No Morhardt Lab, usamos o peixe-zebra como modelo animal para estudar o desenvolvimento e a função da bexiga. Identificamos uma bexiga urinária funcional que se enche e esvazia no peixe-zebra. Embora o peixe-zebra seja pequeno, procuramos aproveitar seu tamanho para utilizar economicamente técnicas transcriptômicas espaciais e nossa compreensão da bexiga dos vertebrados.
As técnicas transcriptômicas espaciais podem rapidamente se tornar caras se os reagentes e equipamentos não forem otimizados. Este protocolo fornece uma técnica comprovada para conseguir isso usando peixe-zebra e fornece informações sobre os resultados esperados e a mitigação de problemas que podem surgir como resultado da tecnologia. Além da utilização econômica de tecnologias transcriptômicas espaciais caras, este trabalho nos permitiu realizar análises transcriptômicas espaciais em larga escala de órgãos essencialmente inteiros em várias idades, minimizando os efeitos de lote.
Para começar, resfrie o criostato a 22 graus Celsius e reúna todos os itens necessários. Prepare um molde de plástico descartável para o alinhamento da amostra. Coloque um pedaço de fita adesiva no interior do molde de base e desenhe uma linha reta com um marcador permanente como ponto de referência.
Marque o interior do molde de base para garantir a orientação adequada da amostra durante a criosecção. Depois de preparar o bico do frasco de meio congelante, dispense a quantidade necessária em um canto do molde de base. Incline lentamente o molde de base para distribuir uniformemente o meio.
Agora, coloque o molde de base com meio de congelamento em um banho de gelo e incube-o por pelo menos 10 minutos para resfriar o meio. Em seguida, adicione uma parte de etanol 100% a uma parte de gelo seco em um balde de gelo sob a coifa. Coloque o prato ou barco de alumínio descartável no banho de gelo e tampe o balde por cinco a 10 minutos.
Colete os peixes sacrificados depois de submergi-los em água a quatro graus Celsius por 10 minutos. Usando uma pinça de ponta fina, segure a barbatana caudal para remover o peixe e pressione-a suavemente contra um lenço absorvente sem fiapos para secá-lo. Coloque o molde de base preparado sob um microscópio estéreo com ampliação de 10x.
Posicione a amostra no molde ao longo do ponto de referência na orientação correta. Cubra suavemente a amostra com outra camada fina de meio de congelamento. Use um ponto de referência anatômico para alinhar o peixe com precisão às linhas marcadas dentro do molde de base e ajuste a orientação usando pinças de ponta fina, evitando bolhas.
Aplique um pedaço de gelo seco no fundo do molde de base sob a amostra até que esteja congelado localmente na posição. Mantenha um plano horizontal nivelado para evitar o desalinhamento da amostra antes de congelar completamente. Agora coloque o molde de base com a amostra no barco ou prato de alumínio no banho de gelo seco e etanol.
Certifique-se de que o barco permaneça flutuando na superfície e que o molde de base permaneça seco. Cubra o banho e deixe as amostras congelarem por 10 minutos. Em seguida, embrulhe o molde de base congelado em papel alumínio e guarde-o em um freezer a 80 graus Celsius até que esteja pronto para o corte.
Traga o molde de base congelado para o criostato pré-resfriado para criosseccionamento e coloque-o na câmara do criostato. Depois de remover a lâmina de imagem espacial do armazenamento, coloque-a em um suporte de lâmina pré-resfriado. Guarde o suporte da lâmina com a lâmina de imagem espacial na câmara de criostato de 22 graus Celsius até que esteja pronto para a coleta da seção.
Agora, remova a amostra congelada do molde de base e coloque-a em um mandril com meio de congelamento fresco, garantindo que a superfície de corte fique voltada para a lâmina do micrótomo. Em seguida, coloque uma lâmina de micrótomo fina fresca no criostato. Depois de alinhar o molde à lâmina, apare a região de interesse com uma espessura recomendada de 20 a 50 micrômetros.
Certifique-se de que as marcações dentro do molde sejam transferidas para o bloco congelado para uma orientação adequada da amostra. Ajuste o molde durante o corte para que a superfície de corte permaneça paralela às marcações de referência no meio de congelamento. Corte seções do bloco congelado e colete-as em uma lâmina de microscópio carregada positivamente padrão.
Verifique as seções sob um microscópio de campo claro para confirmar se o corte está concluído. Em seguida, remova a lâmina de imagem espacial da câmara do criostato e coloque-a em um banho de gelo de quatro graus Celsius, mantendo-a dentro do suporte da lâmina. Comece a criosseccionar com uma espessura recomendada de 10 a 14 micrômetros.
Colete seções em lâminas carregadas positivamente até que a região de interesse seja alcançada. Agora recupere a lâmina de imagem espacial de célula única do banho de gelo e remova a lâmina do suporte. Colete seções linha por linha usando um pincel de ponta fina para evitar rolar.
Em seguida, pressione um canto do meio de congelamento vazio no estágio da faca usando a parte de trás de um pincel. Use a parte superior do slide como ponto de pivô e abaixe lentamente o slide na seção para deixá-lo aderir por três segundos antes de levantar. Alinhe as seções seriais paralelas entre si para maximizar o espaço no slide.
Depois de coletar as seções da região de interesse, coloque a lâmina de volta no suporte da lâmina. Se não forem necessárias mais amostras, armazene a lâmina a 80 graus Celsius por até duas semanas antes da análise. Colete seções antes e depois da região de interesse em uma lâmina de microscópio padrão carregada positivamente e execute a coloração de hematoxilina e eosina para avaliar o alinhamento da amostra e a qualidade da seção antes de prosseguir com a análise.
O alinhamento de várias seções foi verificado comparando estruturas entre seções no mesmo corte. Ajustes nas etapas de incorporação e coleta permitiram que um número maior de seções se encaixasse na área de imagem de uma lâmina transcriptômica espacial. A qualidade do sinal transcriptômico espacial foi alta nas regiões do tecido, mas menor nas áreas de lâminas vazias devido à baixa complexidade do sinal.
