Morhardt Lab에서는 제브라피시를 동물 모델로 사용하여 방광 발달 및 기능을 연구합니다. 우리는 제브라피시에서 방광을 채우고 비우는 기능적인 방광을 확인했습니다. 제브라피쉬는 작지만 공간 전사체 기술과 척추동물 방광에 대한 이해를 경제적으로 활용하기 위해 그 크기를 활용하고자 했습니다.
공간 전사체 기법은 시약과 장비가 최적화되지 않으면 비용이 빠르게 증가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라피시를 사용하여 이를 달성할 수 있는 입증된 기술을 제공하며 기술의 결과로 발생할 수 있는 예상 결과 및 문제 완화에 대한 통찰력을 제공합니다. 값비싼 공간 전사체 기술의 경제적 활용 외에도 이 작업을 통해 배치 효과를 최소화하면서 여러 시대에 걸쳐 본질적으로 전체 장기에 대한 대규모 공간 전사체 분석을 수행할 수 있었습니다.
시작하려면 저온 유지 장치를 섭씨 22도로 식히고 필요한 모든 항목을 모으십시오. 샘플 정렬을 위해 일회용 플라스틱 주형을 준비합니다. 기본 몰드 내부에 랩 테이프 조각을 놓고 영구 마커를 기준점으로 사용하여 테이프를 가로질러 직선을 그립니다.
냉동 절편 중 적절한 샘플 방향을 보장하기 위해 기본 금형 내부를 표시합니다. 냉동 매체 병의 노즐을 프라이밍한 후 필요한 양을 베이스 몰드의 한쪽 모서리에 분배합니다. 기본 금형을 천천히 기울여 매체를 고르게 분배합니다.
이제 동결 매체가 있는 기본 금형을 얼음 수조에 넣고 매체를 냉각시키기 위해 최소 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 흄 후드 아래의 얼음 양동이에 드라이 아이스의 한 부분에 100% 에탄올의 한 부분을 추가합니다. 일회용 알루미늄 접시나 보트를 얼음 욕조에 넣고 양동이를 5-10분 동안 덮습니다.
안락사된 물고기를 섭씨 4도의 물에 10분 동안 담근 후 수집합니다. 끝이 가는 집게를 사용하여 꼬리 지느러미를 잡고 물고기를 제거하고 보푸라기가 없는 흡수성 물티슈로 부드럽게 눌러 말립니다. 준비된 기본 주형을 10배 배율로 실체 현미경 아래에 놓습니다.
기준점을 따라 올바른 방향으로 금형에 샘플을 배치합니다. 샘플을 다른 얇은 동결 매체 층으로 부드럽게 덮습니다. 해부학적 기준점을 사용하여 물고기를 기본 금형 내부의 표시된 선에 정확하게 정렬하고 기포를 피하면서 끝이 가는 집게를 사용하여 방향을 조정합니다.
샘플 아래의 기본 금형 바닥에 드라이아이스 조각을 국부적으로 동결될 때까지 제자리에 고정시킵니다. 완전히 얼기 전에 시료의 정렬 불량을 방지하기 위해 수평면을 수평으로 유지하십시오. 이제 샘플이 포함된 기본 금형을 알루미늄 보트에 놓거나 드라이 아이스와 에탄올 수조에 담긴 접시에 놓습니다.
보트가 표면에 떠 있고 기본 곰팡이가 건조한 상태로 유지되는지 확인하십시오. 목욕을 덮고 샘플을 10분 동안 얼립니다. 다음으로, 냉동 기본 금형을 호일로 싸서 절단할 준비가 될 때까지 섭씨 80도의 냉동고에 보관합니다.
동결 절편을 위해 동결된 저온 유지 장치에 동결된 베이스 몰드를 가져와 저온 유지 장치 챔버에 놓습니다. 보관에서 공간 이미징 슬라이드를 꺼낸 후 미리 칠해진 슬라이드 홀더에 넣습니다. 공간 이미징 슬라이드가 있는 슬라이드 홀더를 섹션 수거가 준비될 때까지 섭씨 22도의 저온 유지 챔버에 보관하십시오.
이제 베이스 몰드에서 얼어붙은 샘플을 제거하고 새로운 냉동 매체가 있는 척에 넣고 절단 표면이 마이크로톰 블레이드를 향하도록 합니다. 그런 다음 저온 유지 장치에 새로운 미세한 마이크로톰 블레이드를 놓습니다. 금형을 블레이드에 정렬한 후 권장 두께인 20-50마이크로미터로 관심 영역을 자릅니다.
적절한 샘플 방향을 위해 금형 내부의 표시가 동결된 블록으로 전송되었는지 확인하십시오. 트리밍하는 동안 절단면이 동결 매체의 참조 표시와 평행하게 유지되도록 금형을 조정합니다. 얼어붙은 블록에서 절편을 잘라 표준 양전하를 띤 현미경 슬라이드에 모읍니다.
명시야 현미경으로 섹션을 확인하여 트리밍이 완료되었는지 확인합니다. 그런 다음 저온 유지 장치 챔버에서 공간 이미징 슬라이드를 제거하고 슬라이드 홀더 내부에 보관하면서 섭씨 4도의 얼음 수조에 넣습니다. 권장 두께인 10 - 14 마이크로미터에서 동결 절편을 시작합니다.
관심 영역에 도달할 때까지 양전하를 띤 슬라이드에 절편을 수집합니다. 이제 얼음 수조에서 단일 세포 공간 이미징 슬라이드를 검색하고 홀더에서 슬라이드를 제거합니다. 롤링을 방지하기 위해 끝이 가는 붓을 사용하여 섹션을 한 줄씩 수집합니다.
그런 다음 페인트 브러시 뒷면을 사용하여 빈 냉동 매체의 모서리를 나이프 스테이지에 누릅니다. 슬라이드 상단을 피벗 포인트로 사용하고 슬라이드를 섹션 위로 천천히 내려 들어 올리기 전에 3초 동안 접착되도록 합니다. 연속된 섹션을 서로 평행하게 정렬하여 슬라이드의 공간을 최대화합니다.
관심 영역에서 섹션을 수집한 후 슬라이드를 슬라이드 홀더에 다시 놓습니다. 더 이상 샘플이 필요하지 않은 경우 분석 전에 최대 2주 동안 슬라이드를 섭씨 80도에서 보관하십시오. 관심 영역 전후의 절편을 표준 양전하 현미경 슬라이드에 수집하고 분석을 진행하기 전에 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하여 샘플 정렬 및 절편 품질을 평가합니다.
다중 단면 정렬은 동일한 절단부의 단면 간 구조를 비교하여 검증되었습니다. 임베딩(bedding) 및 채취 단계(collection steps)에 대한 조정을 통해 더 많은 수의 절편이 공간 전사체 슬라이드의 이미징 영역에 들어갈 수 있게 되었습니다. 공간 전사체 신호 품질은 조직 영역 내에서 높았지만 신호 복잡성이 낮기 때문에 빈 슬라이드 영역에서는 더 낮았습니다.
