이 프로토콜의 목표는 반표적 UPLC-MS/MS 방법으로 혈장에서 페놀 대사 산물을 검출하는 것입니다. 혈장 단백질을 에탄올로 침전시키고, 샘플을 농축하고, UPLC 장비에 주입하기 전에 이동상으로 재현탁시켰다. 화합물은 실험실에서 조립 된 반 표적 라이브러리를 사용하여 대사체학, 소프트웨어 및 다른 무료 온라인 데이터베이스에 대한 PCDL 관리자를 사용하여 확인되었습니다.
우리는 머핀과 브로시뮴 알리 캐스트럼 종자 가루로 공식화 된 음료로 영양 개입을 시행했습니다. 개입이 끝나면 참가자의 영양 및 유육종 상태가 개선되고 혈장의 총 페놀 함량이 증가했습니다. 그러나 우리는 어떤 페놀 화합물이 흡수되어 긍정적 인 효과에 기여했는지 확인해야합니다.
이러한 항산화제가 풍부한 식품의 섭취 후 흡수되는 페놀계 화합물의 동정 및 정량화는 어려운 과제이지만, 이러한 파이토케미컬의 생물학적 활성을 입증하기 위해서는 반드시 필요하다. 대부분의 페놀 성분의 생체 이용률은 낮으며, 또한 5 % 미만이 플라즈마로의 구조적 변형없이 들어갑니다. 대부분은 메틸화, 설폰화 또는 글루쿠로니데이션과 같은 몇 가지 생물 변형을 거칩니다.
광범위한 연구에서 UPLC-MS 및 UPLC-MS / MS에 의해 생체 유체에서 가장 흔한 대사 산물을 확인했습니다. 그러나, 박테리아 대사 산물의 상당 부분은 그들의 완전한 정보를 포함하는 데이터베이스의 부족에보고되지 않는다. 대사 산물 식별은 대사 산물 표준의 비용과 상업적 가용성으로 인해 복잡합니다.
따라서, 최선의 전략은 비표적화 또는 반표적화 MS/MS 대사산물 분석일 수 있다. 이 분석은 분자 특징 정보, 질량 대 전하 비율 단동위원소 정확한 질량, 동위원소 분포 및 단편화 패턴의 사용에 의존합니다. 화학적 동일성을 확인하고 폴리페놀이 풍부한 식단을 섭취 한 후 생체 유체에서 확인 된 폴리 페놀 대사 산물을 포함하는 무료 온라인 데이터베이스와 비교하십시오.
본 연구에서, 우리는 영양 개입에 관여하는 노인 그룹의 혈장 샘플을 분석하기 위해 반 표적 UPLC-MS/MS 방법을 개발했습니다. 분석될 때까지 혈장 샘플을 영하 80도에 저장합니다. 플라즈마 샘플을 실온에서 15분 동안 또는 섭씨 37도에서 5분 동안 해동시킨다.
200 마이크로리터의 혈장 샘플을 2 밀리미터 마이크로튜브에 넣고 1000 마이크로리터의 순수한 에탄올과 혼합하십시오. 30초 동안 소용돌이 플라즈마 샘플. 샘플을 6, 580 원심력에서 5분 동안 원심분리한다.
원심분리 후, 마이크로피펫 또는 파스퇴르 피펫으로 상층액을 수집하여 새로운 마이크로튜브에 넣는다. 상청액을 예약하십시오. 펠렛을 1000 마이크로리터의 순수한 에탄올, 꼭짓점과 30초 동안 혼합한 다음, 동일한 조건에서 원심분리한다.
상청액을 수집하고 첫 번째 상청액과 혼합하십시오. 135 psi에서 순수한 질소를 사용하여 샘플로부터 에탄올을 제거한다. 바늘을 마이크로튜브 상단에서 한 센티미터 떨어진 곳에 두어 시료 손실을 방지하고 시료가 건조될 때까지 플러시합니다.
건조 샘플을 100 마이크로리터의 재현탁시키는 것은 아세토니트릴과 물을 한 번 혼합하는 것이다. 45 마이크로나일론 주사기 멤브레인을 통해 HPLC 바이알 마이크로 인서트에 직접 여과하여 C18 역상 컬럼이 장착된 UPLC에 3마이크로리터의 샘플을 주입한다. 자동 시료 주입기 온도를 섭씨 20도로, 열 온도 조절기를 섭씨 25도로 설정합니다.
각 샘플을 세 배로 주입하십시오. 물에 0.1%포름산을 용매 A로 사용하고, 용매 B로 100%아세토니트릴을 사용하고, 유속을 분당 0.4mm로 설정하고 다음과 같이 구배 프로그램을 하고, 0~1분 10%B, 1~4분 30%B, 4~6분 38%B, 6~8분 60%B, 8~8.5분 60%B, 8.5 ~ 9분 10%B. 질량분석기를 음의 이온화 모드로 설정합니다.
질소를 섭씨 300 °C의 건조 가스로 사용하고 분당 13 리터의 유량으로 사용하십시오. 분무기 압력을 30 psi로 설정하십시오. 모세관 전압을 4V, 000V, 단편기 전압을 175V, 스키머 전압을 65V로 설정합니다.
100 ~ 1100 m/z 사이의 질량을 스캔하고 질량 분광을 위해 50 ~ 1000 m/z 사이의 질량을 스캔합니다. 데이터 수집을 자동 MS/MS 모드로 설정합니다. 다음 참조 질량 119.036 및 966.0007을 사용합니다.
페놀 화합물, 페놀 대사 산물 및 과학 문헌에서 관심있는 다른 화합물을 검색하십시오. UPLC 시스템에 포함된 데이터베이스 관리 소프트웨어를 엽니다. 파일을 선택한 다음 새 개인 데이터베이스 복합 라이브러리인 PCDL을 선택합니다.
그런 다음 선택하여 새 PCDL을 만듭니다. PCDL LC/MS 대사체학의 유형을 선택합니다. PCDL의 이름을 설정합니다.
그런 다음 만들기를 선택합니다. 도구 모음에서 PCDL을 선택한 다음 편집 허용 옵션을 선택합니다. 그런 다음 컴파운드 찾기 버튼을 클릭합니다.
화합물은 두 가지 방법으로 개인 라이브러리에 추가 할 수 있으며, 먼저 악기의 일반 라이브러리에서 복사하여 추가 할 수 있습니다. 이렇게 하려면 지금까지 데이터 관리에 포함된 계측기 기존 데이터베이스를 엽니다. 화합물 찾기 버튼을 클릭합니다.
단일 검색 옵션에서 복합 검색 조건을 입력하여 관심 있는 화합물을 찾습니다. 화합물 결과 표에서 관심 있는 화합물을 선택합니다. 둘 이상의 화합물을 선택하려면 첫 번째 화합물을 클릭한 다음 Ctrl 키를 누른 채 관심 있는 각 화합물을 클릭합니다.
그런 다음 강조 표시된 모든 화합물을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 PCDL에 추가를 선택하십시오. 새 창에서 특수 개인 데이터베이스 파일을 검색하고 선택합니다. 존재하는 경우 화합물에 대한 스펙트럼을 포함하는 박스를 표시하십시오.
추가 단추를 클릭합니다. 새 대화 상자에서 예를 선택하여 추가된 새 화합물을 확인합니다. 아니요를 선택하여 더 많은 관심 화합물을 계속 검색합니다.
둘째, 새로운 화합물은 기기의 일반 라이브러리에서 사용할 수없는 경우 수동으로 추가 할 수 있습니다. 이 개방을 위해 특수 개인 데이터베이스. 일단 열리면 PCDL을 선택한 다음 편집 허용 옵션을 선택하십시오.
컴파운드 편집 옵션을 선택합니다. 새로 추가 단추를 클릭합니다. 창의 위쪽 섹션에서 새 화합물의 정보를 완성합니다.
수식, 이름, IUPAC 이름, CAS 번호, Chemspider ID 및 기타 식별자를 입력합니다. 무료 온라인 라이브러리, Chemspider, PubChem 및 Phenol Explorer에서 사용할 수있는 정보를 사용하여 관심있는 새로운 화합물의 정보를 입력하십시오. 완료되면 새 것으로 저장 버튼을 클릭하여 새 복합 정보를 특수 개인 데이터베이스에 저장하십시오.
관심있는 모든 화합물로 프로세스를 반복하여 특수 개인 데이터베이스를 완성하십시오. 장비의 정성적 관리자 소프트웨어를 사용하여 페놀 화합물과 페놀 대사 산물을 식별하십시오. 샘플 파일을 엽니다.
크로마토그램 패널에서 크로마토그램 정의를 선택하고 총 이온 크로마토그램 TIC, MS EIC의 이온 크로마토그램 및 MS/MS의 EIC를 추출합니다. 통합 크로마토그램 옵션을 선택합니다. 화합물 찾기 패널에서 수식 옵션으로 찾기를 선택합니다.
새 창에서 수식 원본을 선택한 다음 데이터베이스 슬래시 라이브러리 옵션을 선택합니다. 이전에 만든 개인 데이터베이스를 찾아 열기를 클릭하십시오. 수식 일치 옵션을 선택하고 백만 ppm당 다섯 부품의 질량 일치 공차를 설정합니다.
음이온 옵션을 선택하고 마이너스 H 대화상자만 선택합니다. 결과 옵션에서 추출 EIC를 표시하고, 정리된 스펙트럼을 추출하고, 원시 스펙트럼을 추출하고, 구조화된 대화 상자를 포함합니다. 결과 필터 옵션을 선택합니다.
점수가 있으면 경고 한 다음 점수 일치를 80 %로 설정 한 다음 점수가 일치하면 마크가 일치하지 않음을 표시하고 점수를 75 %로 설정 한 다음 수식으로 찾기 화합물을 클릭하여 샘플에서 관심있는 화합물을 식별하십시오. 혈장 샘플의 반표적 UPLC MS/MS 분석을 통해 페놀 대사산물을 확인하기 위한 단계별 공정은 다음 그림에 나와 있습니다. 먼저, 총 이온-크로마토그램은 무료 온라인 데이터베이스로부터 얻은 645개의 페놀계 화합물 및 그의 대사산물을 포함하는 자체 생성된 PCDL 데이터베이스를 사용하여 수득되었다.
다음에, 추출된 이온-크로마토그램 및 단편화 패턴, 또는 이온을 다섯 ppm 질량 미만으로, 정합 공차가 얻어졌다. 마지막으로, 검출된 피크의 동위원소 분포를 이론적 화합물의 동위원소 분포와 비교하였다. 이 분석으로부터, 총 25개의 페놀계 화합물 및 대사산물이 혈장 샘플에서 확인되었다.
흡수 페놀 화합물 또는 그의 대사 산물의 확인에서 설계 방법의 효과를 평가하기 위해, 30 일 개입 전후에 얻은 연구 참가자의 다섯 가지 샘플을 분석했다. 각 화합물의 상대적 풍부도는 처리 후 곡선 아래의 면적을 처리 전 AUC로 나누어 계산하였다. 표 네 개는 브로슘 알리카스트럼 가루 함유 식품의 30일 섭취 후 혈장의 증가를 보인 12개의 페놀 화합물 목록을 나타낸 것이다.
페닐아세트산은 단지 대사산물만이 치료 후 더 높은 농도에서 일관되게 발견되었다. 글리시틴, 글리코실화 이소플라본, 및 세 개의 하이드록시페닐발레르산은 다섯 개의 샘플 중 세 개에서 증가했지만, 나머지 두 샘플에서는 감소하였다. 리그난인 고미신 M2는 영양 개입 후에만 다섯 개의 샘플 중 세 개에서 검출되었다.
다른 페놀계 화합물 및 대사산물은 오직 하나의 샘플에서만 그리고 처리 후에서만 발견되었다. 본 논문에서 개발된 방법은 대부분의 부분에서 그것이 창조된 목적에 매우 적합하다는 것을 보여준다. 치료 당 샘플은 간단하고 효과적이었습니다.
UPLC 분리 및 페놀 대사 산물의 반표적화 MS/MS 동정이 달성되었다.
