이 프로토콜은 특정 질병 상태의 살아있는 세포에서 분자 수준에서 염증성 카스파제 경로를 시각화하고 심문하는데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 이 기술의 주요 이점은 원발성 면역 세포에서 염증성 카스파제 활성화 복합체의 성분, 요건 및 국소화를 확인하는데 사용될 수 있다는 것이다. 사소한 최적화를 통해이 방법은 다른 일차 세포 및 올리고 머화에 의해 활성화 된 다양한 단백질에 적응할 수 있으며 그 적용 가능성은 현미경 방법론에 국한되지 않습니다.
먼저, 완전히 분화된 대식세포로부터 배지를 10센티미터 접시에 흡인하고, 따뜻한 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포 단층을 세척하여 모든 배지를 완전히 제거한다. 10 센티미터 접시 당 0.25 % 따뜻한 트립신-EDTA 용액 2 밀리리터를 첨가하여 세포를 수확하십시오. 트립신-EDTA를 P-1000 마이크로피펫으로 접시 전체에 걸쳐 위아래로 부드럽게 피펫한 다음, 현탁액을 5밀리리터의 따뜻한 완전한 배양 배지가 들어있는 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
밝은 현장 현미경으로 세포 분리가 있는지 확인하고 필요한 경우 다시 분리하십시오. 배지를 흡인하고, 세포를 섭씨 37도까지 미리 가온된 1X 멸균 PBS의 10 밀리리터에 재현탁시킨다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포 수를 결정하기 위해 20 마이크로 리터 분취량을 취하십시오.
형질감염 당 다섯 번째 세포에 10 ~ 두 번 복용하여 15 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 미리 예열된 1X 멸균 PBS로 15 밀리리터의 최종 부피로 가져 오십시오. PBS를 흡인하고 250 x g에서 1분 동안 한 번 더 원심분리한다.
P-200 마이크로피펫을 사용하여 세포 펠릿으로부터 임의의 잔류 PBS를 제거하였다. 형질감염 당 1.5밀리리터 멸균 마이크로튜브를 취하고, 적절한 리포터 플라스미드 및 카스파제 BiFC 플라스미드를 후드에 첨가한다. 피펫 스테이션, 장치, 팁, 전기 천공 튜브 및 피펫을 멸균 층류 후드에 놓습니다.
핵 형성 장치를 연결하고 켭니다. 표시된 시작 화면에 transection 매개 변수를 입력합니다. 전압을 누르고 1000을 입력 한 다음 완료를 눌러 1000V로 설정하십시오.
Width를 누르고 40을 입력한 다음 Done을 눌러 펄스를 40밀리초로 설정합니다. 마지막으로 펄스를 누르고 2를 입력 한 다음 완료를 눌러 전기 펄스 수를 2로 설정하십시오. 전기 천공 튜브 중 하나를 가져 와서 실온에서 세 밀리리터의 전해 버퍼 E로 채 웁니다.
전기 천공 튜브를 피펫 스테이션의 피펫 홀더에 삽입하여 튜브 측면의 전극이 안쪽을 향하고 튜브를 삽입할 때 클릭 소리가 들리도록 합니다. 세포 펠릿을 취하고, 다섯 번째 세포에 각각 10 내지 2회 동안 10 마이크로리터의 미리 가온된 재현탁 R 완충액을 첨가하고, P-20 마이크로피펫으로 부드럽게 혼합한다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 각 형질감염 튜브에 첨가하고 P-20 마이크로피펫으로 부드럽게 혼합한다.
푸시 버튼을 두 번째 스톱으로 눌러 팁을 피펫에 삽입하여 클램프가 팁에 있는 피스톤의 장착 스템을 완전히 집어 들도록 합니다. 다음으로, 피펫의 푸시 버튼을 첫 번째 정지로 누르고 세포 또는 플라스미드 DNA 혼합물을 함유하는 첫 번째 튜브에 담그고 샘플을 흡인시킨다. 샘플이 있는 피펫을 피펫 홀더에 매우 조심스럽게 삽입하여 피펫이 딸깍 소리가 나고 적절하게 배치되도록 합니다.
터치 스크린에서 시작을 누르고 전기 펄스가 전달될 때까지 기다립니다. 역에서 피펫을 천천히 제거하고, 첫 번째 정지에 푸시 버튼을 천천히 눌러 미리 가온된 항생제가 없는 배지와 함께 상응하는 웰에 횡단된 세포 현탁액을 즉시 첨가한다. 형질화된 세포로 플레이트를 부드럽게 락하고 가습된 조직 배양 배양기에서 한세 시간 동안 배양한 다음, 200 마이크로리터의 미리 가온된 배양 배지를 각 웰에 첨가한다.
접시를 인큐베이터에 놓고 유전자 발현을 위해 적어도 24 시간을 허용하십시오. 다음날, 에피형광 현미경을 이용하여 세포 생존율 및 형질감염 효율을 검사한다. P-1000 마이크로피펫으로 세포에서 배지를 조심스럽게 제거하고 500 마이크로리터의 자극 용액을 웰 옆으로 떨어뜨립니다.
처리되지 않은 제어 웰을 실행하려면 자극이 없는 이미징 배지를 추가합니다. epifluorescence 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포를 시각화하려면 지침에 따라 현미경과 형광 광원을 켭니다. 10 배 또는 20 번 목표를 선택하고 배양 접시를 현미경 단계에 놓습니다.
아이피스가 있는 568나노미터 필터 아래에서 세포를 찾습니다. 그리고 리포터 적혈구를 발현하는 세포에 초점을 맞춘다. 시각적 필드의 모든 빨간색 셀을 계산합니다.
동일한 시각적 필드에 있는 동안 488 또는 512 필터로 변경하면 빨간색 셀 수가 녹색이기도 합니다. 최소 세 개의 필드로 구성된 최소 100개의 빨간색 셀을 계산합니다. 시야당 금성 양성 형질도입 세포의 백분율을 계산하고, 표준 편차를 얻기 위해 각 치료 웰에 대한 결과 백분율을 평균화한다.
후광성 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하려면 카메라에 의해 획득 된 것처럼 컴퓨터 화면에서 세포의 라이브 이미지를 시각화하십시오. 조이스틱 컨트롤과 포커스 휠을 사용하여 셀의 초점과 위치를 미세 조정합니다. 512 나노미터 또는 488 나노미터 및 568 나노미터 레이저에 대한 백분율 레이저 전력 및 노출 시간을 설정하여 이미지의 신호가 채도 없이 양호하게 보이도록 합니다.
라이브 캡처를 켜고 결과 이미지를 검사하여 두 채널의 디스플레이 히스토그램에서 각 층에 대해 뚜렷한 피크가 표시되는지 확인합니다. 세포의 라이브 이미지를 시각화하면서, 플레이트의 각 웰에 대해 mCherry 또는 dsRedmito 리포터를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 필드의 다수의 대표적인 이미지를 취한다. 7일 동안 GM-CSF와 함께 배양된 선택된 CD-14 양성 단핵구는 분화 기간 동안 세포 형태학의 변화를 나타냈으며, 구형 현탁액 세포로부터 스핀드되고 완전히 부착되고, 마지막으로 완전히 분화되었을 때 더 많은 확산 세포로 이동하였다.
완전히 분화된 세포를 리포터 플라스미드 dsRedmito와 함께 카스파제 BiFC 쌍 VC 및 VN으로 형질감염시키고, 이를 트랜스펙트된 세포를 표지하는데 사용하였다. 처리되지 않은 세포는 금성 형광을 나타내지 않았다. 니게리신 처리된 세포에서, 카스파제-1 BiFC는 ASC 스펙크의 전형적인 형태를 갖는 단일 누점으로 나타났다.
금성 양성 MDM의 정량화는 카스파제-1 BiFC의 가장 높은 비율이 LPS 플러스 니제리신 처리군에서 보여지는 것으로 나타났다. 카스파제-1, 4, 및 5개의 pro-BiFC 쌍의 플라스미드 적정에서, 금성-양성 세포의 가장 높은 비율은 각각 400, 500 및 1, 000 나노그램의 형질감염된 플라스미드로부터 유래하였다. 횡단 후 24시간 동안 세포 필드의 20배 객관적으로 얻어진 공초점 이미지는 미토콘드리아가 손상되지 않은 상태로 처리되지 않은 형질화된 세포가 생존 가능하다는 것을 보여주었다.
헴으로 치료 한 후, 카스파제-1 복합체는 니게리신에 의해 유도 된 것과 유사한 단일 녹색 누점으로 나타납니다. 분화, 형질감염 및 치료 동안 세포의 가혹한 조건과 과도한 조작을 피해야 자발적 활성화와 높은 배경 수준의 카스파제 활성화를 초래할 수 있으므로 주의해야 합니다.
