이 방법은 녹색 커피 과일을 사용하여 커피 베리 보어에 대한 살충제의 독성을 테스트합니다. 살충제 적용은 곤충 감염 전후에 곤충 사망률 구충제 및 기타 효과를 연구하기 위해 수행됩니다. 곤충 성장에 적합한 영양소를 가진 실제 녹색 커피를 사용하는 것은 시뮬레이션 된 자연 조건에서 곤충에 대한 화합물의 독성을 평가하는 가장 적절한 방법입니다.
이 프로토콜은 화학 살충제의 독성 영향과 곰팡이 또는 방충제 물질과 같은 병원균에 대한 평가를 가능하게합니다. 과일과 곤충의 이러한 감염은 부적절한 소독으로 인해 오염으로 인한 곤충 사망을 초래할 수 있으므로 중요한 단계입니다. 약한 곤충이 독성 제품의 결과를 과대 평가하기 때문에 곤충의 질도 중요합니다.
시각적 시연은 곤충 감염 과정, 독성 물질을 퍼뜨리는 적절한 순간인 과일의 적절한 단계를 식별할 수 있게 한다. 그리고 과일을 해부하는 방법. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 연구 조교 인 Claudia Martinez가 될 것입니다.
시작하려면 커피 농장에서 개화 한 후 약 120 일에서 150 일의 발달 연령으로 아침 일찍 녹색 커피 과일을 수집하십시오. 약 300 개의 균일 한 크기와 건강한 과일을 선택하고 peduncles를 철회하십시오. 녹색 커피 과일을 2 % 비누 용액에 담그고 문질러 철저히 닦으십시오.
그런 다음 깨끗한 물로 과일을 세 번 헹구십시오. 0.5 % 차아 염소산 나트륨 용액에 담그고 분당 110 회전으로 10 분 동안 쉐이커에 놓습니다. 과일을 깨끗한 물로 세 번 헹구고 멸균 된 종이 타월로 말립니다.
과일을 UV 소스에서 55 센티미터에 15 분 동안 놓고 UV가 가능한 수평 층류 스테이션 내부에 넣어 과일을 조사하십시오. 전체 과일의 적절한 조사를 보장하기 위해 다섯 분마다 과일을 움직입니다. 생물 분석을 설정하려면 같은 날 나온 커피 베리 보어를 0.5 % 차아 염소산 나트륨 용액에 담그고 브러시로 10 분 동안 천천히 교반하십시오.
이 곤충들을 무슬린 천으로 걸러 내고 멸균 증류수로 세 번 씻으십시오. 멸균 종이 타월로 과도한 물을 제거하십시오. 실험 단위 당 30 개의 그린 커피 과일 그룹을 준비하고 플라스틱 상자에 넣으십시오.
휴대용 분무기 유닛을 사용하여 평가를 위해 시험 생성물의 상이한 농도를 적용하고, 여기에서, 5% 및 6% 알칼로이드 에멀젼을 사용하였다. 대조군으로 녹색 커피 과일 그룹에 물을 뿌리십시오. 치료 당 적어도 세 개의 실험 단위를 활용하여 차례로 분무하십시오.
멸균 후드에서 녹색 커피 과일 당 두 개의 커피 베리 보러 성인을 방출하고 30 분 후에 상자를 덮으십시오. 감염된 녹색 커피 과일과 함께 플라스틱 상자를 어두운 곳에서 방이나 인큐베이터 내부의 통제 된 상태로 두십시오. 1, 7, 15 및 21 일 후에 각 상자의 과일 밖에서 보어 과일과 살아있는 곤충과 죽은 곤충의 수를 계산하십시오.
감염 후 20 일 후, 10x 배율로 스테레오 현미경으로 각 녹색 커피 과일을 해부하고 각 과일의 곤충에 의해 손상된 건강한 씨앗이나 씨앗의 수를 계산하십시오. 다른 커피 베리 보어 생물학적 단계를 계산하십시오. 실험 단위 당 곤충 사망률을 결정하기 위해 각 씨앗에서 죽은 곤충의 수를 관찰하십시오.
멸균 후드에서 커피 베리 보러 성인을 이전에 소독 된 그린 커피 과일에 2 대 일 비율로 방출하고 섭씨 21도에서 세 시간 동안 감염이 진행되도록하십시오. 대부분의 녹색 커피 과일은 커피 베리 보어의 복부가 여전히 노출되어 세 시간 후에 감염되어야합니다. 감염된 과일 46개를 선택하여 96웰 플라스틱 랙에 넣어 과일을 천공하는 커피 베리 보어에 직접 뿌릴 수 있도록 합니다.
치료를 위해 랙 세 개를 적어도 세 번, 차례로 스프레이하고 30 분 후에 랙을 덮으십시오. 20 일 후, 10 x 배율로 스테레오 현미경으로 그린 커피 과일을 해부하고 각 과일의 곤충에 의해 손상된 건강한 씨앗이나 씨앗의 수를 계산하십시오. 다른 커피 베리 보러 생물학적 단계와 각 씨앗의 죽은 곤충 수를 계산하여 실험 단위 당 곤충 사망률을 결정하십시오.
과일에 보호 효과가있는 제품을 평가하기위한 초기 단계를 따르고 녹색 커피 과일 성인을 플라스틱 상자에 방출하십시오. 그런 다음 상자에서 날아 다니는 커피 베리 보어의 수와 녹색 커피 과일을 주입하는 수를 계산하십시오. 배양 후, 통제 된 조건 하에서, 감염 후 20 일째에 해부하고 씨앗과 죽은 곤충을 세고, 커피 베리 보러 감염 후 제품을 평가하기 위해 요약 된 단계를 따르십시오.
녹색 커피 과일에서 벗어나거나 과일에서 날아간 커피 베리 보어의 수를 계산하십시오. 각 처리물을 분무한 후, 조절된 조건하에서 배양하는 단계를 수행하여 실험 단위당 곤충 사망률을 결정한다. 커피 베리 보어에 5 % 및 6 % 살충제를 적용하면 20 일째에 높은 곤충 사망률이 발생했으며 대조군에 비해 상당한 차이를 보였다.
살충제 두 가지를 사용하면 94 %의 건강한 씨앗이 생기고 살충제 하나는 건강한 씨앗의 89 %를 가져 오는 것으로 나타났습니다. 종자의 37%는 대조군에서 감염되지 않았다. 감염 후 제품의 경우, 제품이 곤충 큐티클에 침투하여 곤충 사망률을 유발합니다.
가장 높은 사망률은 살충제 두 개로 발생했습니다. 살충제의 효과는 평가 20 일째에 건강한 감염되지 않은 씨앗의 비율에 반영되었습니다. 감소된 곤충 개체군은 대조군에서 발견된 곤충 개체군과 비교하여 커피 종자 내부에서 발견되었고, 물을 뿌렸다.
엔토모병원체와 방충제 결합 작용으로 종자 피해가 최소화되고 곤충 사망률이 극대화되었습니다. 과일의 감염과 곤충의 소독은 프로토콜 성공을 보장합니다. 이 방법론은 또한 커피 베리 보어에 대한 커피 과일의 내성 또는 내성을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
곤충 저항성 커피 씨앗의 경우 곤충 개체군에 대해서도 부정적인 영향을 관찰 할 수 있습니다. 이 방법론은 다양한 작용 방식을 가진 살충제를 평가하기위한 곤충학뿐만 아니라 과일 / 병원균 상호 작용을 연구하기위한 관용적 인 품종 및 식물 병리학의 평가를위한 식물 육종에도 사용될 수 있습니다.
