iPS 유래 미세아교세포는 시험관 내 실험을 위한 생물학적으로 관련된 인간 미세아교세포 공급원을 나타내며 건강 및 질병 분야에서 미세아교세포 생물학을 조사하는 중요한 도구입니다. 우리는 성장 인자를 최소한으로 사용하고 높은 순도와 수율을 달성하는 간단한 미세아교세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 완전히 인간화 된 식균 작용 분석을 입증합니다.
iPSC 유래 미세아교세포 유사 세포는 배지 증발에 매우 민감합니다. 세포 배양 접시 모서리에 있는 우물을 사용하지 말고 모든 빈 우물을 물로 채워 생존율을 높여야 합니다. 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC가 80 % confluency에 도달하면 1 밀리리터의 DPBS로 세척하고 1 밀리리터의 해리 시약을 섭씨 37도에서 2 분 동안 추가하여 콜로니를 해리합니다.
세포 리프터를 사용하여 여러 번 긁어 단일 세포 현탁액을 만들어 콜로니를 제거합니다. 현탁액을 모아서 9 밀리리터의 DPBS가 들어있는 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 500배 g에서 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 배아체 또는 EB 배지의 1밀리리터에 재현탁시킨다.
10 마이크로 리터의 세포를 취해 트리 판 블루로 1-2 개를 희석하십시오. 혈구계에서 세포를 계수하고 세포 수에 따라 세포 스톡을 100 마이크로 리터 당 10, 000 세포의 최종 희석액으로 희석합니다. 도금 세포의 경우 웰당 희석된 세포 100마이크로리터를 저접착 둥근 바닥 96웰 플레이트에 추가합니다.
플레이트를 125배 g에서 3분 동안 원심분리하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 4일 동안 배양합니다. 둘째 날에는 다중 채널 피펫을 사용하여 기존 half-EB 배지를 새 배지로 교체하십시오. 원시 대식세포 전구체 또는 PMP를 생성하려면 얼음처럼 차가운 Matrigel 코팅 용액 1밀리리터를 추가하여 6웰 플레이트의 웰을 코팅합니다.
그런 다음 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 2시간 동안 또는 밤새 배양합니다. EB 분화 4일째에 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 EB를 Matrigel이 코팅된 웰로 옮깁니다. 우물에서 EB를 제거하기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다.
그런 다음 EB가 우물 가장자리에 정착 할 수 있도록 플레이트를 기울인 상태로 유지하십시오. 모든 EB가 안정되면 부드럽게 피펫팅하고 기존 배지를 교체하고 EB를 우물 가장자리에 3ml의 새로 준비된 PMP 완전 배지로 유지합니다. 플레이트를 좌우로, 뒤에서 앞으로 수동으로 섞어 웰에 세포를 고르게 분배하십시오.
그런 다음 EB가 우물 바닥에 부착되도록 플레이트를 7 일 동안 배양하십시오. 7일 후, 라이트 필드 현미경으로 EB를 4배 배율로 검사하여 웰 바닥에 부착되었는지 확인합니다. 반 배지 변경을 수행하고 21 일에 전체 배지를 3 밀리리터의 PMP 완전 배지로 교체하십시오.
28일째에, 상청액에서 PMP로 지칭되는 둥근 세포를 찾는다. 그런 다음 EB를 방해하지 않고 10밀리리터 피펫과 자동 피펫을 사용하여 PMP가 포함된 배지를 수집합니다. 배지의 PMP를 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
수집된 PMP를 200회 g에서 4분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인한 후 1-2밀리리터의 미세아교세포 유사 세포 또는 IMG 기본 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 앞에서 설명한대로 혈구 측정기에서 세포를 세십시오. 나머지 세포를 원심 분리하고 PMP를 원하는 농도로 희석하십시오.
이어서 세포를 신선하게 제조된 IMG 완전 배지를 사용하여 세포 배양 처리된 플레이트 상에서 평방 센티미터당 10 내지 5번째 세포의 밀도로 플레이트화한다. 살아있는 세포 식균 작용 분석을 위해, 96-웰 플레이트와 100 마이크로리터의 IMG 완전 배지에 10 내지 4번째 PMPs를 20 내지 30회 플레이트하고 10일 동안 분화 과정을 따른다. 분석 당일, 웰당 40 마이크로리터의 배지를 제거하고, 10 마이크로리터의 핵 염색 용액을 첨가한다.
접시를 2 시간 동안 배양하십시오. 표지 된 시냅 토좀을 얼음에서 해동하고 물 초음파 처리기를 사용하여 1 분 동안 부드럽게 초음파 처리합니다. 다시, 즉시 시냅 토솜을 얼음 위에 놓습니다.
표지된 시냅토솜을 IMG 완전 배지에서 배지 50마이크로리터당 1마이크로리터의 시냅토솜으로 희석합니다. 음성 대조군의 경우, 액틴 중합을 억제하기 위해 IMG 완전 배지에서 60 마이크로 몰 사이토 칼라 신 D를 준비하여 식균 작용을 억제합니다. 그런 다음 10 마이크로 몰의 최종 농도를 위해 각 웰에이 용액 10 마이크로 리터를 첨가하고 30 분 동안 배양합니다.
인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 섭씨 10도에서 10 분 동안 배양하십시오. 플레이트를 얼음 위에 유지하고 시냅토솜을 포함하는 배지 50마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 10도에서 3분 동안 270회 g으로 원심분리하고, 이미징이 획득될 때까지 플레이트를 얼음 위에 유지한다.
플레이트를 라이브 셀 이미징 리더에 삽입하고 분석할 웰을 선택합니다. 그런 다음 20X 대물 렌즈를 선택합니다. 그런 다음 초점, 발광 다이오드 또는 LED, 강도, 통합 시간, 명시야 및 청색 채널의 게인을 조정합니다.
시냅토솜 형광은 초기 시점에서 무시할 수 있어야 합니다. 우물당 몽타주에서 획득할 개별 타일의 수를 선택합니다. 우물 중앙에 16개의 타일을 획득하여 전체 우물 면적의 약 5%를 이미징합니다.
온도를 섭씨 37도로 설정하고 원하는 이미징 시간 간격을 설정합니다. 그런 다음 분석 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 이미지가 포함된 실험을 열고 데이터 축소 아이콘을 클릭합니다.
메뉴에서 이미징 처리에서 이미징 스티칭을 선택하여 텍스트 원고에 설명된 매개변수를 사용하여 몽타주의 4x4개의 개별 타일에서 완전한 이미지를 만듭니다. 이러한 이미지에 대한 DAPI 및 RFP 채널을 사용하여 강도 임계값을 정의합니다. 이미지를 열고 분석을 클릭합니다.
분석에서 셀룰러 분석을 선택하고 검색 채널에서 DAPI 또는 RFP 채널에서 결합된 이미지를 선택합니다. 다음으로 기본 마스크 및 카운트 탭으로 이동하여 DAPI 채널의 세포핵 또는 RFP 채널의 시냅토솜 신호를 적절하게 선택하는 임계값 및 개체 크기 값을 설정합니다. 핵 수를 계산하려면 데이터 축소 메뉴로 이동하여 이미지 분석에서 세포 분석을 선택합니다.
다시 기본 마스크 및 개수 탭으로 이동하고 채널에서 DAPI 스티칭 이미지를 선택하고 텍스트 원고에 설명된 매개 변수를 사용합니다. 다음으로, 계산된 메트릭 탭으로 이동하여 셀 수를 선택합니다. 그런 다음 시냅토솜 신호의 영역을 얻으려면 데이터 축소 메뉴로 이동하여 분석에서 세포 분석을 선택합니다.
다시 기본 마스크 및 카운트 탭으로 이동하여 채널에서 RFP 스티칭 이미지를 선택하고 텍스트 원고에 자세히 설명된 매개변수를 사용합니다. 다음으로, 계산된 메트릭 탭으로 이동하여 개체 합계 영역을 선택합니다. 데이터 축소 탭에서 확인을 클릭하여 소프트웨어가 획득한 모든 이미지를 분석할 수 있도록 합니다.
이미지가 분석되면 각 시점에 대한 개체 합계 영역 및 셀 수 값을 내보냅니다. 그런 다음 개체 합계 영역을 셀 수로 나누어 시점당 정규화된 영역을 계산합니다. 여러 치료 또는 유전자형을 비교하는 경우 주어진 방정식을 사용하여 식균 작용 지수를 계산하십시오.
미분화 iPSC는 잘 정의된 가장자리를 가진 콤팩트한 콜로니 형태를 보여줍니다. 해리 된 iPSC는 EB라고하는 구형 응집체를 형성하고 분화 4 일째까지 크기가 커집니다. EB가 PMP 생성을 위해 도금되면 Matrigel 코팅 플레이트에 부착되고 세포 층이 퍼져 구형 응집체를 둘러 쌉니다.
28 일째에 세포질 대 핵 비율이 큰 둥근 세포가 현탁액에 나타납니다. 라미닌 521 코팅 플레이트에서 PMP 수율이 높기 때문에 Matrigel 대신 Laminin 521 코팅 플레이트에서 iPSC를 배양하는 것이 좋습니다. PMP가 IMG 배지에 노출 된 후, 세포는 길쭉한 과정이있는 상태에서 작은 세포질을 갖는 미세 아교 세포와 같은 형태를 얻는다.
또한, 미세아교세포 동일성은 면역형광염색으로 확인하였다. 일반적으로 세포의 95% 이상이 IB1을 발현하고 세포의 약 90%가 P2RY12 및 TMEM119를 발현합니다. 웨스턴 블롯 분석 결과 iPSC는 인간 시냅토솜의 발현 시냅스 마커, 시냅토피신 및 시냅스 후 밀도 단백질 95에 대해 낮은 운동 뉴런을 유도한 것으로 확인되었습니다.
초기 시점과 비교하여 대조군에서 10 시간까지 대부분의 시냅 토솜이 삼켜졌고 산성 세포 내 구획에 국한되어 적색 형광 신호가 강력했습니다. Cytochalasin D- 처리 된 IMG에서 0 시간 및 10 시간 동안 적색 신호의 강한 감소는 검출 된 신호가 식세포 사건의 결과임을 나타냅니다. 삼켜진 시냅토좀의 면적은 16시간까지 시간이 지남에 따라 증가했습니다.
그러나, Cytochalasin D- 처리 된 세포로부터의 적색 신호의 영역은 시간이 지남에 따라 증가하지 않았다. iPS 유래 미세아교세포 유사 세포는 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환 연구에서 식균 작용 및 염증 반응을 포함한 다양한 응용 분야에 사용될 수 있습니다.
