Crioseccionamento e imunocoloração do tecido do ouvido interno de camundongos: dos estágios embrionário ao adulto

Este protocolo, destinado a usuários iniciantes de tecido do ouvido interno de camundongos, detalha de forma abrangente as etapas para o processamento de ouvidos internos de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento para imunocoloração de seção.

Este protocolo detalha métodos histológicos gerais para preparar amostras de ouvido interno de camundongos embrionários, neonatais e adultos. O objetivo deste protocolo é fornecer um método direto e padronizado para o processamento do tecido do ouvido interno para pesquisadores, possivelmente novos no campo, interessados em trabalhar com a cóclea de camundongo. Estão incluídos aqui os protocolos para dissecção, fixação, incorporação, criossecção e imunocoloração. A imunocoloração de seção é um dos melhores métodos para examinar células individuais no contexto de toda a cóclea.

As principais etapas incluem dissecar o ouvido interno longe do crânio, fixar o tecido usando paraformaldeído a 4%, incorporar com composto de temperatura de corte ideal, crioseccionamento e imunocoloração com anticorpos direcionados a proteínas específicas expressas pela cóclea.

Estão incluídas em nossos métodos considerações especiais feitas para a cóclea, dada a sua
forma e estrutura. São necessárias habilidades de foco e dissecção razoavelmente boas, pois o dano tecidual pode afetar a qualidade da imunocoloração e a consistência entre as amostras. No entanto, com os procedimentos que descrevemos, a maioria dos usuários pode ser treinada em algumas semanas para fazer belos preparativos. No geral, este protocolo oferece uma maneira valiosa de promover pesquisas para entender o desenvolvimento, a função e a doença auditiva em modelos de camundongos.

Compreender o desenvolvimento e a função auditiva é crucial para caracterizar e abordar diferentes formas de perda auditiva. Os fatores de risco para perda auditiva são muitos e incluem diabetes ^1,2, hipertensão^{arterial 3,4,5}, doenças autoimunes ^6,7, meningite bacteriana ^8,9 e vários distúrbios neurodegenerativos 10,11,12,13. Além disso, certos medicamentos, como alguns antibióticos e medicamentos quimioterápicos, também podem afetar negativamente a audição¹⁴. Além dos desafios imediatos da deficiência auditiva, a perda auditiva pode impactar negativamente a função cognitiva e aumentar a ansiedade e o estresse, o que pode se correlacionar com o comprometimento cognitivo e o declínio da saúde mental 11,15,16. Ao publicar este protocolo, pretendemos aliviar quaisquer barreiras para entrar na pesquisa auditiva, principalmente para aqueles sem experiência anterior em trabalhar com a cóclea. Este guia explica como preparar amostras do ouvido interno de camundongos embrionários, juvenis (neonatais) e adultos. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta para o processamento do tecido da orelha interna, garantindo reprodutibilidade e consistência entre os experimentos. A imunomarcação de secção é um dos melhores métodos para examinar diferentes tipos de células no contexto de toda a cóclea; Em outras circunstâncias, a imunomarcação de montagem total pode ser mais vantajosa (por exemplo, examinar a morfologia dos estereocílios das células ciliadas ou a localização de proteínas).

A justificativa para isso decorre dos desafios de trabalhar com a cóclea do camundongo. Seu tamanho pequeno, bobina única e estrutura delicada¹⁷ requerem técnicas especializadas para dissecção, fixação, incorporação, crioseccionamento e imunocoloração precisas. A forma espiral da cóclea significa que a incorporação requer atenção cuidadosa à orientação para garantir que cada volta da cóclea seja preservada, o que é crucial para a obtenção de seções consistentes. Além disso, à medida que a cóclea amadurece, ela sofre ossificação¹⁸, o que significa que gradualmente se transforma em osso, o que pode complicar a preservação do tecido e necessitar de descalcificação. A imunomarcação por criossecção oferece várias vantagens sobre as preparações alternativas (como a imunocoloração de montagem inteira). Os principais benefícios do criosseccionamento são a preservação geral de proteínas e ácidos nucléicos, e as seções relativamente finas, ~ 2D, permitem medições consistentes e precisas. Além disso, permite que todos os tipos de células cocleares sejam preservados e visualizados e pode melhorar a qualidade da imunocoloração. Ao contrário de muitas preparações cocleares de montagem completa, a criossecção preserva estruturas, incluindo o ligamento espiral, a estria vascular, a membrana de Reissner e a membrana tectória. Veja as seguintes publicações anteriores para exemplos de imunocoloração de seção de alta qualidade de embrionários 19,20,21, neonatais 22,23,24 e adultos^25,26 orelhas internas.

NOTA: Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Georgetown. Todos os camundongos neste estudo foram mantidos de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Georgetown (protocolo # 1147). Na primeira semana pós-natal, como as estruturas do osso temporal não estão totalmente desenvolvidas, a descalcificação não é necessária. No entanto, cócleas de camundongos com idade P6 e mais requerem descalcificação e um método diferente de dissecção. Em nosso protocolo, foram utilizados camundongos NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss) machos e fêmeas, e em E16.5, P0 e P30. Para cada seção, anotamos entre parênteses quanto tempo cada etapa deve levar para iniciantes. Muitas das etapas se tornarão mais rápidas com a prática.

1. Coleta de amostras de ouvido interno embrionário e juvenil (~ 75 min)

1. Eutanasiar e decapitar camundongos de acordo com um protocolo de estudo animal aprovado.
2. Usando uma tesoura de dissecção fina, faça cuidadosamente uma incisão na linha média ao longo do couro cabeludo, começando do pescoço e estendendo-se em direção ao focinho, empurrando a pele para o lado (primeiro corte).
3. Coloque a lâmina inferior da tesoura no forame magno e a lâmina superior da tesoura no crânio. Corte a metade superior do crânio até o nariz (segundo corte).
4. Afaste a tesoura da cabeça parcialmente incisada e, em seguida, coloque a lâmina inferior da tesoura na parte inferior do crânio e a tesoura superior termina no forame magno. Corte a metade inferior da cabeça até o nariz (terceiro corte).
   NOTA: É importante que as lâminas da tesoura cortem a linha média e cortem facilmente com pouco esforço. Isso garantirá que as lâminas da tesoura cortem bem entre o ouvido interno esquerdo e direito.
5. Neste ponto, a cabeça do rato é dividida ao meio ao longo do eixo rostral-caudal. Usando pinças finas e tesouras, retire cuidadosamente qualquer tecido mole ao redor do osso temporal, como cérebro, músculos e tecido conjuntivo. Evite danificar o osso ou as estruturas circundantes.
6. Coloque as meias-cabeças do rato em poços de uma placa de 24 poços contendo temperatura ambiente 1x PBS. Uma vez que cada cabeça tenha sido processada, troque a solução 1x PBS por solução de PFA a 4% (para fixação) e incube por 45 min em temperatura ambiente (normalmente 20 °C).
   NOTA: O tempo de fixação pode variar dependendo das proteínas que precisam ser detectadas e/ou da eficácia de ligação de diferentes anticorpos.
7. Após 45 min, enxágue o tecido por 3 x 5-10 min com 1x PBS.
8. Armazene as amostras em 1x PBS a 4 °C ou vá para a próxima etapa e disseque-as. Para armazenamento de longo prazo, armazene em 1x PBS contendo 0,1% de azida de sódio a 4 °C.
9. Descarte qualquer tecido de camundongo restante de acordo com as diretrizes da instituição para descarte de risco biológico/tecido.

2. Dissecção da amostra da orelha interna embrionária e juvenil (3 - 5 min cada amostra)

1. Localize o osso temporal / cápsula do ouvido interno dentro da meia-cabeça do camundongo. Ele ocupa a mesma posição que o ouvido externo, mas está situado dentro do osso do crânio. Usando uma pinça fina, retire cuidadosamente qualquer tecido mole ao redor da cápsula do ouvido interno. Assim que a cápsula do ouvido interno estiver solta, comece a cortar o tecido ao redor da cápsula do ouvido interno.
2. Uma vez que a cápsula do ouvido interno tenha sido liberada do tecido do crânio, aplique pressão suavemente na área circundante da cápsula do ouvido interno usando uma pinça para liberá-la completamente.
   NOTA: Aplique pressão gradual para soltar a cápsula do ouvido interno de seus acessórios circundantes. Evite danificar a cápsula do ouvido interno. Como o ouvido interno de desenvolvimento inicial é bastante macio, evite fazer contato direto com o fórceps.
3. Armazene as amostras do ouvido interno como na etapa 1.8 e descarte quaisquer detritos restantes do tecido fixo da cabeça.

3. Coleta e dissecção de amostras do ouvido interno adulto (~ 75 min + 2 - 3 dias de tratamento com EDTA)

1. Eutanasiar e decapitar camundongos de acordo com um protocolo de estudo animal aprovado.
2. Usando uma tesoura de dissecção afiada, faça cuidadosamente uma incisão na linha média ao longo do couro cabeludo, começando pelo pescoço e estendendo-se em direção ao focinho. Dobre a pele para trás para expor o crânio (primeiro corte).
3. Coloque a lâmina inferior da tesoura no forame magno e a lâmina superior da tesoura no crânio. Corte a metade superior do crânio até o nariz (segundo corte).
   NOTA: Durante esta etapa, você notará um "esmagamento" moderado das lâminas da tesoura; Isso é normal.
4. Afaste a tesoura da cabeça parcialmente incisada e, em seguida, coloque a lâmina inferior da tesoura na parte inferior do crânio e a lâmina superior da tesoura no forame magno. Corte a metade inferior da cabeça até o nariz (terceiro corte), tomando cuidado para ir ao longo da linha média para garantir que as lâminas não atinjam as orelhas internas.
   NOTA: Não force a tesoura através do tecido; Isso pode indicar que as lâminas atingiram um dos ouvidos internos.
5. Para cada meia cabeça, usando uma pinça e uma tesoura, descole qualquer tecido mole ao redor do osso temporal, como cérebro, músculos e tecido conjuntivo.
   NOTA: Tome cuidado para evitar danificar o osso temporal ou as estruturas circundantes.
6. Com o tecido circundante limpo, "enrole reversamente" o tecido do crânio com os dedos e use o polegar para aplicar pressão suavemente na parte inferior do osso temporal. Aplique pressão gradual enquanto solta o osso de suas inserções circundantes.
   NOTA: À medida que a pressão é aplicada, a cápsula do ouvido interno se separa gradualmente dos ossos circundantes do crânio. Com uma manipulação suave, o osso deve sair com relativa facilidade.
7. Assim que a cápsula do ouvido interno for removida, enxágue-a com 1x PBS.
8. Encha um prato sylgard com 4% de PFA e coloque-o sob o microscópio. Coloque uma única orelha interna aberta no prato sylgard.
9. Examine o ouvido interno em busca de qualquer tecido mole ou osso anexado e remova suavemente qualquer um.
10. Encontre a janela oval e remova suavemente o estribo com uma pinça.
11. Encontre a janela redonda e faça um pequeno orifício para garantir que nenhum tecido ao redor a esteja entupindo.
12. Abra um pequeno orifício no ápice com uma pinça fina. Lave a cóclea com uma pipeta P20 cheia de PFA a 4% para fixar. Certifique-se de visualizar o fluido (sangue diluído, endolinfa / perilinfa) saindo da janela oval.
13. Coloque a cóclea fixa em uma placa de 24 poços preenchida com 4% de PFA. Marque a hora. Incube 30-60 min em temperatura ambiente com agitação suave (rocker ou nutator) e, em seguida, enxágue a amostra por 3 x 5-10 min com 1x solução PBS.
14. Após o enxágue final, coloque o tecido em EDTA 1,25 mM e deixe-o balançar por 2-3 dias a 4 °C.
15. Descarte o tecido de camundongo restante adequadamente de acordo com as diretrizes da instituição para descarte de risco biológico/tecido.
16. Após o tratamento com EDTA, enxágue o tecido por 3 x 5 min com 1x PBS.
17. Armazene as amostras em 1x PBS a 4 °C ou vá para a próxima etapa e disseque-as. Para armazenamento de longo prazo, armazene as amostras em 1x PBS contendo 0,1% de azida de sódio a 4 °C.

4. Preparação da amostra do ouvido interno para criosseccionamento (~ 24 h)

1. Coloque a cápsula dissecada do ouvido interno em sacarose a 10% (em 1x PBS) e deixe incubar em temperatura ambiente por no mínimo 2 h.
   NOTA: Quando as amostras estiverem totalmente equilibradas, elas afundarão no fundo do tubo.
2. Descarte a solução de sacarose a 10%, adicione 20% de sacarose em 1x PBS e deixe mais 2 h de incubação em temperatura ambiente.
3. Descarte a solução de sacarose a 20%, adicione 30% de sacarose em 1x PBS e incube a 4 ° C durante a noite (mínimo).
   NOTA: Esta etapa pode ser reduzida para 2 h, mas a incubação durante a noite produz os melhores resultados. O tecido pode ser deixado em qualquer porcentagem de sacarose por um longo período de tempo.
   1. Retire metade da solução de sacarose a 30% e preencha o espaço com o composto de temperatura ideal de corte (OCT). Deixe balançar por no mínimo 30 min e no máximo 2 h.
      NOTA: Deixar as amostras na OCT por um longo período fará com que o tecido encolha.
4. Transfira as amostras para criomoldes rotulados que são preenchidos com OCT.
5. Verifique a orientação coclear sob o microscópio no criobloco embutido. Para seções transversais cocleares "padrão", confirme se o lado côncavo do ouvido interno está voltado para os lados estreitos do criomolde.
6. Coloque gelo seco em um recipiente pequeno e adicione 5-10 mL de etanol ou dimetilbutano. Coloque os criomoldes + OCT + amostra em gelo seco borbulhante para congelar rapidamente o bloco.
7. Armazenar as amostras a -80 °C.

5. Seccionamento de ouvidos internos (~ 25 min por amostra)

1. Transferir os crioblocos para a câmara de um criostato pré-arrefecido a -20 °C. Deixe as amostras se equilibrarem por 30-60 min.
2. Usando um lápis, marque o lado do criobloco que corresponde à posição coclear para garantir a orientação adequada para o seccionamento.
3. Adicione uma pequena poça de OCT ao mandril e coloque o criobloco sobre ele, com o lado largo (sem a marca do lápis) para baixo.
4. Colocar a bucha + OCT + amostra na câmara de criostato refrigerada, permitindo que a OCT congele completamente. Após alguns minutos, coloque o mandril + sample no suporte do mandril com a marca de lápis apontando para a direita ou para a esquerda.
5. Apare o bloco até que o tecido fique aparente (use 40 μm como ajuste de corte).
6. Quando o tecido estiver aparente, colher uma secção de 12 μm com lâminas concebidas para crioseccionamento e verificar o local de seccionamento ao microscópio.
7. Se se aproximar de voltas cocleares, colha cortes de 12 μm, verificando a posição ocasionalmente, até que todas as voltas sejam passadas.
   NOTA: O número de seções por lâmina pode variar, mas normalmente obtemos de 8 a 10 seções por lâmina e cerca de 6 lâminas por cóclea.
8. Armazene as lâminas a -80 °C.

6. Imunocoloração de seção (~ 1 - 3 dias)

1. Retire as lâminas do congelador a -80 °C e deixe-as secar ao ar durante cerca de 10 min.
2. Usando um lápis, rotule as lâminas com os anticorpos que serão usados.
3. Trace as bordas usando um marcador hidrofóbico (por exemplo, caneta de barreira hidrofóbica peroxidase-antiperoxidase (PAP)).
4. Reidrate as amostras em 1x PBS por 5 min.
5. Descarte o 1x PBS das lâminas e adicione 1x PBS + 0.1% Triton X-100 (0.1% PBSTx) às lâminas por 20 min para permeabilizar.
6. Remova 0,1% de PBSTx da lâmina e adicione 200 μL da solução de bloqueio para uma incubação de 1-2 h à temperatura ambiente.
   NOTA: O bloqueio é uma etapa crucial em técnicas de imunocoloração como imuno-histoquímica e imunofluorescência, onde impede a ligação não específica de anticorpos a tecidos ou células. Para obter mais informações, consulte o guia de Lewis para selecionar reagentes de controle e bloqueio²⁷. Uma solução de bloqueio comumente usada é o soro de burro normal a 10% em PBSTx a 0,5%, mas isso só se aplica quando são usados anticorpos secundários derivados de burro.
7. Faça um enxágue rápido com 1x PBS, adicione 200 μL de solução de anticorpo primário composta em PBSTx a 0,5% e incube por 1 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários mostrados na Figura 1, use as seguintes diluições: 1:200 para Plexin-B1, 1:200 para Sox2, 1:1.000 cada para Tuj1, Myo6 e Myo7A (consulte também a Lista de Materiais).
   NOTA: Cada anticorpo primário se comporta de maneira diferente, dependendo de suas características de ligação ao epítopo e capacidade de penetrar nas amostras de tecido.
8. Após o tratamento com anticorpos primários, enxágue por 4 x 30 min em PBSTx, adicione 200 μL de solução de anticorpo secundário composta em PBSTx a 0,5% (Lista de Materiais) e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
   NOTA: Às vezes, pode ser útil girar soluções de anticorpos secundários em velocidade máxima a 4 ° C por 30 min para pulverizar qualquer precipitado indesejado. Se as soluções secundárias tiverem sido centrifugadas, evite tocar no fundo do tubo com a ponta da pipeta.
9. Enxágue por 4 x 30 min em PBSTx (ou enxágue durante a noite) e, em seguida, monte as lâminas usando um meio de montagem que ajude a evitar o fotobranqueamento (por exemplo, Fluoromount).
10. Adicione uma lamínula de tamanho apropriado com uma espessura apropriada para a configuração da imagem (por exemplo, lamínulas nº 1, que têm 0,13-0,16 mm de espessura).

Apresentamos exemplos de nosso próprio laboratório do ápice e giro basal de uma cóclea embrionária de camundongo dia 16.5 (E16.5) e o giro basal do dia 0 pós-natal (P0) e cóclea P30. Essas amostras foram seccionadas e imunomarcadas usando marcadores para células ciliadas (Myo7A e Myo6), neurônios ganglionares espirais (SGNs; Tuj1), glia e células de suporte (Sox2) e Plexin-B1, que rotula a membrana basal ao redor do ducto coclear e SGNs. As seções transversais da cóclea em d...

Existem várias etapas importantes para o sucesso da criossecção e imunocoloração. A fixação adequada do tecido coclear é essencial, e a duração da fixação também é importante, o que pode variar dependendo do anticorpo. Embora a maioria dos anticorpos funcione melhor com um tempo de fixação mais curto, como 45 min em PFA, alguns epítopos alvo podem tolerar a fixação durante a noite. Com base em nossa experiência, uma fixação de 45 minutos garante preservação adequa...

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

M.A.D. e T.M.C. foram apoiados por subsídios do NIH 5R01DC016595-07 (para T.M.C.) e 5R01DC018040-05 (Michael Deans, Univ. Utah, PI). Exemplos de micrografias na Figura 1A-H foram gerados pelo Dr. Kaidi Zhang.