장⁴, 폐^{5, 비}복근^{6, 뇌7, 척}수⁸, 신장⁹과 같은 장기 연구에 널리 적용되고 있다. 당사의 프로토콜은 STOCK Tg(Thy1-EGFP) MJrs/J 균주 마우스를 사용하여 형광 마커로 표지된 척수에 연결된 전체 뇌 샘플을 준비하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 샘플 추출을 위한 단계별 지침을 제공하고 조직 투명화 친수성 키트를 사용한 투명화 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 연구원들이 뇌-척수 샘플 추출부터 준비 및 후속 스캔에 이르는 전체 프로세스를 마스터하는 데 도움이 됩니다. 이를 통해 실험 효율성을 높일 뿐만 아니라 샘플의 무결성과 품질을 보장하여 신경 과학 연구를 지원하는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공할 수 있습니다.

종래의 절편법, 영상화 및 3차원 재구성 방법^10,11과 비교하여, 여기에 제시된 접근법은 다음과 같은 몇 가지 주요 이점을 제공한다: 전체 장기 구조를 유지함으로써, 이 방법은 절편법⁽¹²)에서 발생할 수 있는 중요한 정보를 잃을 위험을 줄인다; (2) 포괄적인 데이터 수집: 조직 투명화 키트를 사용하면 기존 기술로는 달성하기 어려운 세포를 자세히 매핑할 수 있습니다. (3) 효율성 및 정확성: 이 프로토콜은 시료 추출에서 이미징에 이르는 전체 프로세스를 간소화하여 면역조직화학 또는 염색 절차에 필요한 시간을 단축하고 절편 및 장착과 관련된 오류를 최소화합니다¹³.

이 프로토콜은 종종 불완전하고 단편화된 데이터를 초래하는 기존 절편 방법의 한계를 극복합니다. 이 프로토콜은 손상되지 않은 뇌-척수 연결을 보존하고 최신 조직 제거 방법을 활용함으로써 복잡한 신경 메커니즘과 기능을 이해하는 데 중요한 중추 신경계에 대한 보다 전체적인 관점을 제공합니다. 이 방법의 주요 목적은 형광 신경 마커로 표지된 척수에 연결된 전뇌 샘플을 준비하여 중추 신경계의 포괄적인 이미징을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 고급 해부학적 방법과 조직 제거 기술을 사용하여 신경 구조 및 세포 분포의 상세한 시각화를 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

모든 동물 실험은 ARRIVE(Animal Research Reporting In Vivo Experiments) 지침 및 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 미국 국립보건원(National Institutes of Health Guide)에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 상하이 자오퉁 의과대학 렌지병원 동물관리 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 여기에서는 7-8주 된 STOCK Tg(Thy1-EGFP) MJrs/J 균주 수컷 마우스(C57BL/6J x CBA 유래)를 본 연구에 사용했습니다. 동물은 상업적으로 얻어졌으며( 재료 표 참조) 표준 케이지(22°C ± 2°C, 12시간/12시간 명암 주기, 음식 및 물 자유분방)에 수용되었습니다.

1. 관류

1. 1mL 주사기를 사용하여 복강 내 주사로 투여된 1.25% 트리브로모에탄올(0.02mL/kg, 재료 표 참조)을 사용하여 성체 마우스를 심층 마취합니다. 발가락 꼬집음 반응으로 마취 깊이를 확인합니다.
2. 강철 클램프를 사용하여 마우스의 팔다리를 흰색 아크릴 보드에 고정합니다. 마우스의 두 대퇴골 사이의 피부를 자르고 횡격막에 도달할 때까지 위쪽으로 계속 자릅니다. 횡격막을 통해 흉부의 양쪽을 열어 가위와 곧은 집게를 사용하여 심장을 노출시킵니다.
3. 좌심실에 0.7mm 주입 바늘을 삽입합니다. 우심방 부속기를 1-2mm 절개합니다.
4. 10 U/mL 헤파린나트륨이 함유된 1x PBS를 연동 펌프( 재료 표 참조)와 함께 10mL/분의 속도로 관류하여 혈액을 완전히 제거합니다. 간이 완전히 창백하게 변하는 것은 성공적인 청소를 나타냅니다.
5. 연동 펌프를 사용하여 10mL/분의 속도로 50mL의 사전 냉각된 4% PFA를 관류합니다. 쥐 꼬리 말리기 및 근육 경련과 같은 징후를 모니터링합니다.
   참고: 관류에 실패하면 후속 청산 프로세스에 영향을 줄 수 있습니다.

2. 샘플 추출

1. 샘플이 손상되지 않도록 가위와 집게를 사용하여 전체 뇌와 척수를 조심스럽게 절개합니다.
2. 안과 가위를 사용하여 마우스의 등과 머리의 피부를 분리합니다. 양쪽 팔다리의 위쪽 뒤쪽 가장자리를 연결하는 선이 척추와 교차하는 지점에서 척추를 절단합니다.
3. 마우스의 목과 등에서 근육과 지방 조직을 제거하여 척추와 두개골을 노출시킵니다. 척추와 척수의 왼쪽과 오른쪽 사이의 정중선 틈을 따라 비너스 가위를 사용하여 척추관 하단에서 자릅니다.
4. 절단된 척추의 윗부분과 양측을 제거하여 척수를 노출시킵니다. 뇌 연결에 도달할 때까지 단계를 반복합니다.
5. 금성 가위의 한 날 끝을 대공(foramen magnum)과 뇌 사이에 놓습니다. 두개골을 열기 위해 중간 시상 봉합선을 따라 미끄러지고 자릅니다. 집게를 사용하여 두개골을 제거하고 뇌를 노출시킵니다.
6. 집게와 비너스 가위를 사용하여 두개골 끝에서 쥐의 뇌-척수 조직을 제거합니다.
   참고: 절단 또는 표면 손상은 후속 세척 중에 악화될 수 있으며, 잠재적으로 예측할 수 없는 샘플 손상을 유발할 수 있습니다. 샘플을 주의해서 다루십시오.
7. 절개 겸자를 사용하여 실체 현미경 아래의 척수 막을 제거합니다.
8. 봉합사를 사용하여 뇌-척수 샘플을 고정 플레이트( 재료 표 참조)에 고정합니다. 4% PFA의 시료 부피의 최소 20배를 추가하고 천천히 교반하기 위해 4°C의 셰이커에 놓습니다. 16-24시간 동안 밤새 고정하십시오.
   참고: 과도한 고정은 과도한 단백질 가교를 유발하여 정화 효율을 감소시킵니다¹⁴. 고정이 불충분하거나 지연되면 항원 분해 및 조직 형태 파괴가 발생할 수 있습니다.
9. PFA를 버리고 샘플을 1x PBS로 3x 세척합니다. PBS의 부피가 샘플 부피의 10배 이상인지 확인하고 샘플을 완전히 담그십시오. 각 세척은 잔류 PFA를 완전히 제거하기 위해 60rpm 이상의 속도로 셰이커에서 교반하면서 2시간 동안 지속됩니다.

3. 조직 청소(tissue clearing)

참고: 여기서는 조직 세척 키트가 사용됩니다( 재료 표 참조).

1. 용액 A와 용액 B를 9:1의 질량비로 혼합하여 지질 제거 용액을 준비합니다.
   참고: 지질 제거 용액의 부피는 샘플 부피의 20배 이상이어야 합니다.
2. 고정 조직을 50mL 원심분리 튜브에 넣고 지질 제거 용액 50mL를 추가합니다. 원심분리기 튜브를 37°C의 셰이커에 넣고 지질 제거를 위해 60rpm으로 부드럽게 흔듭니다. 지질 제거 용액을 3-5일 동안 매일 교체하십시오. 완성도를 확인하려면 원심분리기 튜브를 스케일 라인이 있는 라이트 박스에 놓습니다. 블랙 스케일 라인이 명확하게 보이고 샘플을 통해 왜곡되지 않으면 프로세스가 완료된 것입니다.
3. 시료를 25°C의 셰이커에 20mL의 용액 C에 넣고 굴절률 일치를 위해 60rpm 미만으로 흔듭니다. 24시간 후에 용액 C를 변경합니다. 용액 C에 시료를 완전히 담근 배양 접시를 눈금선이 있는 라이트 박스에 놓습니다. 검은색 눈금 선이 명확하게 보이고 샘플을 통해 왜곡되지 않으면 매칭 프로세스가 완료된 것입니다.
   참고: 성체 마우스 조직의 경우 굴절률 일치는 일반적으로 2일 이내에 완료됩니다.

4. 조직 임베딩

1. 200mL 유리 병에 147g의 용액 C가 함유 된 젤 용액을 준비하고 아가로 3.0g을 넣고 볼텍싱으로 잘 섞은 다음 끓을 때까지 전자 레인지를 넣고 즉시 전자 레인지를 끕니다. 아가로스가 용해될 때까지 원심분리기 튜브를 37°C의 인큐베이터로 옮깁니다.
   알림: 필요에 따라 겔 용액을 신선하게 준비하는 것이 좋습니다.
2. 세척된 샘플을 2mm 깊이의 37°C 겔 용액 층과 함께 금형에 삽입하고 4°C 냉장고에서 반응고될 때까지 30분 동안 냉각합니다. 굴절률이 일치하는 샘플을 금형에 넣고 젤 용액을 샘플 상단과 같거나 약간 아래에 추가합니다.
3. 금형을 4°C 냉장고에 2시간 동안 다시 넣습니다. 금형 표면과 수평이 될 때까지 겔 용액을 추가합니다. 커버 슬립으로 덮으십시오. 4°C 냉장고에서 2시간 동안 응고를 가속화합니다. 내장된 샘플을 4°C 냉장고에 하룻밤 동안 보관하십시오. 가능한 한 빨리 이미징을 진행하십시오.

5. 스캐닝

1. 핀셋으로 커버슬립을 제거하고 포함된 샘플을 꺼냅니다. 샘플을 50mL 튜브에 넣고 이미징 용액 30mL를 추가하여 샘플을 완전히 담급니다.
2. 502 접착제를 도포하여 샘플을 샘플 홀더에 단단히 고정합니다. 홀더를 이미징 장치에 고정합니다.
3. 설명된 대로 스캔 소프트웨어를 실행합니다. 확대 섹션에서 배율 수준 4x를 선택합니다. Calibration( 보정 ) 버튼을 클릭하여 보정 모드를 활성화합니다.
4. 미리보기 버튼을 클릭하여 미리보기 모드로 들어갑니다. Z-방향 이동 버튼을 클릭하여 생성된 광시트가 샘플을 통과할 때까지 샘플 챔버 바닥에서 위쪽으로 샘플을 천천히 이동합니다.
5. 적절한 레이저 채널 및 조명 모드 옵션을 선택합니다. 샘플의 스캔 경로 방향을 선택합니다. 자동 스캔 버튼을 클릭하여 샘플 캡처를 시작합니다.

이 프로토콜은 STOCK Tg(Thy1-EGFP) MJrs/J 균주 수컷 마우스에서 척수와 연결된 전체 뇌를 성공적으로 분리합니다. 또한 샘플을 투명하게 렌더링하여 형광 신호가 완전히 보존되고 캡처되도록 하여 원래 형광의 무결성을 유지하는 선명하고 상세한 이미지를 제공합니다.

그림 1은 손상?...

제안된 실험 프로토콜은 뇌가 형광 신경 추적 바이러스로 표지된 척수에 연결된 쥐를 사용하는 것입니다. 이 프로토콜은 척수에 연결되어 있는 전뇌 샘플을 준비하는 데 대한 포괄적이고 자세한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 각 단계를 꼼꼼하게 설명하여 연구원이 프로세스를 정밀하게 복제할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜의 몇 가지 중요한 ?...

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

중국 국립 자연 과학 재단 (XY Sun에 NO. 82101249 및 NO. 82471204 부여). 중국 박사후 연구원 연구 재단(XY Sun에 보조금 번호 2022M722125).