Este protocolo describe un proceso simplificado y compatible con GNP de transducción de células T primarias humanas con genes de interés. Esta técnica en particular ha sido diseñada para ser rentable y cumplir con GNP sin el uso de costosas plataformas de fabricación de sistemas cerrados actualmente disponibles en muchos centros académicos. Este método podría aplicarse potencialmente a la generación de terapias celulares modificadas genéticamente, incluidas, entre otras, las células T con CAR, que han supuesto un cambio de paradigma para abordar las neoplasias malignas hematológicas.
Para aislar PBMC de las células recogidas tras la leucoféresis de la sangre del donante, se realiza una centrifugación en gradiente de densidad de la muestra basada en polisacáridos, manteniendo una relación reactivo/muestra de 1:2, centrifugando la mezcla a 800 G durante 30 minutos a temperatura ambiente con los frenos apagados. Luego, con una micropipeta, recoja los PBMC en un tubo limpio de 50 mililitros. Lavar las células dos veces con PBS por centrifugación.
Antes de resuspender las células lavadas en medios hematopoyéticos completos. Activar alrededor de 20 millones de células obtenidas añadiendo 10 microlitros de reactivo de estimulación de células T por cada 2 millones de células. A continuación, después de agregar interleucina-2 humana recombinante a 20 unidades por mililitro, mezcle la solución suavemente y transfiérala a una placa de seis pocillos.
Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas antes de realizar la transducción viral. Al tercer día, transfiera el cultivo celular a un tubo cónico de 50 mililitros y mézclelo bien. Centrifugar el tubo a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar el reactivo de activación.
Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de medio completo antes de contar las células. Ajuste el volumen de suspensión celular utilizando medio completo para lograr una concentración que permita sembrar 0,5 millones de células por pocillo en una placa de 24 pocillos. Añadir interleucina-7 humana recombinante e interleucina-15 humana recombinante a las células en concentraciones adecuadas.
En un tubo aparte, añadir la cantidad deseada de vectofusina-1 al medio Opti-MEM, teniendo en cuenta el volumen viral final a utilizar. Combine esta mezcla con el virus concentrado en una proporción de uno a uno, asegurando una mezcla completa. A continuación, agregue la mezcla resultante que contiene el virus a las células.
Ajuste el volumen total de cada pocillo a 400 microlitros utilizando medio completo si es necesario. Después de cubrir la placa con una tapa, séllela con una película de parafina antes de centrifugarla a 1000 G durante dos horas a 32 grados centígrados. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, recoja y extraiga las células de cada pocillo en un tubo de 50 mililitros. A continuación, centrifuga las células a 400 g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, vuelva a suspender completamente el gránulo en un mililitro de medio completo antes de contar las células.
A continuación, ajuste la concentración celular con el medio para lograr 1 millón de células por mililitro y agregue interleucina-7 recombinante humana e interleucina-15 recombinante humana a 155 y 290 unidades por mililitro respectivamente antes de cultivar las células. Una vez que se alcance el número de células deseado, recoja y transfiera las células a tubos de 50 mililitros y centrifuérrelas. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 10 mililitros de medio para contar las células.
Después de centrifugar nuevamente, deseche el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en una solución de criopreservación que consista en 50% de HSA y 40% de HBSS, a una concentración de 10 millones de células por mililitro por vial criogénico. Transfiera 0,9 mililitros de suspensión celular a cada uno de los números requeridos de viales criogénicos y agregue 10% de dimetilsulfóxido a cada vial criogénico. Coloque los viales criogénicos en hielo y colóquelos rápidamente en un congelador de velocidad controlada para su criopreservación.
A continuación, transfiera las muestras criopreservadas a un tanque de nitrógeno líquido controlado para su almacenamiento a largo plazo. Para evaluar la eficiencia de la transducción, agregue 500 microlitros de tampón FACS a la muestra en un tubo de clasificación celular activado por fluorescencia o FACS. Después de centrifugar la muestra a 400 g y temperatura ambiente durante cinco minutos, deseche el sobrenadante por completo con una pipeta.
Vuelva a suspender el gránulo en una solución diluida de uno a cinco de CD3 en tampón FACS. Agitar la muestra e incubarla durante 30 minutos en hielo en la oscuridad antes de centrifugarla como se demostró anteriormente. A continuación, después de desechar el sobrenadante por completo, vuelva a suspender el gránulo en una solución diluida de uno a 20 de 7-AAD en tampón FACS.
Agite esta mezcla antes de incubarla durante 10 minutos en hielo en un entorno oscuro. Finalmente, agregue 200 microlitros de tampón FACS y proceda a analizar la muestra usando un citómetro de flujo. El análisis de viabilidad de las células transducidas reveló que en el día 14, más del 95% de las células eran CD3 positivas y vivas después de excluir las células 7-AAD positivas, lo que indica una activación y expansión exitosa de las células T.
Se midió que la eficiencia de transducción dentro de la población CD3 positiva era del 58,7% en comparación con las células no transducidas, que exhibieron una eficiencia de transducción del 0,51%Cuando las células transducidas se expandieron desde el día cuatro hasta el día 14, con subcultivo cada dos días, las células experimentaron una expansión de 25 veces. El producto se sometió a varias pruebas de control de calidad y cumplió con todos los criterios establecidos, lo que indica su idoneidad para su uso posterior. Todo el procedimiento debe realizarse con técnicas estrictamente asépticas.
Y el paso más complicado es el proceso de transducción, en el que hay que tener en cuenta todos los reactivos que hay que añadir para mantener un volumen total específico.
