이 프로토콜은 관심 유전자를 가진 인간 일차 T 세포를 형질도입하는 단순화되고 GNP를 준수하는 과정을 설명합니다. 이 특정 기술은 현재 많은 학술 센터에서 사용할 수 있는 고가의 폐쇄형 시스템 제조 플랫폼을 사용하지 않고도 비용 효율적이고 GNP를 준수하도록 설계되었습니다. 이 방법은 혈액 악성 종양을 다루기 위한 패러다임 전환인 CAR T 세포를 포함하되 이에 국한되지 않는 유전자 변형 세포 치료제의 생성에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.
기증자 혈액의 백혈구 분리술 후 수집된 세포에서 PBMC를 분리하려면 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 30분 동안 혼합물을 800G로 원심분리하여 시약 대 샘플 비율을 1:2로 유지하면서 샘플의 다당류 기반 밀도 구배 원심분리를 수행합니다. 그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 PBMC를 깨끗한 50밀리리터 튜브에 모읍니다. 원심분리를 통해 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
세척된 세포를 완전한 조혈 배지에 재현탁시키기 전에. 200만 개의 세포마다 10마이크로리터의 T 세포 자극 시약을 첨가하여 얻어진 세포 중 약 2,000만 개를 활성화시킨다. 다음으로, 재조합 인간 인터루킨-2를 밀리리터당 20단위씩 첨가한 후, 용액을 부드럽게 혼합하여 6웰 플레이트에 옮깁니다.
바이러스 형질도입을 수행하기 전에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 3일째 되는 날, 세포 배양액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 옮기고 완전히 혼합합니다. 튜브를 실온에서 300G에서 10분 동안 원심분리하여 활성화 시약을 제거합니다.
상층액을 완전히 버리고 세포를 계산하기 전에 펠릿을 1밀리리터의 완전한 배지에 다시 현탁시킵니다. 완전한 배지를 사용하여 셀 현탁액을 조정하여 24웰 플레이트에서 웰당 50만 개의 셀을 도금할 수 있는 농도를 달성합니다. 재조합 인간 인터루킨-7 및 재조합 인간 인터루킨-15를 적절한 농도로 세포에 첨가합니다.
별도의 튜브에서 사용할 최종 바이러스 부피를 고려하여 원하는 양의 벡토푸신-1을 Opti-MEM 배지에 추가합니다. 이 혼합물을 농축된 바이러스와 일대일 비율로 결합하여 완전히 혼합되도록 합니다. 다음으로, 바이러스를 포함하는 결과 혼합물을 세포에 첨가하십시오.
필요한 경우 완전한 매체를 사용하여 각 웰의 총 부피를 400마이크로리터로 조정합니다. 접시를 뚜껑으로 덮은 후 파라핀 필름으로 밀봉한 후 섭씨 32도에서 1000G에서 2시간 동안 원심분리합니다. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 밤새 배양합니다.
다음 날, 각 웰에서 세포를 모아 50밀리리터 튜브로 당깁니다. 그런 다음 400G에서 실온에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후 세포를 계수하기 전에 펠릿을 1밀리리터의 완전한 배지에 완전히 재현탁시킵니다.
그런 다음 배지로 세포 농도를 조정하여 밀리리터당 100만 세포를 달성하고 세포를 배양하기 전에 인간 재조합 인터루킨-7 및 인간 재조합 인터루킨-15를 각각 밀리리터당 155 및 290 단위에서 추가합니다. 원하는 세포 수에 도달하면 세포를 수확하여 50밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 10밀리리터의 매체에 재현탁시켜 세포를 계산합니다.
다시 원심분리한 후 상층액을 완전히 버리고 펠릿을 50% HSA 및 40% HBSS로 구성된 동결 보존 용액에 극저온 바이알당 밀리리터당 1,000만 개의 세포 농도로 재현탁시킵니다. 필요한 수의 cryo 바이알에 각각 0.9mL의 셀 현탁액을 옮기고 각 cryo 바이알에 10%dimethyl sulfoxide를 추가합니다. 극저온 바이알을 얼음 위에 놓고 극저온 보존을 위해 제어된 속도의 냉동고로 빠르게 옮깁니다.
그런 다음 냉동 보존된 샘플을 모니터링되는 액체 질소 탱크로 옮겨 장기 보관합니다. 형질 도입 효율을 평가하려면 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 튜브의 샘플에 500마이크로리터의 FACS 완충액을 추가합니다. 샘플을 400G에서 실온에서 5분 동안 원심분리한 후 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 버립니다.
FACS 완충액에 CD3의 1 내지 5 희석된 용액에 펠릿을 재현탁시킨다. 샘플을 소용돌이치게 하고 이전에 시연된 대로 원심분리하기 전에 어두운 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 상층액을 완전히 폐기한 후, FACS 완충액에 7-AAD의 1 내지 20 희석된 용액에 펠릿을 재현탁시킨다.
이 혼합물을 소용돌이친 후 어두운 환경에서 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로 200 마이크로 리터의 FACS 완충액을 첨가하고 유세포 분석기를 사용하여 샘플 분석을 진행합니다. 형질도입된 세포의 생존능 분석 결과, 14일째에 7-AAD 양성 세포를 제외한 후 세포의 95% 이상이 CD3 양성으로 살아 있는 것으로 나타났으며, 이는 성공적인 T 세포 활성화 및 증식을 나타냅니다.
CD3 양성 집단 내에서의 형질도입 효율은 58.7%로 측정되었는데, 이는 0.51%의 형질도입 효율을 나타낸 비형질도입된 세포에 비해 4일째부터 14일째까지 2일마다 하위배양(sub-culturing)하면서 확장되었을 때, 세포는 25배 팽창을 겪었다. 제품은 다양한 품질 관리 테스트를 거쳤으며 설정된 모든 기준을 충족하여 추가 사용에 대한 적합성을 나타냅니다. 전체 절차는 엄격한 무균 기술로 수행되어야 합니다.
그리고 가장 까다로운 단계는 특정 총 부피를 유지하기 위해 추가할 모든 시약을 고려해야 하는 형질 주입 과정입니다.
