מסארימיצין הוא אחד המעכבים הבודדים של אוטוליזין חיידקי שעוצר את צמיחת תאי החיידקים. ניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההבדלים בין אי-פעילות כימית וגנטית של אוטוליזינים, ומספק גישה אורתוגונלית לגנטיקה לחקר הפיזיולוגיה של החיידקים. סינתזה של מסרימיצין עשויה להיראות מרתיעה.
עקוב מקרוב אחר השלבים המוצגים. כאשר יש ספק אם שלב תגובה עבד, אשר על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה ואת השינויים בערכי RF. כדי להתחיל, להכין תמיסה טוחנת 0.1 של ציקלוהקסילאמין, ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד, חומצה אורתו-יודובנזואית, וציקלוהקסיל איזוציאניד במתנול.
לאחר מכן, הוסיפו מוט ערבוב מגנטי, ערבבו חמישה מיליליטרים של ציקלוהקסילאמין וחמישה מיליליטרים של ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד בבקבוקון עגול עם תחתית עגולה והניחו את הבקבוקון באמבט חול על מערבל כיריים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות מדחום הממוקם כסנטימטר אחד מתחת לפני החול. לאחר 30 דקות, מוסיפים חמישה מיליליטרים של ציקלוהקסיל איזוציאניד לתמיסה ומערבבים במשך 20 דקות נוספות ב-50 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיליליטרים של חומצה אורתו-יודובנזואית לתערובת התגובה וממשיכים לערבב ב-55 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש שעות. לאחר שלוש שעות של ערבוב, עקוב אחר התקדמות התגובה מעת לעת על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה, או TLC, במרווחים של כשעה. שקול את התגובה הושלמה כאשר רק נקודה אחת עם גורם שמירה השווה ל- 0.3 נראית על לוח ה- TLC.
הסר את הממס במאייד סיבובי בלחץ מופחת. לאחר שכל המתנול מתאדה, ממיסים את המוצר הגולמי המיובש ב-30 מיליליטרים של אתיל אצטט ומעבירים אותו למשפך מפריד. יש לחלץ אתיל אצטט ברצף עם חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת, מים, תמיסת נתרן ביקרבונט רוויה, מים שוב ותמיסת נתרן כלורי רוויה, תוך השלכת השכבות הימיות בכל מיצוי.
לאחר מכן, הסר את שכבת האתיל אצטט מהמשפך המפריד ואסוף אותה בבקבוקון ארלנמאייר. מוסיפים מרית מלאה בנתרן גופרתי נטול מים נטול מים כדי להסיר את שאריות המים מאתיל אצטט. סנן את תמיסת האתיל אצטט המיובשת דרך נייר סינון מספר אחת כדי להסיר את הנתרן גופרתי.
לאחר מכן, לשטוף את נייר המסנן עם כמות קטנה של אתיל אצטט. תמיסת האתיל אצטט המסוננת התאיידה ליובש על מאייד סיבובי בלחץ מופחת כדי לקבל מסרימיצין כשמן לאחר הסרת כל האתיל אצטט. ממיסים את שמן המסרימיצין במילילטר אחד עד שני מיליליטרים של תמיסת הקסאן 9:1 לאיזופרופנול ומערבבים על צלחת ערבוב מגנטית עד שהתרכובת כולה מומסת.
כדי לטהר את המסרימיצין המומס, בצע כרומטוגרפיית פלאש עם עמודת הבזק סיליקה של 12 גרם, בפאזה רגילה. שיווי משקל את עמודת הפלאש עם 10 נפחי עמודה של פאזה ניידת כאשר המכשירים מוגדרים בקצב זרימה של 15 מיליליטר לדקה. לאחר השלמת שיווי המשקל, ציירו את המסרימיצין המומס באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר.
חבר את המזרק ישירות לראש עמודת הפלאש המשוזנת והזריק את התמיסה לעמודה. חבר מחדש את העמודה הטעונה למערכת כרומטוגרפיית ההבזק והתחל את ההבראה המקדמית. Elute masarimycin מהעמודה באמצעות אלוטיון הדרגתי לריכוז פאזה נייד סופי של 10:90 הקסאן לאיזופרופנול על פני 12 נפחי עמודה.
עקוב אחר התרוממות של מסארימיצין באמצעות ספיגה ב 230 ו 254 ננומטר. עבור מחקר המורפולוגיה, לגדל bacillus subtilis 11774 על לוחות אגר LB ב 37 מעלות צלזיוס. בכל הניסויים הבאים, השתמשו בתאי מעבר שני שגדלו בחמישה מיליליטרים של ציר LB עד שהצפיפות האופטית של 600 ננומטר תגיע ל-1.
לאחר מכן, באמצעות פיפטה, מוסיפים מסארימיצין לצינורות התרבית המסומנים בריכוז סופי של 3.8 מיקרומולים. עבור צינורות תרבית המסומנים בשליטה, הוסף נפח שווה ערך של DMSO. מניחים את הדגימות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות עם רעידות ב-150 סל"ד.
לאחר 90 דקות, מקבעים כימית את התרביות בתערובת של 1:10 של מדיית תרביות ותיקון חיץ בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, השתמשו בפיפטה כדי למרוח 10 עד 20 מיקרוליטרים של הדגימות הקבועות כימית על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית ולאפשר להן להתייבש באוויר. לאחר מכן, תקן בחום את דגימות האוויר המיובשות על ידי חימום מגלשות הזכוכית באמצעות מבער Bunsen.
לאחר תיקון חום, הכתימו את הדגימות ב-100 מיקרוליטרים של 0.1% מתילן כחול. לאחר דגירה של 10 דקות עם הכתם, שטפו את הצבע העודף במים מזוקקים. לאחר מכן, מחממים בעדינות את המגלשות המוכתמות ל-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 15 עד 20 דקות כדי להביא את התאים למישור מוקד משותף.
אטמו את הדגימות המוכתמות על ידי הנחת כיסוי מיקרוסקופ החלקה על התאים המוכתמים. לאחר מכן, אטמו את הקצוות באמצעות מלט החלקה במיקרוסקופ. הניחו את שקופית המיקרוסקופ האטומה על במת המיקרוסקופ והביאו את התמונה לפוקוס בהגדלה של פי 100 באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
הניחו טיפה של שמן טבילה על שקופית המיקרוסקופ והביאו את שדה הראייה למיקוד באמצעות הגדלה של 1000X. רכשו מיקרוגרפים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ ולתוכנה הנלווית אליו. השג תמונות באמצעות הגדרות האיזון הלבן האוטומטי ומפתח הצמצם של התוכנה.
כרומטוגרפיית פלאש מאפשרת טיהור מהיר של מסארימיצין עם טוהר גבוה. הערכה של סינרגיה או אנטגוניזם עם מעכב ATPase אופטוצ'ין ב- S.pneumoniae מוצגת כאן. הריכוז הנמוך ביותר של התרכובת לעיכוב צמיחת חיידקים, המסומן על ידי הצבע הכחול, נחשב לערך הריכוז המעכב המינימלי בנוכחות תרופה משותפת.
לעומת זאת, בארות עם צבע ורוד מצביעות על צמיחת חיידקים. מבחנים פנוטיפיים שהשתמשו במסארימיצין בריכוזים מעכבים מינימליים של פי 0.75 הדגימו פנוטיפ דמוי נקניק עבור B.subtilis ופנוטיפ מגושם עבור S.pneumoniae. שימו לב לטמפרטורה של התגובה.
ודא שהתגובה הושלמה על ידי ניטור באמצעות TLC. ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם אנטיביוטיקה עם תווית פלואורסצנטית כדי לחקור שינויים בדופן התא על ידי מיקרוסקופיה.
