Estabelecimento de Modelo de Rato de Lesão do Nervo Facial para Pesquisa de Paralisia Facial Idiopática

O presente protocolo estabelece um modelo de lesão do nervo facial em ratos usando microscopia para investigar os mecanismos diagnósticos e terapêuticos da paralisia facial idiopática.

A paralisia facial idiopática é o tipo mais comum de lesão do nervo facial, sendo responsável por aproximadamente 70% dos casos de paralisia facial periférica. Esta doença pode não apenas levar a uma mudança na expressão facial, mas também ter um grande impacto na psicologia dos pacientes. Em casos graves, pode afetar o trabalho normal e a vida dos pacientes. Portanto, a pesquisa sobre o reparo da lesão do nervo facial tem importante significado clínico. Para estudar o mecanismo desta doença, é necessário realizar experimentos em animais relevantes, entre os quais a tarefa mais importante é estabelecer um modelo animal com a mesma patogênese da doença humana. A compressão do nervo facial dentro do osso petroso, especialmente o tronco nervoso na junção da extremidade distal do conduto auditivo interno e do segmento labiríntico, é a patogênese da paralisia facial idiopática. Para simular essa doença comum, um modelo de lesão por compressão do segmento extracraniano principal do nervo facial foi estabelecido neste estudo. O dano neurológico foi avaliado por meio de exame comportamental, neuroeletrofisiológico e histológico. Finalmente, 50 g de força constante e lesão em pinça de 90 s foram selecionados como parâmetros de lesão para construir um modelo de paralisia facial idiopática estável.

Como um tipo de paralisia facial periférica, a paralisia facial idiopática é característica de etiologia desconhecida, início agudo e curso autolimitado ^1,2. A etiologia e a patogênese da paralisia facial idiopática ainda são incertas³. Atualmente, existem vários métodos de tratamento para a paralisia facial⁴, e a diversidade de tratamentos reflete a falta de opções de tratamento ideais. O uso de técnicas de biologia celular e molecular para estudar o mecanismo da lesão do nervo facial é a base para o estabelecimento de métodos eficazes de tratamento para a paralisia facial. Portanto, um modelo adequado e estável de lesão do nervo facial é particularmente importante.

Atualmente, não existe um método padrão para estabelecer um modelo de lesão do nervo facial. Os métodos de preparação atuais incluem inoculação de vírus⁵, transecção⁶, estimulação a frio⁷ e compressão⁸ métodos. Acredita-se que infecção viral, vasoespasmo neurotroflástico, inflamação autoimune, etc., podem causar isquemia local, degeneração e edema do nervo facial ^9,10,11. Além disso, todos os fatores acima podem causar compressão do tronco principal do nervo facial no estreito canal ósseo do nervo facial^12,13. Além disso, as lesões de nervos periféricos mais comuns identificadas durante os procedimentos cirúrgicos foram compressão e^contusão14. Com base nas teorias e fenômenos clínicos acima, acreditamos que a preparação do modelo de lesão do nervo facial por meio de lesão por compressão é mais razoável. No entanto, a maioria dos métodos atuais para implementação de lesões por compressão não fornece parâmetros quantitativos de força e tempo. Neste estudo, quantificamos a força e a duração da lesão por compressão para melhorar a reprodutibilidade do modelo estabelecido.

Todos os experimentos com animais foram aprovados e supervisionados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Xinhua Afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiaotong de Xangai (XHEC-F-2023-061). Ratos machos Sprague-Dawley, 200-300 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 10): grupo de cirurgia simulada, grupo de lesão de 30 segundos, grupo de lesão de 60 segundos e grupo de lesão de 90 segundos.

1. Indução da anestesia e preparação do animal

1. Use os seguintes equipamentos de proteção individual (EPI): máscara cirúrgica, luvas cirúrgicas, avental descartável.
2. Pese os ratos e anestesize-os com cloridrato de cetamina na dose de 50 mg / kg por injeção intraperitoneal (i.p.). Administrar meloxicam (5 mg/kg; i.p.) para analgesia perioperatória. Confirme a profundidade da anestesia usando uma pinça no dedo do pé.
3. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
4. Após a anestesia, coloque os ratos em decúbito ventral e fixe a cabeça de forma que o lado esquerdo da face fique para cima. Raspe o cabelo atrás da orelha esquerda e desinfete a pele. Cubra o rato com o campo cirúrgico estéril.

2. Estabelecimento de um modelo de lesão por esmagamento local do tronco extracraniano do nervo facial

NOTA: Esterilize todo o equipamento antes de usar. Todas as operações foram realizadas na sala de cirurgia.

1. Faça uma incisão longitudinal de 2 cm de comprimento atrás da orelha esquerda e disseque a pele e o tecido subcutâneo para separar o espaço natural entre os músculos faciais e cervicais.
2. Use micropinças e microtesouras para dissociar totalmente o tronco do nervo facial entre o forame estilomastóideo e a glândula parótida, com comprimento exposto de aproximadamente 1 cm.
3. Use uma pinça quantitativa de lesão do nervo periférico (Tabela de Materiais) para prender o tronco do nervo facial para causar lesão. Localize o local da lesão a 0,5 cm de distância do forame estilomastóideo. Aplique uma intensidade de lesão de 50 g e tempo de lesão de 30 s, 60 s e 90 s, respectivamente.
4. Suturar o subcutâneo e a pele com fio de seda. Desinfete a incisão.
5. Para ratos no grupo de controle de cirurgia simulada, corte a pele e o tecido subcutâneo após a anestesia e exponha e separe o tronco principal correspondente do nervo facial. Em seguida, suturou a incisão imediatamente.
6. Monitore a saúde do animal, mantenha a decúbito esternal e mantenha-o em condições quentes.
7. Mova o rato de volta para a gaiola de alojamento depois que o rato estiver consciente.

3. Teste comportamental

NOTA: A função do nervo facial dos ratos foi avaliada antes da cirurgia e 48 h após a cirurgia (Figura 1). Os escores de reflexo de piscar, movimento palpar e posição da ponta nasal foram calculados¹⁵. Quanto maior o escore total, mais grave é o grau de lesão do nervo facial (Tabela 1).

1. Reflexo de piscar (BR):
   1. Coloque uma agulha de 18 G a uma seringa de 2 ml e sopre ar para o olho do rato a uma distância de 2 cm. Observe o movimento e o fechamento das pálpebras.
   2. Pontuação de acordo com os seguintes critérios: Sem diferença significativa em ambos os lados: 0 pontos; Fechamento tardio do lado afetado em comparação com o lado saudável: 1 ponto; Incapacidade de fechar a pálpebra afetada: 2 pontos.
2. Movimento das vibrissas (VM):
   1. Conte os movimentos bilaterais dos tentáculos dos ratos em 30 s.
   2. Pontuação de acordo com os seguintes critérios: Sem diferença significativa no movimento bilateral dos tentáculos: 0 pontos; O movimento dos bigodes do lado afetado é mais fraco do que o do lado saudável: 1 ponto; Perda do movimento do bigode no lado afetado: 2 pontos.
3. Posição da ponta nasal.
   1. Ponta do nariz central: 0 pontos; Ponta do nariz inclinada para o lado saudável: 1 ponto.
      NOTA: Uma pontuação total de 0 pontos indica normal, 1-2 pontos indicam paralisia facial leve (paresia), 3-4 pontos indicam paralisia facial óbvia (paresia) e 5 pontos indicam paralisia facial completa¹⁵.

4. Detecção neuroeletrofisiológica

NOTA: A eletrografia facial (ENoG) foi realizada antes da lesão, imediatamente após a cirurgia e 48 h após a cirurgia (Figura 2, Tabela 2, Tabela 3 e Tabela 4).

1. Coloque o eletrodo de aterramento sob a pele do membro inferior esquerdo.
2. Insira o eletrodo de registro (eletrodo de agulha concêntrica bipolar) no lado lesionado do músculo tentáculo, com uma profundidade de penetração de 5 mm.
3. Coloque o eletrodo de estimulação (eletrodo de agulha concêntrica) na membrana do nervo facial. Estimule as extremidades proximal e distal do nervo facial lesionado separadamente.
4. Use uma corrente de pulso de onda quadrada com uma frequência de 1 Hz, uma largura de onda de 0.1 ms e uma faixa de filtragem de 10-3000 Hz.
5. Use estímulos de 2 mA, 5 mA, 10 mA, 15 mA e 20 mA para induzir a geração de potencial de ação muscular composto.
6. Registre a latência (Lm) e a amplitude de pico (Am) da onda M.
   NOTA: A onda M refere-se à primeira e mais óbvia forma de onda registrada. O ponto em que a forma de onda sai da linha de base é o ponto inicial da forma de onda. A distância do ponto inicial da linha de base ao ponto inicial da forma de onda é Lm. A distância entre os picos mais altos e mais baixos da forma de onda é Am.
7. Deixe um intervalo de 5 minutos entre cada estimulação para garantir a recuperação do nervo.

5. Exame histológico

1. Depois de concluir os testes eletrofisiológicos, use uma micropinça para levantar o nervo e uma microtesoura para cortar a amostra do nervo. O espécime inclui o tronco do nervo facial desde o ponto da lesão até a glândula parótida, que é a fibra nervosa na extremidade distal do ponto da lesão, com um comprimento total de cerca de 0,5 cm.
2. Fixe a amostra do nervo em paraformaldeído a 4% por 24 h e prepare cortes embebidos em parafina¹⁶.
3. Manchar os cortes com o método de coloração de hematoxilina-eosina (H&E)¹⁶ e adquirir imagens com aumento de 100x e 400x usando um microscópio óptico fotográfico (Figura 3).
   NOTA: Após a remoção da peça nervosa e sutura da pele sob anestesia, os ratos foram eutanasiados com pentobarbital sódico (150 mg/kg; i.p.).

Teste comportamental
Antes da cirurgia, os escores de reflexo de piscar, movimento palpar e posição da ponta nasal foram de 0 pontos em todos os ratos experimentais, indicando que todos os ratos tinham função do nervo facial intacta. Na avaliação da função do nervo facial 48 h após a cirurgia, verificou-se que os escores individuais dos ratos em cada grupo de lesão foram aumentados. Além disso, o escore total aumentou gradativamente com o prolongamento do t...

É necessário estudar o mecanismo de reparo da lesão do nervo facial em pacientes com paralisia facial idiopática¹⁷. O modelo de grau de lesão do nervo facial deve atender aos seguintes requisitos. Em primeiro lugar, o grau de lesão do nervo facial não deve ser muito leve, como Sunderland Grau 1^º grau¹⁸, que pode se auto-reparar completamente sem intervenção medicamentosa. Em segundo lugar, não deve ser muito grave, com...

Os autores declararam que não existem conflitos de interesse concorrentes.

Este trabalho foi apoiado por bolsas de projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82203637) e da Fundação de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia da Universidade Médica de Nanjing (NMUB20210220).