,,, NRSA (DPS F32-NS-066698) 작업은 스미스 가족 재단 (BS), 다나 재단 (BS), 존 머크 학자 프로그램 (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801)에서 교부금에 의해 지원되었다 낸시 루리 마크 재단 (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC 이미징 코어).

RGC 시냅스 입력의 1. 선행 성 라벨 주 : 동물의 사용과 관련된 모든 실험은 모든 NIH의 지침에 따라 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 감독되었다. <ol><li> 필드와 악기를 소독. </li><li> 플렉시 유도 챔버에서 4 부피 %의 이소 플루 란 (이 부피 %의 이소 플루 란 신생아 - 성인 마우스 작동)와 마우스를 마취. 오버 마취 방지하기 위해 밀접하게 쥐를 관찰합니다. 주의 : 진공 배기 가스 배출과 흡입을 피할 것. </li><li> 1-3 분 후, (이전 마우스는 적은 시간이 필요합니다) 마취의 적절한 수준이 꼬리를 곤란하게 (아무 반응이 관찰 될 수 없습니다)와 호흡 속도 (속도가 느리고 꾸준한해야한다) 관찰에 의해 달성되어 있는지 확인합니다. </li><li> 주둥이에 3-4 부피 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 제공하는 측면과 장소 코 콘 스테레오 현미경으로 마우스를 놓습니다 (신생아 &lt;생후 10 (P10) ~ 4 부피 %;&gt; P10 ~ 3 부피 %). </li><li> 공막을 노출합니다. 신생아의 주입 전에 아이 오프닝에, 눈꺼풀을 열고 공막을 노출 피부를 뒤로 당겨 작은 봄 가위를 사용합니다. 나이가 쥐의 경우, 공막을 노출하는 눈 주위의 피부를 뒤로 당겨 손가락을 사용합니다. 주의 : 신생아에서, 때로는 눈의 구석에 또 다른 수직 절단이 필요합니다. 절단하는 경우, 과도 출혈하는 혈관이 있기 때문에 눈꺼풀의 모서리를 절단 할 때주의하십시오. </li><li> 공막이 시작되는 줄에서 눈의 측면에 작은 구멍을 천공 멸균 30.5 G 바늘을 사용합니다. 다만 충분히 경사가 눈에가는 것을 바늘을 삽입하여 렌즈가 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 유리체는 구멍의 흐름과 액체를 흡수하기 위해 멸균 면봉을 사용할 수 있습니다. </li><li> 유리체는 구멍에서 흐르는 중지되면, 선행 성 추적 염료로 사전로드 해밀턴 주사기에 부착 된 무딘 엔드 바늘을 삽입구멍에. 주의 : 천천히 눈의 다른면을 천공이나 렌즈의 손상을 방지하기 위해 바늘을 삽입합니다. </li><li> 천천히 눈에 염료를 주입. 일반적으로, 알렉사 594, 647, 또는 488 (CTB-594, CTB-647, 또는 CTB-488, 5-6 ㎍ / μL)에 접합 된 서브 유닛 β 콜레라 독소 anterogradely 추적 RGC 입력하는 데 사용됩니다. 신생아 (≤의 P10)의 경우 1 ~ 2 μL는 충분하며, 마우스의 경우&gt; P10 ~ 3 μL 충분하다. 참고 : 알렉사 염료 리소좀 저하에 특히 저항 </li><li> 몇 초 동안 구멍에 바늘을두고 천천히 제거합니다. </li><li> 과잉 유동성을 흡수하고 밖으로 누출 염료를 방지하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 눈에 항생제 연고의 작은 금액을 적용합니다. 눈이 수술 열린 경우 모두 살짝 눈꺼풀의 위치를​​ 변경. </li><li> 두 눈을 주입하는 경우, 다른 눈에 절차를 반복합니다. </li><li> 이 anesth에서 회복하기 시작 때까지 다음과 같은 주사 (들), 열 램프 아래 또는 열 패드에 마우스를 남겨ESIA. </li><li> 깨끗한 집 케이지에 마우스를 반환하고 식민지로 돌아 가기 전에 잠에서 깨어 있는지 확인하기 위해 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 이미징 조직 준비 이 조직 준비 프로토콜은 식세포가 형광 마커 (예, 미세 아교 세포에 대한 CX3CR1-EGFP)으로 표시되는 기자 마우스에 사용됩니다. 기자 라인을 사용할 수없는 경우, 조사 (토론 참조) 조직 섹션을 immunostain 수 있습니다. <ol><li> ~ 24 시간 주사 후 마우스를 희생하고 두뇌를 해부하다. </li><li> 밤새 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 채워진 팔콘 튜브에 뇌를 해결 하락 주의 : PFA는 독성이다. 흄 후드 또는 하강 기류 테이블에 사용 및 개인 보호 장비를 착용하여 흡입 및 피부 노출을 피하십시오. 주의 사항 : 고정은 (≥ 4 시간) 단축 될 수 있습니다. 대신 드롭 고정 또한, 4 % PFA 관류 사용 2-24 시간 드롭 수정 올 수 있습니다. 그러나 perfuse의 비교고정 신생아와 성인의 두뇌를 드롭 D는 이미지 품질이나 정량에 차이를 보이지 않았다. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 뇌의 3 배를 씻어. <ol><li> 빈 무게 배에 뇌와 PFA를 붓는다. </li><li> 다른 두뇌를​​ 전송하기 위해 주걱을 사용하여 PBS로 가득 보트의 무게. </li><li> 두 번 더 PBS에 세척 뇌 (전송 뇌의 두 개 더로는 PBS로 가득 보트의 무게). </li></ol></li><li> 30 % 자당 용액으로 채워진 팔콘 튜브에 머리를 전송합니다. 뇌가 튜브 (48 시간)의 바닥에 침몰 할 때까지 4 ° C에서 자당의 두뇌를 남겨주세요. </li><li> 뇌가 싱크되면 절편의 두뇌를 준비합니다. 다음 단계는 냉동 스테이지 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 40 ㎛의 부동 부분의 제조 (저온 유지 장치도 사용될 수있다)이다. <ol><li> (dLGN를 들어, 뇌의 주동이의와 꼬리 부분을 제거) 필요하지 않은 뇌의 일부를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다. </li><li> 브래지어를 고정드라이 아이스에 알루미늄 호일에있는. 이 시간 동안, 마이크로톰 스테이지를 고정하고 0.5 ㎖의 0.1 M 인산 완충액 (PB)를 24 - 웰 플레이트의 각 웰을 채운다. </li></ol></li><li> 냉동 무대에서 (이 불투명 나타납니다) 냉동 뇌를 탑재합니다. <ol><li> 무대에 최적의 절단 온도 화합물 (10 월)의 작은 금액을 적용합니다. </li><li> OCT를 동결하기 시작하면, OCT의 두뇌를 놓는다. 절단됩니다 뇌의 끝은 (꼬리 쪽을 얼굴 dLGN 위해, 예를 들어)을 위로 향하게해야합니다. </li><li> 매우 미세하게 분쇄 된 드라이 아이스와 뇌와 OCT를 포함한다. </li><li> ~ 30 초 동안 뇌 / on 10 월 드라이 아이스를 남겨주세요. </li><li> 드라이 아이스를 제거하는 큰 페인트 브러시를 사용합니다. 뇌와 OCT를 무대에 고정되어야한다. </li></ol></li><li> 또한 (ROI)의 영역에 도달 할 때까지 조직을 통해 구획 시작한다. </li><li> ROI에 도달하면, 블레이드의 부분을 제거하고 24 - 웰 플랫폼로 전송할 작은 페인트 솔을 이용E 0.1 M PB (단계 2.5.2)를 포함. 이전의 블레이드에서 섹션을 제거하는 0.1M의 PB에 적셔서 촉촉한 페인트 붓을 유지합니다. 참고 : 섹션 4 ℃에서 하룻밤 0.1 M PB에 남아있을 수 있습니다 </li><li> 섹션가 수집되고 나면, 형광 해부 현미경 선행 성 라벨을 시각화하고 투자 수익 (ROI)을 포함하는 섹션을 선택합니다. </li><li> 작은 페인트 브러시와 슬라이드 섹션을 탑재합니다. <ol><li> 충전 된 현미경 슬라이드에 0.1 M PB의 작은 수영장을 적용합니다. </li><li> PB의 풀에 조직 섹션을 전송합니다. </li><li> 방향을 PB 및 페인트 브러시를 사용하여 조직을 확산. </li><li> 초과 PB를 윅 킴 와이프를 사용합니다. 섹션을 심지 않도록주의하십시오. </li><li> 완전히 건조 공기 수 있습니다. </li><li> 각 섹션에 장착 매체의 작은 방울을 적용하고 (22 × 50 mm의 1.5 호) 상단에 커버 슬립을 탑재합니다. </li><li> 영상 세션 때까지 -20 ° C에서 매니큐어 및 저장소와 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 참고 : 이미징하지만준비가 좋습니다 일주일에 슬라이드 이전 영상에 몇 주 동안 -20 ° C로 유지 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 조직 모든 이미지는 회전 디스크 공 초점 현미경 (UltraView 복스 회전 디스크 다이오드 레이저 (405 nm의, 445 nm의, 488 nm의, 514 nm의, 561 nm의, 640 nm의)을 갖춘 공 ​​초점 현미경)에 인수됩니다. 이미지는 또한 (예를 들면, 레이저 스캐닝 공 초점 현미경, 디콘 볼 루션 등 뒤에 epifluorescent 현미경)은 고해상도 Z-스택을 획득하는 능력을 가진 임의의 현미경에 취득 할 수있다. 프레임 크기는 일반적으로 1,000 X 1,000 픽셀입니다. <ol><li> 10 배 배율로 투자 수익 (ROI)을 찾아 이미지를 획득. retinogeniculate 시스템에서 미세 아교 세포 이미징의 경우, 투자 수익 (ROI)이 가장 내측 dLGN 섹션입니다. </li><li> 높은 배율로 이동 (60X 계획 아포 목적, NA 1.4는 일반적으로 사용되는 =). </li><li> 0.2 μm의 Z-단계를 사용하여 식세포를 포함하는 뷰의 첫 번째 필드 획득의. </li><li> 동물 당 식세포를 포함하는 15-19 더 많은 필드를 취득. </li></ol> 4. 정량화 (ImageJ에)에 대한 이미지를 준비 <ol><li> ImageJ에있는 열기 Z-스택. </li><li> 이미지 메뉴에서 색상 및 분할 채널로 이동합니다. </li><li> 가득 채우고 재료를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다. <ol><li> 가득 채우고 재료 (예를 들면, 시냅스 입력)를 포함하는 채널 창을 선택합니다. </li><li> 프로세스 메뉴로 이동 빼기 배경을 선택합니다. dLGN에있는 시냅스 입력의 선행 성 추적 10 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다. 참고 : 롤링 볼 반경이 경험적으로 결정된다. 그러나, 일반적으로 배경의 일부가 아닌 이미지에서 가장 큰 개체의 반​​경만큼 커야한다. </li></ol></li><li> 식세포를 포함하는 채널을 부드럽게. <ol><li> 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다. </li><li> 프로세스 메뉴 및 셀프로 이동요법 필터, 평균. 1.5의 평균 필터 (이것은 이후 단계에서 표면의 렌더링 이미지를 부드럽게)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 식세포를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다. <ol><li> 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다. </li><li> (설정은 경험적으로 결정해야합니다) 빼기 배경을 선택, 프로세스 메뉴로 이동합니다. EGFP 양성 미세 아교 세포에 대한 50 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다. </li></ol></li><li> 이미지 메뉴로 이동하고 색상, 채널 병합을 선택하여 채널을 병합합니다. </li><li> (이것은 빠른 렌더링 표면을 만드는 5 단계 참조) 병합 파일에서 식세포를 포함 자르기 ROI. <ol><li> 도구 모음에서 직사각형 선택 도구를 사용하여 투자 수익 (ROI)의 주위에 상자를 그립니다. </li><li> 이미지 메뉴로 이동하여 자르기를 선택합니다. </li></ol></li><li> (단계 4.2 참조) 다시 채널을 분할합니다. </li><li> 자신의 TIFF 파일로 각 채널을 저장합니다. </li></ol> 5. 정량화를 위해 이미지를 준비Imaris에 <ol><li> 열기 Imaris과 볼륨 아이콘이 왼쪽 상단 메뉴 (그림 2)에 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> 잘라낸 이미지의 열기 첫 번째 채널 (채널 중 하나, 그냥 일관성이 처음 열릴 수 있습니다.) </li><li> 다른 채널을 추가합니다. 편집 메뉴로 이동하여 채널을 추가하고 파일의 다음 채널을 선택을 선택합니다. (나머지 채널에 대해이 단계를 반복합니다.) 참고 : 색상을 변경하려면 표시 조정 창으로 이동하여 채널 이름 (그림 3A)을 클릭합니다. 이 색상을 조정하는 대화 상자가 나타납니다. 화면 조정 화면이 표시되지 않는 경우, 편집 메뉴로 이동하여 디스플레이 조정을 선택합니다. </li><li> 픽셀 값을 조정합니다. 편집 메뉴로 이동하여 이미지 속성을 선택합니다. 이 창에서, x, y 및 z 픽셀 값 (이 값은 현미경 대물, 카메라, 및 z 단계 취득에 의존하여 이미지를 획득하는 데 사용되는 소프트웨어에서 찾아 볼 수있다)를 조정. </li><li> 단계 5.5은 매우 발생합니다작은 이미지. 의 크기를 조절하려면, 오른쪽 하단 모서리에있는 맞춤 아이콘 (그림 2)을 클릭합니다. </li><li> 화면 조정 창에서 왼쪽과 가운데 삼각형을 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다. </li></ol> 식세포의 6. 3 차원 (3D) 표면 렌더링 <ol><li> 상단 도구 모음에서 능가 ​​모드 (그림 3C)를 선택해야합니다. </li><li> 화면 조정 창에서 식세포 채널을 제외한 모든 채널을 선택 취소합니다. 이 시야에서 제거됩니다. </li><li> 표면 렌더링 아이콘 (그림 2)를 클릭합니다. </li><li> 작성 창 왼쪽 아래 (그림 4A) 표시됩니다 반드시 세그먼트의 ROI는이 첫 번째 창에서 선택을 취소합니다. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오. </li><li> 스무딩을 조정합니다. <ol><li> 다음 창에서 풀다운 메뉴 (그림 4B)에서 식세포 채널을 선택합니다. 이것은 조정표면화되고 (0.1 μm의 다듬기는 일반적으로 미세 아교 세포에 사용되는) 경험적으로 결정되어야한다 세부 금액입니다. </li><li> 절대 임계 값을 선택합니다. </li><li> 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 임계 이미지. <ol><li> 이미지 (그림 4C) 적절하게 표면화 될 때까지 막대 그래프 및 드래그를 클릭합니다. 이것은 형광 이미지 위에 겹쳐 회색 표면은 정확한 표면 표현 보장하기 위해 이미지를 회전하여 실험적으로 결정된다. 참고 : 회전 화면 (그림 3B)의 상단 오른쪽에있는 포인터 메뉴에서 이동을 선택, 클릭하고 회전 할 이미지를 누릅니다. 원래 방향으로 이미지를 반환하려면 원점을 선택하면 하단보기 메뉴에서 왼쪽. </li><li> 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 다음 창에서 이미지가 매우 잡음이되지 않는 등의 크기에 의해 모든 표면을 필터링 할 수있는 옵션이있어, 필터링을 삭제하지 마십시오자동으로 표시 Y 필터. 식세포를 렌더링 표면을 완료 아래에있는 녹색 화살표를 클릭합니다. 탭의 새로운 세트는 (그림 5)가 나타납니다 </li><li> 필요한 경우, 그 식세포의 일부가 아닌 모든면을 삭제합니다. <ol><li> 선택 옵션이 포인터 메뉴 (그림 3B)에 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> 이 노란색으로 변하도록 삭제 될 모든 표면을 클릭합니다. 제어 버튼을 누른 상태에서 여러 개의 표면을 삭제하려면 표면을 클릭합니다. </li><li> 연필 탭에서 삭제를 클릭합니다. </li></ol></li><li> 를 선택하고 한면에 식세포의 모든 표면을 병합합니다. <ol><li> 유입 경로 (; 그림 5C, 즉 필터 탭)을 클릭합니다. </li><li> 추가를 클릭합니다. </li><li> 어떤 필터를 선택까지 (모든 표면은 황색이어야한다) 왼쪽에있는 막대 그래프를 드래그합니다. </li><li> 다시 연필 탭으로 이동하여 통일을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 그래프 탭으로 이동합니다 (그림 5A </strong&gt;) 및 세부 정보를 클릭하고 표시 할 매개 변수를 선택합니다. 볼륨 (그림 5D)을 선택합니다. 여러 매개 변수를 표시, 왼쪽 아래에있는 렌치 아이콘 (그림 2)로 이동하고 기록하는 매개 변수를 선택합니다. </li><li> 식세포의 볼륨을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다. </li></ol> 가득 채우고 소재의 7. 3D 표면 렌더링 <ol><li> 식세포에 의해 침몰 된 재료를위한 새로운 채널을 만듭니다. <ol><li> 식세포 표면이 선택한 상태에서 연필 탭을 클릭합니다. </li><li> 모든 마스크를 클릭합니다. </li><li> 표시되는 대화 상자에서 침몰 자료 (; 그림 (b) 예를 들어, 시냅스 입력의 선행 성 추적)에 해당하는 채널을 선택합니다. </li><li> 마스크를 적용하기 전에 중복 채널을 선택하고 확인을 누르십시오. </li><li> 새로운 채널이 침몰 된 소재만을 포함하고 내부 디스플레이 조정 창에 나타납니다식세포. </li></ol></li><li> 표면 렌더링 총 빨아 nonengulfed 물질을 포함하는 채널입니다. <ol><li> 표면 할 채널을 제외하고 표시 조정 창에있는 모든 채널의 선택을 취소하고 식세포에 대해 생성 된 표면을 취소합니다. </li><li> 다시 표면 렌더링 아이콘을 클릭합니다 (단계 6.3 참조) (6.4-6.11 단계) 식세포에 대해 설명한 것과 동일한 단계를 사용하여 채널의 표면을 만들 수 있습니다. 참고 : 이전에 (단계 6.5, 그림 (b))을 부드럽게하고 임계 값에 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 값을 적어 두십시오 (; 그림 4C 단계 6.6 참조). 이 값은 또한 표면 렌더링 후 얻을 수있는 것은 (지팡이 탭, 그림 5A) 완료됩니다. </li></ol></li><li> 총 침몰과 비 가득 채우고 재료의 양을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다. </li><li> 표면 가득 채우고 재료 (식세포 내 소재)를 렌더링합니다. <ol><li> 만의 형광을 시각화침몰 재료의 새로운 채널 (단계 7.2.1 참조). </li><li> 상기와 같은 단계를 (7.2-7.3 단계)에 따라. 참고 : (단계 7.1에서 만든 새 채널을 선택) 이전 평활화 풀다운 메뉴에서 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 창에서 수동 다운로드 잠겼 비 잠겼 재료 (단계 7.2.2 참조) 렌더링 설정된 임계 값을 입력한다. </li></ol></li><li> 침몰 물질의 양을 기록하고 계속 진행하기 전에 파일을 저장합니다. </li></ol> 8.보기의 필드의 총 양을 계산 <ol><li> 모든 채널의 새로운면을 만듭니다. </li><li> 전체 필드가​​ 표면화되도록 임계 창 (단계 6.6)에서, 막대 그래프를 왼쪽으로 끝까지 밀어 넣습니다. </li><li> 전체 필드를 부상 완료하고 (6.7-6.11 단계) 양을 기록한다. </li><li> 파일을 저장합니다. </li></ol> 9. 포식 재료의 양을 계산 <ol><li> 의 농도를 계산다음과 같은 알고리즘을 사용하여 총 침몰과 비 가득 채우고 재료 채널 : 필드 (8 단계)의 총 가득 채우고과 비 가득 채우고 재료의 양 (7.3 단계) / 볼륨. </li><li> 다음과 같은 알고리즘을 사용하여 셀 당 %의 말림를 계산 (가득 채우고 재료의 양 (7.5 단계) / 식세포 (단계 6.11)의 총 양이) × 100 노트 : 셀의 크기의 변동을 고려하여이 데이터는 식세포의 총 부피로 정규화된다. 단계 9.1에서 숫자 필드에 걸쳐 매우 가변적 인 경우 9.1로 계산 단계 9.2에서 데이터를 정규화 할 필요가있다. </li></ol>

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	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Aguzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+scapegoat,+saboteur,+or+something+else.">Microglia: scapegoat, saboteur, or something else.</a> Science. 339 (6116), 156-161 (2013).</li><li>Tremblay, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain.">The role of microglia in the healthy brain.</a> J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Dheen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+and+its+implications+in+the+brain+diseases.">Microglial activation and its implications in the brain diseases.</a> Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Katz, L., Shatz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+constuction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the constuction of cortical circuits.</a> Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Hua, J. Y., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+and+the+dynamics+of+central+nervous+system+development.">Neural activity and the dynamics of central nervous system development.</a> Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li><li>Butz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+structural+plasticity.">Activity-dependent structural plasticity.</a> Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).</li><li>Bruel-Jungerman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+plasticity+mechanisms+and+memory:+a+party+of+four.">Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four.</a> Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+during+development+and+disease:+immune+molecules+take+centre+stage.">Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage.</a> Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).</li><li>Alexander, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complement+system:+an+unexpected+role+in+synaptic+pruning+during+development+and+disease.">The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).</li><li>Brown, A., Weaver, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dark+side+of+neuroplasticity.">The dark side of neuroplasticity.</a> Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li><li>Tan, A. M., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury,+dendritic+spine+remodeling,+and+spinal+memory+mechanisms.">Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms.</a> Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).</li><li>Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+spinal+cord+plasticity+in+health+and+disease.">Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;quad-partite&amp;#34;+synapse:+Microglia-synapse+interactions+in+the+developing+and+mature+CNS.">The &amp;#34;quad-partite&amp;#34; synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS.</a> Glia. 61 (1), 24-36 (2013).</li><li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-induced+trafficking+and+turnover+of+the+cis-Golgi+glycoprotein+GPP130.">Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130.</a> Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Knobloch, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+loss+and+synaptic+alterations+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease.</a> Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).</li><li>Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+synaptic+pathophysiology+in+neurodegeneration:+insights+from+Huntington's+disease.">Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease.</a> Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).</li><li>Noda, M., Suzumura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweepers+in+the+CNS:+Microglial+Migration+and+Phagocytosis+in+the+Alzheimer+Disease+Pathogenesis.">Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2012).</li><li>Rotshenker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophage+activation+and+the+regulation+of+complement-receptor-3+(CR3/MAC-1)-mediated+myelin+phagocytosis+in+injury+and+disease.">Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease.</a> J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).</li><li>Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+myelin+in+demyelinative+disease:+a+review.">Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review.</a> Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

식균 작용을 정확하게 측정하기 위해, 재료가 잠겼 리소좀 분해가 발생하면 연구자가 그것을 시각화 할 수있는 방식으로 표시하여야한다. 또, 고해상도 영상은 셀 전체의 볼륨을 시각화하고 그 내용을 정량화 연구원있게 소프트웨어의 사용에 선행 요구된다. 이 프로토콜에서는, 우리는 높은 해상도의 공 초점 현미경 및 3D 재건과 함께 가득 채우고 재료 레이블을 알렉사 염료에 접합 CTB를 사용하?...

<html> 시냅스 회로는 동물의 생활 전반에 걸쳐 리모델링. 개발 두뇌에서 시냅스가 초과 형성하고 시냅스의 일부를 선택적으로 제거 및 8-10 유지하는 시냅스의 유지 및 강화를 포함 시냅스 가지 치기를 받아야한다. 이 프로세스는 성인 신경계의 정확한 연결 특성을 달성 할 필요가있다. 성인에서, 시냅스 또한 특히 학습 및 기억의 맥락에서 플라스틱 일 수있다. 이 가소성의 구조적 상관 관계가 돌기 쪽과 연접 BOUTONS 11 ~ 13의 추가 및 / 또는 제거를 포함하는 것으로 생각된다. 건강한 신경 시스템의 이러한 역할뿐만 아니라, 시냅스 리모델링은 신경계 질병 / 상해 12,14,15에 참여하고있다. 예를 들면, 척수 손상 후, 절단 축삭이어서 개조 및 기능적 회복 16-19을 달성하기 위해 새로운의 시냅스를 형성한다. NT는 &quot;&gt; 시냅스 가소성의 중요한 부분으로 신흥 식균 작용 또는 제거 3,5,20 향하는 시냅스의 말림하는 과정입니다. 우리는 최근 건강, 출생 후 마우스의 뇌 7 시냅스 가지 치기의 맥락에서이 현상을 보였다. 특히 , 미세 아교 세포는 상주 CNS 면역 세포와 대 식세포는 피크 기간 동안 발달 시냅스 가지 치기, 시상의 출생 등의 측면 굽은 핵 (dLGN)의 영역에서 시냅스 입력을 삼켜 표시했다.이 말림의 유전자 또는 약물 봉쇄 시냅스 연결의 지속적인 적자로 만들었습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 시냅스 입력 식세포 매개 말림을 측정하는 신뢰성 높은 정량 분석​​에 대해 설명합니다. 이 문서의 목적을 위해,이 분석에서는 망막에 존재하는 망막 신경절 세포를 포함 현상 retinogeniculate 시스템 (망막 신경절)의 맥락에서 제시 될 것이라는dLGN (그림 1A)에 시냅스 입력을 전망이다. 시작하기 위해, 리소좀 분해 내성 선행 성 라벨 전략 dLGN에서 RGC 특정 시냅스 입력 (도 1) 7,21를 시각화하는데 사용되는, 설명한다. 이 설명, 이미징을위한 세부 방법론에 따라 정량적으로 3 차원 (3D) 표면의 볼륨 렌더링과 결합 된 공 초점 현미경을 사용하여 말림을 측정하는 받게 될 것입니다. 이 방법론은 고정 티슈 제조에 기반뿐만 아니라 라이브 영상 연구에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 분석은 건강한, 출생 후의 retinogeniculate 시스템의 맥락에서 검증되었지만 중요한 하나는 다른 뇌로 걸쳐 질병 중에 식세포 신경 세포의 상호 작용뿐만 아니라 다른 장기 시스템의 식세포 기능을 평가하기 위해 동일한 기술을 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Heat pad</td><td>Vet Equip, Inc.</td><td>965500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Warm water source for heat pad</td><td>Kent Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>DSC Optical</td><td>Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope</td><td></td></tr><tr><td>Sliding microtome with freezing stage</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Leica</td><td>14021607100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800 with Epi-fluorescence attachment</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal microscope</td><td>Perkin Elmer</td><td>UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l Hamilton gas tight syringes</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>Use a different syringe for each color dye/tracer</td></tr><tr><td>Hamilton needles</td><td>Hamilton</td><td>7803-05, specifications: blunt, 1.5&quot;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-conjugated cholera toxin &amp;beta; subunit (CTB)</td><td>Invitrogen</td><td>488: C22841</td><td>Reconstitute in sterile saline, 80 &amp;micro;l (488), 100 &amp;micro;l (594), 20 &amp;micro;l (647)</td></tr><tr><td>594: C22842</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>647: C34778</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>30.5 G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicator</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment.</td></tr><tr><td>Dissection tools &amp;ndash; scissors, forceps, spatula</td><td>Small scissors: Fine Science Tools</td><td>Small scissors:14370-22</td><td></td></tr><tr><td>Large scissors: Roboz</td><td>Large scissors: RS-6820</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#55 forceps: Fine Science Tools</td><td>#55 forceps: 11255-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula: Ted Pella, Inc.</td><td>Spatula: 13504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501-5KG</td><td>Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)</td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Weigh boat</td><td>USA Scientific</td><td>2347-1426</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S6566-500G</td><td>Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>Charged microscope slide</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vectasheild</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons

식균 작용은 세포가 주변 세포 환경에서 자료 (전체 세포, 세포, 이물질 등의 일부를) 침몰 이후에 일반적으로 리소좀의 분해를 통해이 물질을 소화하는 과정이다. 미세 아교 세포는 식세포 기능 신경 퇴행성 질환 건강한 뇌의 발달 (알츠하이머 병의 예, 베타 - 아밀로이드 클리어런스) (즉, 시냅스에서의 조건의 넓은 범위에 설명 된 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포 아르 가지 치기) 1-6. 다음 프로토콜 개발 마우스 retinogeniculate 체제 7 연접 입력 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화하고 계량화하기 위해 개발 말림 분석법이다. 이 분석은 특정 컨텍스트에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하기 위해 사용되었지만, 유사한 접근법은 뇌 (예를 들어, 성상 교세포) 및 신체의 나머지 다른 식세포를 평가하기 위해 사용될 수있다(예를 들어, 말초 식세포)뿐만 아니라 시냅스 리모델링이 발생하는 다른 문맥 (예, 뇌 손상 / 질병).

최근에, 우리는 개발 retinogeniculate 시스템의 시냅스 입력의 미세 아교 세포 - 매개 말림 (그림 1) 7을 시각화하고 정량화이 말림 분석을 사용했다. CX3CR1-EGFP 이형 쥐에서 망막 신경절은 anterogradely 각각 왼쪽과 오른쪽 눈에 CTB-594 및 CTB-647으로 추적했다. 이 추적에 이어, dLGN 내에서 EGFP 양성 미세 아교 세포가 몇 군데 있었다. 이러한 이미지는 이후에 볼륨 측정을 위해 표면 렌더링?...

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An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K 조회수.  Boston Children's Hospital, Harvard Medical School.  미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다. 

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Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major immune cells and only phagocytes in the brain, recent studies have shown that astrocytes also participate in various phagocytic processes, such as developmental synapse elimination and clearance of amyloid beta plaques in Alzheimer&#39;s disease (AD). Despite these findings, the efficiency of astrocyte engulfment and degradation of their targets is unclear compared with that of microglia. This lack of information is mostly due to the lack of an assay system in which the kinetics of astrocyte- and microglia-mediated phagocytosis are easily comparable. To achieve this goal, we have developed a long-term live-imaging in vitro phagocytosis assay to evaluate the phagocytic capacity of purified astrocytes and microglia. In this assay, real-time detection of engulfment and degradation is possible using pH indicator-conjugated synaptosomes, which emit bright red fluorescence in acidic organelles, such as lysosomes. Our novel assay provides simple and effective detection of phagocytosis through live-imaging. In addition, this in vitro phagocytosis assay can be used as a screening platform to identify chemicals and compounds that can enhance or inhibit the phagocytic capacity of astrocytes. As synaptic pruning malfunction and pathogenic protein accumulation have been shown to cause mental disorders or neurodegenerative diseases, chemicals and compounds that modulate the phagocytic capacity of glial cells should be helpful in treating various neurological disorders.

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

This protocol presents an in vitro live-imaging phagocytosis assay to measure the phagocytic capacity of astrocytes. Purified rat astrocytes and microglia are used along with pH indicator-conjugated synaptosomes. This method can detect real-time engulfment and degradation kinetics and provides a suitable screening platform to identify factors modulating astrocyte phagocytosis.

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

신경과학

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴을 위한 유세포분석 기반 분석

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

저자 스포트라이트: 정신신경면역학의 기술 혁신을 통한 이해 증진

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

요약

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이 비디오의 챕터

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화