La tomografía TEM se usa ampliamente para obtener imágenes de células, pero es muy limitada en términos de grosor de la muestra. FIB SEM y la tomografía de rayos X blandos se pueden usar para muestras más grandes, aunque a menor resolución. La tomografía STEM llena este vacío perfectamente.
La tomografía STEM proporciona una mirada a muestras de micrones de espesor a una resolución de unos pocos nanómetros. La combinación con la preparación criogénica nos permite ver muestras biológicas y secciones en 3D. Revise los conceptos básicos de la óptica STEM para comprender la formación de imágenes y asegurarse de que el ingeniero de servicio haya alineado bien los modos de vástago y vástago Lomax, y que los pasos de calibración se vean como los del video.
Para comenzar, cargue el archivo de alineación de columnas y abra los valores de columna. Si utiliza un soporte criogénico de entrada lateral, abra el protector criogénico y comience en el modo TEM. El haz debe aparecer en la pantalla.
Baje el aumento si el haz no aparece. Lleve el microscopio al foco eucéntrico presionando el botón en el panel de control. Ajuste el tamaño del punto a un valor conveniente para visualizar la pantalla fluorescente directamente o con la cámara incorporada.
Ajuste el microscopio al modo STEM y verifique que el enfoque utilice las lentes del condensador en lugar del objetivo. En el panel, establezca el enfoque eucéntrico y salga del modo de difracción para los ajustes iniciales. Asegúrese de que el haz no esté en blanco y reduzca el aumento hasta que aparezca el haz en la pantalla.
Ajuste el desplazamiento del haz hacia el centro y aumente el aumento en pasos hasta 70, 000, manteniendo el haz en el centro. Luego inserte la apertura deseada del condensador, generalmente 50 micrómetros para el modo de microsonda, y verifique el centrado de la apertura. Al girar la perilla de enfoque hacia adelante y hacia atrás, el punto debe expandirse y contraerse, pero permanecer en su lugar, como si un avión cortara un reloj de arena vertical imaginario.
Si la apertura no está centrada, la iluminación se desplazará lateralmente como si el reloj de arena estuviera inclinado. Enfoca el haz, presiona el enfoque de la lista de intensidad en la pestaña de alineaciones o vuelve al enfoque eucéntrico. Reajuste la posición del haz hacia el centro y ajuste el centro de rotación.
Ahora, gire la rueda de enfoque al mínimo, o un paso por encima, para que el haz pulse suavemente y asegúrese de que permanezca estacionario a medida que el enfoque se mueve hacia arriba y hacia abajo. Seleccione los puntos de pivote y junte los dos puntos con los ajustes X e Y. Ajuste los estigmas del condensador para que el haz sea redondo.
Sube y baja a través del enfoque para optimizar. No debe haber tendencia a alargarse en una dirección u otra al pasar a través del foco. Normalice las lentes, luego aumente el aumento progresivamente a aproximadamente 240, 000, mientras usa el desplazamiento del haz para mantener el punto centrado y repita los ajustes del centro de rotación y el punto de pivote.
Volver al modo de difracción. En esta etapa, el haz debe aparecer como un disco uniforme en la pantalla fluorescente. La longitud de la cámara ahora controla efectivamente la distancia óptica al detector como una cristalografía de rayos X.
Cámbielo y observe cómo el disco se contrae y se agranda como si la ubicación de la pantalla se moviera hacia o lejos de la muestra. Este cono representa la iluminación de campo claro. Para activar el modo STEM con un gran aumento, comience con el detector de vástago de campo claro y ajuste la alineación de difracción para centrar el haz utilizando la longitud de cámara deseada.
Active la marca de campo claro en la pantalla, reduzca la longitud de la cámara a 330, levante la pantalla e inserte los detectores. Inicie un escaneo en el software del microscopio. Utilice la pantalla del osciloscopio para ayudar a ajustar los ajustes de brillo y contraste como se describe en el manuscrito.
Iterar el ajuste varias veces. Devuelva el microscopio a un aumento relativamente bajo en el registro de aumento alto, sin entrar en modo de aumento bajo. Inserte la pantalla fluorescente y anote la corriente de la pantalla como referencia.
Al igual que en TEM, la corriente se puede cambiar con la lente de la pistola y los ajustes de tamaño de punto con números crecientes correspondientes a una corriente reducida. En este punto, guarde un registro FEG para facilitar el retorno a los valores estándar. Vaya al modo LMTEM para ver la muestra.
Inserte la muestra. Llevar la muestra a la altura eucéntrica. Hay varios métodos para hacer esto.
Por ejemplo, utilice el tambaleante de escenario para inclinar la cuadrícula mientras mueve la altura de la muestra a lo largo del eje Z hasta que la imagen deje de desplazarse lateralmente. Alternativamente, marque algunas características en la pantalla de visualización e incline el escenario de 10 a 30 grados. La función se moverá lateralmente.
Ajuste la altura de la muestra para devolverla a su posición original. Aumente la ampliación o la inclinación de la etapa para refinar y devolver la inclinación a cero grados. Ahora vuelva al modo STEM e inserte el detector STEM.
Asegúrese de que la opción Activar análisis LM no esté marcada. Vaya al modo de aumento alto más bajo. Ajuste el astigmatismo del condensador por el método.
Con el haz sobre un área de muestra delgada, concéntrese en el punto donde el haz transmitido explota entre las imágenes de sombra de la muestra a cada lado. Luego ajuste la sintonización del condensador para hacer que el disco central sea redondo. Esto requiere algo de práctica, especialmente para muestras criogénicas.
Vuelva a la apertura de 50 micrómetros y actualice el registro FEG. Vaya al modo LMSTEM y continúe escaneando para encontrar un área interesante. Si es necesario, reajuste la configuración de brillo y contraste del detector aproximadamente en este punto.
Presione el enfoque eucéntrico, aumente el aumento y refine el enfoque mientras escanea usando el bucle de enfoque proporcionado por el microscopio y verifique el astigmatismo en las cuentas de oro. Hasta ahora, todo se realiza en modo nano sonda. Tenga en cuenta que la inserción de una abertura de condensador más pequeña disminuye el ángulo de semiconvergencia, lo que es útil para muestras gruesas.
Un enfoque alternativo con los instrumentos TFS es cambiar al modo de microsonda, lo que conduce a un ángulo de semiconvergencia reducido. Luego, ajuste la longitud de la cámara para que el ángulo de recolección sea tres veces mayor que el ángulo de convergencia; es decir, las marcas del área del detector BF en la pantalla son aproximadamente tres veces más grandes que el haz.
Estimar la dosis para registrar usando una ecuación. Como regla general, apunte de 100 a 150 electrones por tinta cuadrada para todo el tomógrafo. Devuelva el escenario a un todo y ajuste la corriente del haz utilizando el tamaño del punto o la configuración de la lente de la pistola para alcanzar la corriente de pantalla deseada.
El mapa completo de cuadrícula de bajo aumento registrado en modo STEM muestra las áreas con celdas de interés. Las células aparecen parcialmente brillantes con electrones dispersos hacia el detector HAADF. El mapa de resolución media grabado en modo STEM mostraba dos mapas de anclaje de resolución media.
La inclinación de cero grados de una serie de inclinación del tallo permitió la visualización de los depósitos de fosfato de calcio, crestas y marcadores fiduciales de oro de una mitocondria. Se muestra una representación volumétrica de secciones de 60 nanómetros y 40 nanómetros de espesor. La tomografía criovástago, o CSTET, proporciona un puente entre la biología estructural y la biología celular, así como un contexto para la fluorescencia de súper resolución.
Sin la necesidad de seccionamiento o preparación de láminas, podemos ver todo el teatro celular en un estado casi nativo.
