Masarimycin은 박테리아 세포 성장을 멈추게하는 박테리아 autolysin의 몇 안되는 억제제 중 하나입니다. 그것은 자기 분해신의 화학적 및 유전 적 불활성화의 차이점을 조사하는 데 사용될 수 있으며, 박테리아 생리학을 연구하기 위해 유전학에 대한 직교 접근법을 제공합니다. 마사리 마이신의 합성은 어려운 것처럼 보일 수 있습니다.
표시된 단계를 자세히 따르십시오. 반응 단계가 효과가 있는지 의심 스러울 때 박층 크로마토그래피와 RF 값의 변화를 확인하십시오. 시작하여, 메탄올 중의 사이클로헥실아민, 사이클로헥실카르복스알데히드, 오르토요오도벤조산, 및 사이클로헥실이소시아나이드의 0.1-몰 용액을 제조하였다.
자기 교반 막대를 첨가한 다음, 뚜껑이 덮인 둥근 바닥 플라스크에 다섯 밀리리터의 시클로헥실아민과 다섯 밀리리터의 시클로헥실카르복스알데히드를 섞고, 플라스크를 섭씨 40도에서 30분 동안 핫플레이트 교반기 상의 모래 욕조에 놓는다. 모래 표면 아래 약 한 센티미터 아래에 놓인 온도계를 사용하여 온도를 모니터링하십시오. 30 분 후, 5 밀리리터의 시클로헥실 이소시아나이드를 용액에 첨가하고 섭씨 50도에서 추가로 20 분 동안 저어줍니다.
이어서, 오르토요오도벤조산 5밀리리터를 반응 혼합물에 첨가하고, 섭씨 55도에서 3 내지 5시간 동안 교반을 계속한다. 세 시간 동안 교반한 후, 대략 한 시간 간격으로 박층 크로마토그래피 또는 TLC에 의해 주기적으로 반응의 진행을 모니터링한다. 0.3과 동일한 보유 계수를 갖는 하나의 스폿만이 TLC 플레이트 상에 보일 때 반응 완료를 고려한다.
용매를 감압 하에서 회전 증발기에서 제거한다. 일단 모든 메탄올이 증발되면, 건조된 조생성물을 30 밀리리터의 에틸 아세테이트에 용해시키고 이를 분리 깔때기로 옮긴다. 에틸 아세테이트를 일몰 염산, 물, 포화 중탄산나트륨 용액, 물 또다시 물 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 추출하고, 각 추출마다 수층을 버린다.
이어서, 분리 깔때기로부터 에틸 아세테이트 층을 제거하고 이를 삼각 플라스크에 수집한다. 무수 황산나트륨으로 가득 찬 주걱을 첨가하여 에틸 아세테이트에서 잔류 물을 제거하십시오. 건조된 에틸아세테이트 용액을 다수 여과지를 통해 여과하여 황산나트륨을 제거하였다.
그런 다음, 여과지를 소량의 에틸 아세테이트로 세척한다. 여과된 에틸아세테이트 용액을 감압 하에서 회전증발기에서 건조시켜 에틸아세테이트가 모두 제거되면 오일로서 마사리마이신을 얻었다. 이소프로판올 용액에 9:1 헥산의 1 내지 2 밀리리터에 마사리마이신 오일을 용해시키고, 전체 화합물이 용해될 때까지 자석 교반 플레이트 상에서 교반한다.
용해된 마사리마이신을 정제하려면 12그램의 정상상 실리카 플래쉬 컬럼으로 플래시 크로마토그래피를 수행하십시오. 플래시 컬럼을 10열 볼륨의 이동상과 분당 15밀리리터의 유속으로 설정된 계측기와 평형을 맞춥니다. 평형화가 완료된 후, 용해된 마사리마이신을 다섯 밀리리터 주사기를 사용하여 그린다.
주사기를 평형 플래시 컬럼의 상단에 직접 연결하고 용액을 컬럼에 주입하십시오. 로드된 컬럼을 플래시 크로마토그래피 시스템에 다시 연결하고 구배 용출을 시작합니다. 컬럼으로부터 마사리마이신을 10:90 헥산의 최종 이동상 농도로 구배 용출을 사용하여 12 컬럼 부피에 걸쳐 이소프로판올로 희석하였다.
230 및 254 나노 미터에서 흡수를 통해 마사리 마이신의 용출을 모니터링하십시오. 형태학 연구를 위해, 섭씨 37도에서 LB 한천 플레이트에 바실러스 서브틸리스 11774를 성장시킨다. 모든 후속 실험에서 600 나노 미터의 광학 밀도가 1에 도달 할 때까지 LB 국물 다섯 밀리리터에서 자란 두 번째 통로 세포를 사용하십시오.
다음으로, 피펫을 사용하여, 표지된 배양 튜브에 마사리마이신을 첨가하여 최종 농도 3.8 마이크로몰로 처리하였다. 표지된 대조군 배양 튜브의 경우, 동등한 부피의 DMSO를 첨가한다. 샘플을 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 150RPM에서 90분 동안 진탕시킨다.
90분 후, 배양물을 1:10 혼합물의 배양 배지에 화학적으로 고정시키고, 밤새 섭씨 4도에서 완충액을 고정시켰다. 다음날 피펫을 사용하여 화학적으로 고정 된 샘플 10 ~ 20 마이크로 리터를 유리 현미경 슬라이드에 적용하고 공기 건조시킵니다. 이어서, 분젠 버너를 사용하여 유리 슬라이드를 가열하여 공기 건조된 샘플을 열고정시킨다.
열 고정 후, 샘플을 0.1 % 메틸렌 블루 100 마이크로 리터로 염색하십시오. 얼룩과 함께 10분간 인큐베이션한 후, 과량의 염료를 증류수로 씻어낸다. 이어서, 염색된 슬라이드를 오븐에서 섭씨 60도까지 15 내지 20분 동안 부드럽게 가열하여 세포를 공통 초점면으로 가져온다.
염색된 샘플을 현미경 커버 슬립 위에 올려 염색된 세포를 밀봉한다. 그런 다음 현미경 슬라이드 시멘트를 사용하여 가장자리를 밀봉하십시오. 밀봉 된 현미경 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미지를 100X 배율로 초점으로 맞 춥니 다.
현미경 슬라이드에 침지 오일 한 방울을 놓고 1000X 배율을 사용하여 시야각에 초점을 맞춥니다. 현미경 및 관련 소프트웨어에 부착 된 카메라를 사용하여 현미경 사진을 획득하십시오. 소프트웨어의 자동 화이트 밸런스 및 조리개 설정을 사용하여 이미지를 획득하십시오.
플래시 크로마토그래피는 고순도의 마사리마이신을 신속하게 정제할 수 있게 해줍니다. S.pneumoniae에서 ATPase 억제제 옵토친과의 상승 또는 길항작용의 평가가 여기에 제시된다. 청색으로 표시된 박테리아 성장을 억제하는 화합물의 최저 농도는 공동 약물의 존재하에서의 최소 억제 농도 값으로 간주된다.
대조적으로, 분홍색의 우물은 박테리아의 성장을 나타냅니다. 최소 억제 농도의 0.75배에서 마사리마이신을 사용한 표현형 검정은 B.subtilis에 대한 소시지 유사 표현형과 S.pneumoniae에 대한 응집형 표현형을 입증하였다. 반응의 온도에주의하십시오.
TLC로 모니터링하여 반응이 완료되었는지 확인하십시오. 이 방법은 현미경으로 세포벽의 변화를 조사하기 위해 형광 표지 항생제와 함께 사용할 수 있습니다.
