特発性顔面神経麻痺研究のための顔面神経損傷ラットモデルの樹立

現在のプロトコルは、特発性顔面神経麻痺の診断および治療メカニズムを調査するために、顕微鏡を使用して顔面神経損傷ラットモデルを確立します。

特発性顔面神経麻痺は、顔面神経損傷の最も一般的なタイプであり、末梢性顔面神経麻痺の症例の約70%を占めています。この病気は、表情の変化につながるだけでなく、患者の心理にも大きな影響を与えます。重症の場合、患者の通常の仕事や生活に影響を与える可能性があります。したがって、顔面神経損傷の修復に関する研究は、臨床的に重要な意義を持っています。この疾患のメカニズムを研究するためには、関連する動物実験を実施する必要がありますが、その中で最も重要な課題は、ヒトの疾患と同じ病因を持つ動物モデルを確立することです。錐体骨内の顔面神経、特に内耳道の遠位端と迷路セグメントの接合部にある神経幹の圧迫は、特発性顔面神経麻痺の病因です。この一般的な疾患をシミュレートするために、この研究では、顔面神経の主要な頭蓋外セグメントの圧迫損傷モデルが確立されました。神経学的損傷は、行動学的、神経電気生理学的、および組織学的検査によって評価されました。最後に、50 g の一定の力と 90 秒のクランプ損傷を損傷パラメーターとして選択し、安定した特発性顔面神経麻痺モデルを構築しました。

末梢性顔面神経麻痺の一種として、特発性顔面神経麻痺は病因不明、急性発症、および自己^{限定的な経過1,2}の特徴です。特発性顔面神経麻痺の病因と病因はまだ不明です³。現在、顔面神経麻痺⁴にはさまざまな治療法があり、治療の多様性は最適な治療選択肢の欠如を反映しています。細胞生物学および分子生物学の手法を使用して顔面神経損傷のメカニズムを研究することは、顔面神経麻痺の効果的な治療法を確立するための基盤です。したがって、適切で安定した顔面神経損傷モデルが特に重要です。

現在のところ、顔面神経損傷モデルを確立するための標準的な方法はありません。現在の調製方法には、ウイルス接種⁵、切断⁶、冷刺激⁷、および圧縮⁸の方法が含まれます。ウイルス感染、神経栄養性血管痙攣、自己免疫性炎症などは、いずれも顔面神経の局所虚血、変性、浮腫を引き起こす可能性があると考えられている^9,10,11。さらに、上記のすべての要因は、狭い骨の顔面神経管^12,13の顔面神経の主幹の圧迫を引き起こす可能性があります。さらに、外科的処置中に特定された最も一般的な末梢神経損傷は、圧迫と挫傷でした¹⁴。上記の理論と臨床現象に基づいて、圧迫損傷による顔面神経損傷モデルを準備する方が合理的であると考えています。しかし、圧迫傷害を実施するための現在の方法のほとんどは、力と時間の定量的パラメータを提供していません。この研究では、確立されたモデルの再現性を向上させるために、圧迫損傷の力と持続時間を定量化しました。

すべての動物実験は、上海交通大学医学部附属新華病院の動物倫理委員会(XHEC-F-2023-061)によって承認および監督されました。Sprague-Dawley雄ラット、200-300gを本研究に使用した。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。ラットを無作為に4つのグループ(n = 10)に分けました:偽手術グループ、30秒損傷グループ、60秒損傷グループ、および90秒損傷グループ。

1.麻酔の導入と動物の準備

1. 次の個人用保護具(PPE)を着用してください:サージカルマスク、サージカルグローブ、使い捨てガウン。
2. ラットの体重を量り、腹腔内(i.p.)注射により50 mg / kgの用量で塩酸ケタミンで麻酔します。.周術期鎮痛のためにメロキシカム(5 mg / kg; i.p.)を投与します。.つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
3. 乾燥を防ぐために両目に眼科用軟膏を塗布します。.
4. 麻酔後、ラットを腹臥位に置き、顔の左側が上にくるように頭を固定します。左耳の後ろの毛を剃り落とし、皮膚を消毒します。滅菌外科用ドレープでラットを覆います。

2. 顔面神経の頭蓋外幹の局所挫傷モデルの確立

注意: 使用前にすべての機器を滅菌してください。すべての手術は手術室で行われました。

1. 左耳の後ろに長さ2cmの縦切開を行い、皮膚と皮下組織を解剖して、顔と頸部の筋肉の間の自然な隙間を分離します。
2. マイクロピンセットとマイクロハサミを使用して、茎状乳房孔と耳下腺の間の顔面神経幹を完全に解離させます(露出した長さは約1cm)。
3. 末梢神経定量的損傷鉗子(材料の表)を使用して、顔面神経幹を固定して損傷を引き起こします。茎状突孔から0.5cm離れた損傷部位を特定します。傷害強度50g、傷害時間をそれぞれ30秒、60秒、90秒印らします。
4. 皮下と皮膚を絹糸で縫合します。切開部を消毒します。
5. 偽手術対照群のラットの場合、麻酔後に皮膚と皮下組織を切断し、顔面神経の対応する主幹を露出させて分離します。次に、切開部をすぐに縫合しました。
6. 動物の健康状態を監視し、胸骨の横臥を維持し、暖かい状態に保ちます。
7. ラットが意識を持ったら、ラットをハウジングケージに戻します。

3. 行動テスト

注:ラットの顔面神経機能は、手術前と手術の48時間後に評価されました(図1)。まばたき反射、手触りの動き、および鼻尖の位置のスコアが計算されました¹⁵。合計スコアが高いほど、顔面神経損傷の程度が深刻です(表1)。

1. まばたき反射(BR):
   1. 2mLの注射器に18Gの針を取り付け、2cmの距離からラットの目に空気を吹き込みます。まぶたの動きと閉鎖を観察します。
   2. 次の基準によるスコア:両側に有意差なし:0ポイント。健康な側と比較して影響を受けた側の閉鎖の遅延:1ポイント;影響を受けたまぶたを閉じることができない:2ポイント。
2. Vibrissaeムーブメント(VM):
   1. 30秒以内のラットの両側触手の動きを数えます。
   2. 次の基準によるスコア: 両側の触手の動きに有意差なし: 0 ポイント;患側のひげの動きは健康な側のひげの動きよりも弱いです:1ポイント;患側のひげの動きの喪失:2ポイント。
3. 鼻先の位置。
   1. センターノーズチップ:0ポイント;鼻先が健康側に傾いている:1ポイント。
      注:合計スコア0ポイントは正常、1〜2ポイントは軽度の顔面神経麻痺(麻痺)、3〜4ポイントは明らかな顔面麻痺(麻痺)、5ポイントは完全な顔面麻痺を示します¹⁵。

4. 神経電気生理学的検出

注:顔面電位法(ENoG)は、損傷前、手術直後、および手術の48時間後に実施されました(図2、 表2、表3、および 表4)。

1. 接地電極を左下肢の皮膚の下に置きます。
2. 記録電極(バイポーラ同心円針電極)を触手筋の損傷側に挿入し、貫通深さ5mmにします。
3. 刺激電極(同心円状針電極)を顔面神経膜に装着します。損傷した顔面神経の近位端と遠位端を別々に刺激します。
4. 周波数1Hz、波長0.1ms、フィルタリング範囲10〜3000Hzの矩形波パルス電流を使用します。
5. 2 mA、5 mA、10 mA、15 mA、および20 mAの刺激を使用して、複合筋活動電位の生成を誘導します。
6. M波の遅延(Lm)とピーク振幅(Am)を記録します。
   注意: M波は、記録された最初の最も明白な波形を指します。波形がベースラインから離れるポイントが、波形の開始点です。ベースラインの開始点から波形の開始点までの距離は Lm です。波形の最高ピークと最低ピークの間の距離はAmです。
7. 神経の回復を確実にするために、各刺激の間に5分の間隔を空けてください。

5. 組織学的検査

1. 電気生理学的テストが完了したら、マイクロピンセットを使用して神経を持ち上げ、マイクロハサミを使用して神経標本を切断します。標本には、損傷点から耳下腺までの顔面神経幹が含まれており、損傷点の遠位端にある神経線維である耳下腺まで、全長は約0.5cmです。
2. 神経標本を4%パラホルムアルデヒドに24時間固定し、パラフィン包埋切片¹⁶を調製します。
3. ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E)法¹⁶ で切片を染色し、光学顕微鏡を使用して100倍および400倍の倍率で画像を取得します(図3)。
   注:神経標本を切除し、麻酔下で皮膚を縫合した後、ラットをペントバルビタールナトリウム(150 mg / kg;i.p.)で安楽死させました。

行動テスト
手術前、まばたき反射、手のひらの動き、鼻尖の位置のスコアは、すべての実験ラットで0点であり、すべてのラットが顔面神経機能が損なわれていないことを示しました。手術48時間後の顔面神経機能評価では、各損傷群のラットの個体スコアが増加していることがわかりました。また、顔面神経損傷時間の延長に伴って、合計スコアは徐...

特発性顔面神経麻痺患者における顔面神経損傷の修復機構を研究する必要がある¹⁷。顔面神経損傷の程度モデルは、次の要件を満たす必要があります。まず、顔面神経損傷の程度は、薬物介入なしで完全に自己修復できるサンダーランドグレード^1st ディグ^リー18のように、軽度すぎてはいけません。第二に、外科的介入が?...

著者らは、競合する利益相反は存在しないと宣言しました。

この研究は、中国国家自然科学基金会(82203637)と南京医科大学科学技術発展基金会(NMUB20210220)からのプロジェクト助成金によって支援されました。