Cryosectionnement et immunomarquage du tissu de l’oreille interne de souris : du stade embryonnaire au stade adulte

Ce protocole, destiné aux utilisateurs novices de tissu de l’oreille interne de souris, détaille de manière exhaustive les étapes de traitement des oreilles internes de souris à différents stades de développement pour l’immunomarquage en section.

Ce protocole détaille les méthodes d’histologie générale pour la préparation d’échantillons d’oreille interne de souris embryonnaires, néonatales et adultes. Le but de ce protocole est de fournir une méthode simple et standardisée pour le traitement des tissus de l’oreille interne pour les chercheurs, peut-être nouveaux dans le domaine, intéressés à travailler avec la cochlée de souris. Vous trouverez ici des protocoles de dissection, de fixation, d’intégration, de cryosection et d’immunomarquage. L’immunomarquage en coupe est l’une des meilleures méthodes pour examiner des cellules individuelles dans le contexte de l’ensemble de la cochlée.

Les étapes clés comprennent la dissection de l’oreille interne loin du crâne, la fixation du tissu à l’aide de paraformaldéhyde à 4 %, l’intégration avec un composé à température de coupe optimale, la cryosection et l’immunocoloration avec des anticorps ciblant des protéines spécifiques exprimées par la cochlée.

Nos méthodes comprennent des considérations spéciales prises pour la cochlée compte tenu de son
forme et structure. Des compétences raisonnablement bonnes en matière de concentration et de dissection sont nécessaires, car les lésions tissulaires peuvent affecter la qualité de l’immunocoloration et la cohérence entre les échantillons. Cependant, avec les procédures que nous décrivons, la plupart des utilisateurs peuvent être formés en quelques semaines pour faire de belles préparations. Dans l’ensemble, ce protocole offre un moyen précieux de promouvoir la recherche pour comprendre le développement, la fonction et la maladie auditifs dans des modèles murins.

Comprendre le développement et la fonction auditives est crucial pour caractériser et traiter les différentes formes de perte auditive. Les facteurs de risque de perte auditive sont nombreux et comprennent le diabète ^1,2, l’hypertension ^3,4,5, les maladies auto-immunes ^6,7, la méningite bactérienne ^8,9 et plusieurs troubles neurodégénératifs 10,11,12,13. De plus, certains médicaments, tels que certains antibiotiques et chimiothérapies, peuvent également avoir un impact négatif sur l’audition14. Au-delà des défis immédiats de la déficience auditive, la perte auditive peut avoir un impact négatif sur la fonction cognitive et augmenter l’anxiété et le stress, ce qui peut être corrélé avec les troubles cognitifs et le déclin de la santé mentale 11,15,16. En publiant ce protocole, nous visons à atténuer tous les obstacles à l’entrée dans la recherche auditive, en particulier pour ceux qui n’ont pas d’expérience préalable de travail avec la cochlée. Ce guide explique comment préparer des échantillons d’oreille interne de souris embryonnaires, juvéniles (néonatales) et adultes. L’objectif de ce protocole est de fournir une approche simple du traitement des tissus de l’oreille interne, garantissant la reproductibilité et la cohérence entre les expériences. L’immunomarquage en coupe est l’une des meilleures méthodes pour examiner différents types de cellules dans le contexte de l’ensemble de la cochlée ; Dans d’autres circonstances, l’immunocoloration à montage entier peut être plus avantageuse (p. ex., examen de la morphologie des stéréocils des cellules ciliées ou de la localisation des protéines).

La raison en est qu’il s’agit de difficultés à travailler avec la cochlée de la souris. Sa petite taille, sa bobine unique et sa structure délicate^nécessitent des techniques spécialisées pour une dissection, une fixation, un enrobage, une cryosection et une immunocoloration précis. La forme en spirale de la cochlée signifie que l’enrobage nécessite une attention particulière à l’orientation pour s’assurer que chaque tour de la cochlée est préservé, ce qui est crucial pour obtenir des sections cohérentes. De plus, à mesure que la cochlée mûrit, elle subit une ossification¹⁸, ce qui signifie qu’elle se transforme progressivement en os, ce qui peut compliquer la préservation des tissus et nécessiter une décalcification. L’immunocoloration par cryosection offre plusieurs avantages par rapport aux préparations alternatives (telles que l’immunocoloration à montage entier). Les principaux avantages de la cryosection sont la préservation générale des protéines et des acides nucléiques, et les sections ~2D relativement minces permettent des mesures cohérentes et précises. De plus, il permet de préserver et de visualiser tous les types de cellules cochléaires, et il peut améliorer la qualité de l’immunomarquage. Contrairement à de nombreuses préparations cochléaires entières, la cryosection préserve des structures telles que le ligament spiralé, la strie vasculaire, la membrane de Reissner et la membrane tectoriale. Voir les publications antérieures suivantes pour des exemples d’immunomarquage de haute qualité des oreilles internes embryonnaires^{19, 20, 21}, néonatales^{22, 23, 24} et adultes^{25, 26}.

REMARQUE : Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Georgetown. Toutes les souris de cette étude ont été maintenues conformément au comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Georgetown (protocole #1147). Au cours de la première semaine postnatale, parce que les structures osseuses temporales ne sont pas complètement développées, la décalcification n’est pas nécessaire. Cependant, les cochlées de souris âgées de P6 et plus nécessitent une décalcification et une méthode de dissection différente. Dans notre protocole, des souris mâles et femelles NCI Cr :NIH(S) (NIH Swiss) ont été utilisées, et à E16.5, P0 et P30. Pour chaque section, nous notons entre parenthèses combien de temps chaque étape est censée prendre pour les débutants. De nombreuses étapes deviendront plus rapides avec la pratique.

1. Prélèvement d’échantillons d’oreille interne embryonnaire et juvénile (~75 min)

1. Euthanasier et décapiter les souris conformément à un protocole d’étude sur les animaux approuvé.
2. À l’aide de ciseaux de dissection fine, faites soigneusement une incision médiane le long du cuir chevelu, en partant du cou et en s’étendant vers le museau, en poussant la peau sur le côté (première coupe).
3. Placez la lame de ciseaux inférieure sur le foramen magnum et la lame de ciseaux supérieure sur le crâne. Coupez la moitié supérieure du crâne jusqu’au nez (deuxième coupe).
4. Retirez les ciseaux de la tête partiellement incisée, puis placez la lame inférieure des ciseaux au bas du crâne et les ciseaux supérieurs se terminent au foramen magnum. Coupez la moitié inférieure de la tête jusqu’au nez (troisième coupe).
   REMARQUE : Il est important que les lames de ciseaux coupent à travers la ligne médiane et coupent facilement avec peu d’effort. Cela garantira que les lames des ciseaux coupent juste entre l’oreille interne gauche et l’oreille interne droite.
5. À ce stade, la tête de la souris est divisée en deux le long de l’axe rostral-caudal. À l’aide de pinces fines et de ciseaux, détachez soigneusement tous les tissus mous entourant l’os temporal, tels que le cerveau, les muscles et le tissu conjonctif. Évitez d’endommager l’os ou les structures environnantes.
6. Placez les demi-têtes de souris dans les puits d’une plaque à 24 puits contenant 1x PBS à température ambiante. Une fois que chaque tête a été traitée, remplacez la solution 1x PBS par une solution de PFA à 4 % (pour la fixation) et incubez pendant 45 min à température ambiante (généralement 20 °C).
   REMARQUE : Le temps de fixation peut varier en fonction des protéines à détecter et/ou de l’efficacité de liaison des différents anticorps.
7. Après 45 min, rincez le mouchoir pendant 3 x 5-10 min avec 1x PBS.
8. Stockez les échantillons dans 1x PBS à 4 °C ou passez à l’étape suivante et disséquez-les. Pour un stockage à long terme, stocker dans 1x PBS contenant 0,1 % d’azoture de sodium à 4 °C.
9. Éliminer tout tissu de souris restant conformément aux lignes directrices de l’établissement en matière de danger biologique et d’élimination des tissus.

2. Dissection d’un échantillon d’oreille interne embryonnaire et juvénile (3 à 5 minutes par échantillon)

1. Localisez l’os temporal/la capsule de l’oreille interne dans la demi-tête de la souris. Il occupe la même position que l’oreille externe mais est situé à l’intérieur de l’os du crâne. À l’aide d’une pince fine, détachez soigneusement tout tissu mou entourant la capsule de l’oreille interne. Une fois que la capsule de l’oreille interne est desserrée, commencez à couper le tissu autour de la capsule de l’oreille interne.
2. Une fois que la capsule de l’oreille interne a été en grande partie libérée du tissu crânien, appliquez doucement une pression sur la zone environnante de la capsule de l’oreille interne à l’aide d’une pince pour la libérer complètement.
   REMARQUE : Appliquez une pression progressive pour desserrer la capsule de l’oreille interne de ses attaches environnantes. Évitez d’endommager la capsule de l’oreille interne. Parce que l’oreille interne en développement précoce est assez molle, évitez d’entrer en contact direct avec vos pinces.
3. Conservez les échantillons de l’oreille interne comme à l’étape 1.8 et jetez tous les débris restants du tissu de la tête fixé.

3. Prélèvement et dissection d’échantillons d’oreille interne chez l’adulte (~75 min + 2 à 3 jours de traitement EDTA)

1. Euthanasier et décapiter les souris selon un protocole d’étude animale approuvé.
2. À l’aide de ciseaux de dissection tranchants, faites soigneusement une incision médiane le long du cuir chevelu, en commençant par le cou et en s’étendant vers le museau. Repliez la peau pour exposer le crâne (première coupe).
3. Placez la lame de ciseaux inférieure sur le foramen magnum et la lame de ciseaux supérieure sur le crâne. Coupez la moitié supérieure du crâne jusqu’au nez (deuxième coupe).
   REMARQUE : Au cours de cette étape, vous remarquerez un « craquement » modéré des lames de ciseaux ; C’est normal.
4. Retirez les ciseaux de la tête partiellement incisée, puis placez la lame inférieure des ciseaux au bas du crâne et la lame supérieure des ciseaux au foramen magnum. Coupez la moitié inférieure de la tête jusqu’au nez (troisième coupe), en prenant soin de longer la ligne médiane pour vous assurer que les lames manquent les oreilles intérieures.
   REMARQUE : Ne forcez pas les ciseaux à travers le tissu ; Cela pourrait indiquer que les lames ont heurté l’une des oreilles internes.
5. Pour chaque demi-tête, à l’aide de pinces et de ciseaux, détachez tous les tissus mous entourant l’os temporal, tels que le cerveau, les muscles et le tissu conjonctif.
   REMARQUE : Prenez soin d’éviter d’endommager l’os temporal ou les structures environnantes.
6. Une fois les tissus environnants dégagés, « courbez inversé » le tissu du crâne avec les doigts et utilisez un pouce pour appliquer doucement une pression sur la face inférieure de l’os temporal. Appliquez une pression progressive tout en détachant l’os de ses attaches environnantes.
   REMARQUE : Au fur et à mesure qu’une pression est appliquée, la capsule de l’oreille interne se sépare progressivement des os environnants du crâne. Avec une manipulation douce, l’os devrait sortir relativement facilement.
7. Une fois la capsule de l’oreille interne retirée, rincez-la avec 1x PBS.
8. Remplissez une coupelle sylgard avec 4 % de PFA et placez-la sous le microscope. Placez une seule oreille interne sortie dans le plat sylgard.
9. Examinez l’oreille interne à la recherche de tissus mous ou d’os attachés et retirez-les délicatement.
10. Trouvez la fenêtre ovale et retirez délicatement l’étrier à l’aide d’une pince.
11. Trouvez la fenêtre ronde et percez un petit trou pour vous assurer qu’aucun tissu environnant ne l’obstrue.
12. Ouvrez un petit trou dans l’apex avec une pince fine. Rincer la cochlée avec une pipette P20 remplie de 4 % de PFA pour fixer. Assurez-vous de visualiser le liquide (sang dilué, endontologie/périlymphe) sortant de la fenêtre ovale.
13. Placez la cochlée fixe dans une plaque à 24 puits remplie de 4 % de PFA. Marquez l’heure. Incuber 30 à 60 min à température ambiante avec une agitation douce (rocker ou nutator), puis rincer l’échantillon pendant 3 x 5 à 10 min avec 1x solution PBS.
14. Après le rinçage final, placez le mouchoir dans 1,25 mM d’EDTA et laissez-le basculer pendant 2-3 jours à 4 °C.
15. Éliminer les tissus de souris restants de manière appropriée conformément aux lignes directrices de l’établissement en matière de risques biologiques et d’élimination des tissus.
16. Après le traitement EDTA, rincez le tissu pendant 3 x 5 min avec 1x PBS.
17. Stockez les échantillons dans 1x PBS à 4 °C ou passez à l’étape suivante et disséquez-les. Pour un stockage à long terme, stocker les échantillons dans 1x PBS contenant 0,1 % d’azoture de sodium à 4 °C.

4. Préparation de l’échantillon de l’oreille interne pour la cryosection (~24 h)

1. Placez la capsule de l’oreille interne disséquée dans du saccharose à 10 % (dans 1x PBS) et laissez-la incuber à température ambiante pendant au moins 2 h.
   REMARQUE : Lorsque les échantillons se sont complètement équilibrés, ils couleront au fond du tube.
2. Jeter la solution de saccharose à 10 %, ajouter du saccharose à 20 % dans 1 PBS et laisser reposer 2 h supplémentaires d’incubation à température ambiante.
3. Jetez la solution de saccharose à 20 %, ajoutez 30 % de saccharose dans 1 PBS et incubez à 4 °C pendant la nuit (minimum).
   REMARQUE : Cette étape peut être réduite à 2 h, mais l’incubation pendant la nuit donne les meilleurs résultats. Le tissu peut être laissé dans n’importe quel pourcentage de saccharose pendant une période prolongée.
   1. Retirez la moitié de la solution de saccharose à 30 % et remplissez l’espace avec le composé à température de coupe optimale (OCT). Laissez-le se balancer pendant un minimum de 30 min et un maximum de 2 h.
      REMARQUE : Laisser les échantillons dans l’OCT pendant une période prolongée entraînera un rétrécissement des tissus.
4. Transférez les échantillons dans des cryomoules étiquetés qui sont remplis d’OCT.
5. Vérifiez l’orientation cochléaire au microscope dans le cryobloc intégré. Pour les sections cochléaires « standard », vérifiez que le côté concave de l’oreille interne fait face aux côtés étroits du cryomoule.
6. Placez de la glace sèche dans un petit récipient et ajoutez 5 à 10 ml d’éthanol ou de diméthylbutane. Placez les cryomoules + OCT + échantillon sur de la glace carbonique bouillonnante pour congeler rapidement le bloc.
7. Conservez les échantillons à -80 °C.

5. Section des oreilles internes (~25 min par échantillon)

1. Transférez les cryoblocs dans la chambre d’un cryostat prérefroidi à -20 °C. Laisser les échantillons s’y équilibrer pendant 30 à 60 min.
2. À l’aide d’un crayon, marquez le côté du cryobloc qui correspond à la position cochléaire pour assurer une bonne orientation pour la section.
3. Ajoutez une petite flaque d’OCT dans le mandrin et placez le cryobloc dessus, côté large (sans la marque de crayon) vers le bas.
4. Placez le mandrin + OCT + échantillon dans la chambre du cryostat réfrigérée, en laissant l’OCT geler complètement. Après quelques minutes, placez le mandrin + l’échantillon sur le support de mandrin avec la marque de crayon pointant vers la droite ou la gauche.
5. Coupez le bloc jusqu’à ce que le tissu soit apparent (utilisez 40 μm comme réglage de coupe).
6. Une fois que le tissu est apparent, prélevez une coupe de 12 μm avec des lames conçues pour la cryosection et vérifiez l’emplacement de la section au microscope.
7. Si vous approchez des virages cochléaires, prélevez des sections de 12 μm, en vérifiant la position de temps en temps, jusqu’à ce que tous les virages soient passés.
   REMARQUE : Le nombre de sections par diapositive peut varier, mais nous obtenons généralement 8 à 10 sections par diapositive et environ 6 lames par cochlée.
8. Stockez les lames à -80 °C.

6. Immunomarquage en section (~1 - 3 jours)

1. Sortez les lames du congélateur à -80 °C et laissez-les sécher à l’air libre pendant environ 10 min.
2. À l’aide d’un crayon, étiquetez les lames avec les anticorps qui seront utilisés.
3. Tracez les bords à l’aide d’un marqueur hydrophobe (p. ex., stylo barrière hydrophobe peroxydase-antiperoxydase (PAP)).
4. Réhydratez les échantillons dans 1x PBS pendant 5 min.
5. Jetez le 1x PBS des lames et ajoutez 1x PBS + 0,1 % Triton X-100 (0,1 % PBSTx) aux lames pendant 20 min pour perméabiliser.
6. Retirer 0,1 % de PBSTx de la lame et ajouter 200 μL de la solution bloquante pour une incubation de 1 à 2 h à température ambiante.
   REMARQUE : Le blocage est une étape cruciale dans les techniques d’immunomarquage telles que l’immunohistochimie et l’immunofluorescence, où il empêche la liaison non spécifique des anticorps aux tissus ou aux cellules. Pour plus d’informations, consultez le guide de Lewis sur la sélection des réactifs de contrôle et de blocage²⁷. Une solution bloquante couramment utilisée est le sérum d’âne normal à 10 % dans 0,5 % de PBSTx, mais cela ne s’applique que lorsque des anticorps secondaires dérivés de l’âne sont utilisés.
7. Faites un rinçage rapide avec 1 x PBS, ajoutez 200 μL de solution d’anticorps primaires composée de PBSTx à 0,5 % et incubez pendant 1 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C. Pour les anticorps primaires illustrés à la figure 1, utilisez les dilutions suivantes : 1:200 pour Plexin-B1, 1:200 pour Sox2, 1:1 000 pour Tuj1, Myo6 et Myo7A (voir aussi la liste des matériaux).
   REMARQUE : Chaque anticorps primaire se comporte différemment en fonction de ses caractéristiques de liaison à l’épitope et de sa capacité à pénétrer dans les échantillons de tissus.
8. Après le traitement avec des anticorps primaires, rincer pendant 4 x 30 min dans du PBSTx, ajouter 200 μL de solution d’anticorps secondaires composée de 0,5 % de PBSTx (liste des matériaux) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
   REMARQUE : Il peut parfois être utile de faire tourner les solutions d’anticorps secondaires à pleine vitesse à 4 °C pendant 30 minutes pour granuler tout précipité indésirable. Si les solutions secondaires ont été centrifugées, évitez de toucher le fond du tube avec la pointe de la pipette.
9. Rincez pendant 4 x 30 min dans du PBSTx (ou rincez toute la nuit), puis montez les lames à l’aide d’un support de montage qui aide à prévenir le photoblanchiment (par exemple, Fluoromount).
10. Ajoutez une lamelle de taille appropriée et d’une épaisseur adaptée à la configuration d’imagerie (par exemple, des lamelles n° 1, d’une épaisseur de 0,13 à 0,16 mm).

Nous présentons des exemples de notre propre laboratoire de l’apex et du tour basal d’une cochlée embryonnaire de souris au jour 16.5 (E16.5) et du tour basal des cochlées postnatales au jour 0 (P0) et au jour P30. Ces échantillons ont été sectionnés et immunomarqués à l’aide de marqueurs pour les cellules ciliées (Myo7A et Myo6), les neurones ganglionnaires spiralés (SGN ; Tuj1), les cellules gliales et de soutien (Sox2), et la plexine-B1, qui marque la membrane basale ...

Il existe plusieurs étapes clés pour une cryosection et une immunocoloration réussies. Une bonne fixation du tissu cochléaire est essentielle, et la durée de la fixation est également importante, qui peut varier en fonction de l’anticorps. Alors que la plupart des anticorps fonctionnent mieux avec un temps de fixation plus court, par exemple 45 minutes dans le PFA, certains épitopes cibles peuvent tolérer une fixation nocturne. D’après notre expérience, une fixation de 45 m...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

M.A.D. et T.M.C. ont été soutenus par les subventions NIH 5R01DC016595-07 (à T.M.C.) et 5R01DC018040-05 (Michael Deans, Univ. Utah, PI). Des exemples de micrographies de la figure 1A-H ont été générés par le Dr Kaidi Zhang.