우리는 모든 이전 멤버 Bouchier 헤이즈 연구소의이 기술 개발에 기여를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 LBH 텍사스 아동 병원 소아 파일럿 수상에 의해 부분적으로 투자 되었다. 우리는 그녀의 팀과 함께 공동에서 출판 된 데이터를 포함 하는 허가 Joya 찬드라 (MD 앤더슨, 휴스턴, 텍사스) 감사 합니다. NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123, 및 NCRR S10RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 원조 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 설명 하는 시 약의 개발 지원

1입니다. 셀 및 문화 요리 준비
참고: 조직 문화 층 류 두건에 1-3 단계를 수행 합니다. 장갑을 착용 한다.
<ol><li>경우 유리 하단 요리에 사용 하 여, fibronectin 함께 유리 코트. 플라스틱 접시를 사용 하 여 경우 1.2 단계를 건너뜁니다.<ol>
<li>Fibronectin의 0.1 mg/mL 해결책 확인: 1 X PBS의 9 mL에 1 mg/mL fibronectin 솔루션의 1 mL를 희석.</li>
		<li>0.5-1 각의 유리 하단 커버 fibronectin mL 및 실 온에서 1-5 분 동안 품 어.</li>
		<li>Fibronectin 솔루션을 수집 하 고 4 ° c.에서 저장 한 피 펫을 사용 하 여, 참고: fibronectin 솔루션 여러 번 다시 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>일단 1-2 mL 1 X PBS 가진 유리를 세척 하 고 PBS에서 발음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플레이트 1 x 105 셀 해당 셀의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 당 문화 미디어 (다른 크기의 웰 스에 대 한 사용 하 여 셀 번호 표 1 참조). 셀 라인을 안정적으로 표현 하는 caspase BiFC 구성 요소 (내용 참조)를 사용 하 여 2 x 105 셀 접시 하 고 치료 단계 (3 단계)를 진행 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 접시에 셀 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포의 transfection caspase BiFC 구성 요소를 소개 하
<ol><li>적절 한 transfection 시 셀 transfect 참고:이 프로토콜은 최소한의 독성에 대 한 최적화 된 Lipofectamine 2000에 대 한 지침을 설명 합니다. 이 프로토콜은 Hela 세포 MCF7 세포, LN18 세포에 성공적으로 사용 되었습니다. 추가 사용 하는 경우 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 하 고 필요에 따라 최적화.<ol>
<li>무 균 튜브에 감소 된 혈 청 미디어의 750 µ L를 transfection 시 약의 12 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>10 추가 기자 플라스 미드 (형광 단백질, 예를 들어 빨간색 형광 단백질 [RFP], transfected 세포 레이블을 것입니다 인코딩 플라스)의 ng 페 수를 각 잘 살 균 1.5 mL 튜브에.</li>
		<li>20 추가 각 caspase BiFC 플라스 미드의 ng (예를 들어, 20 caspase-2 prodomain [C2 프로]의 ng-VC 및 20 ng C2 프로-VN의) 각 관 (표 2).</li>
		<li>감소 된 혈 청 미디어를 추가 하 여 100 µ L의 총 볼륨까지 각 튜브를가지고.</li>
		<li>P200 피 펫을 사용 하 여 추가 transfection 시 약 해결책의 100 µ L 단계 2.1.2에서에서 플라스 미드 혼합물에 dropwise 방식.</li>
		<li>실 온에서 20 분에 대 한 플라스 미드 transfection 시 믹스를 품 어.</li>
		<li>미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 혈 청 자유로운 미디어의 800 µ L 플라스틱 p1000 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>P200 피 펫을 사용 하 여, 각 잘에 dropwise DNA-지질 복합체의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>셀 3 h에 대 한 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 품 어.</li>
		<li>단층을 방해 하지 않도록 주의 복용는 피 펫 또는 포부 흡입을 사용 하 여 DNA 지질 복합물을 포함 하는 혈 청 무료 미디어를 제거.</li>
		<li>각의 측면 아래로 부드럽게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 완전 한 성장 매체의 2 mL 플라스틱</li>
	</ol>
</li>
	<li>최적의 단백질 표정을 위한 24-48 h에 대 한 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
</ol>3입니다. caspase 활성화 유도
<ol><li>약물 또는 caspase 활성화 약 24 h 후 transfection 유도 자극으로 치료.<ol>
<li>원하는 농도의 약물을 미리 예 열 (37 ° C) 이미징 미디어 (완전 한 성장 매체 보충 Hepes [20 m m, pH 7.2-7.5]와 2-mercaptoethanol [55 μ M])와 섞어 부드럽게 추가 (표 3).</li>
		<li>미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 3.1.1에서 솔루션의 2 mL 플라스틱을 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>치료 컨트롤 한 잘에 약물 없이 영상 미디어를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 셀을 품 어 또는 단계 4.3 시간 경과 실험에 대 한 진행.</li>
</ol>4입니다. Caspase BiFC 데이터 수집
<ol><li>
한 번 포인트 획득을 위한 Caspase BiFC
	<ol>
<li>현미경 및 형광 광원 제조업체의 지침에 따라 설정.</li>
		<li>RFP 필터 및 리포터 유전자 형광에 초점에서 세포를 찾아.</li>
		<li>손을-집계 카운터를 사용 하 여 시야에 RFP 긍정적인 세포의 모든 계산. 수를 기록 합니다.</li>
		<li>같은 시야를 유지 하면서는 GFP (YFP 필터 또는 사용 가능한 경우)로 전환 하 고, 녹색은 또한 적혈구의 수를 세 손을 집계 카운터를 사용 하 여 (금성 양성). 레드 셀만 금성 양성에 대 한 평가 되도록 두 필터 간에 앞뒤로 전환 합니다. (그림 3) 번호를 기록 합니다.</li>
		<li>각 접시의 세 가지 개별 영역에서 적어도 100 RFP 긍정적인 세포를 계산 합니다.</li>
		<li>각 지역에서 금성-긍정적인 transfected 세포 (즉, 레드 셀 또한 녹색)의 비율을 계산 합니다. 평균 표준 편차를 결과 백분율.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC의 3-차원 영상
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 현미경 켜고 수집 소프트웨어 시작.</li>
		<li>60 x 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치</li>
		<li>올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>Using epifluorescence 광원 및 현미경 눈 조각 또는 confocal 레이저와 컴퓨터 화면, 관심 분야를 탐색 합니다.</li>
		<li>RFP 레이저 또는 필터를 사용 하 여 기자 형광에 초점.</li>
		<li>이 시점까지 epifluorescence를 사용 하는 경우 confocal 레이저 광원 전환 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.</li>
		<li>조이스틱 제어 및 초점 휠 using, 미세 조정 초점 및 셀의 위치는 셀 뷰 파인더의 중앙에. 서로에서 분리 되어 하 고 중복 되지 셀을 선택 합니다.</li>
		<li>실험에 사용할 최적의 설정을 결정 하는 출발점으로 비너스와 RFP에 대 한 입력 100 ms에 노출 시간을 50% 비율 레이저 파워.</li>
		<li>결과 이미지와 함께 디스플레이 히스토그램 두 채널에 대 한 검사 및 라이브 캡처를 켭니다.</li>
		<li>신호는 낮은 경우 이미지 만들 어렵다 증가 이미지에서 신호까지 증가 백분율 레이저 파워 및 노출 시간 좋아 보인다.</li>
		<li>신호 포화를 도달 하지 않는 확인 하십시오. 뚜렷한 피크는 각 형 석에 대 한 표시 되도록 디스플레이 히스토그램을 검사 합니다. 피크 포함 전체 히스토그램 표시, 경우 낮은 레이저 전원 및 노출 설정 (그림 2)를 입력 합니다.</li>
		<li>신호가 특정 되도록 동일한 조건 하에서 제어 (치료 비 페) 세포를 시각화 합니다. 참고: 단일 색상 transfectants 사용할 수 있습니다 또한 제어 크로스 오버, 그러나 신호는 고유 공간 (예: cytosolic 대 미토 콘 드리 아) 하는 경우이 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>선택 하거나 현미경 소프트웨어에서 Z 스택 모듈을 엽니다.</li>
		<li>초점 손잡이 사용 하 여 대략적인 해당 하는 셀의 중심 초점 위치.</li>
		<li>셀이 더 이상 표시 될 때까지 한 방향으로 초점을 조정, 최고 위치이 옵션을 선택 합니다.</li>
		<li>셀이 더 이상 다시 표시 될 때까지 반대 방향으로 초점을 조정 하 고 선택이 하단에 위치 합니다.</li>
		<li>최적의 스텝 크기 (일반적으로 약 20 µ m)을 선택 하 고 자동으로 각 위쪽 및 아래쪽 위치 사이 20 µ m 단계에서 각 채널에 단일 이미지를 데리고 카메라에 수집을 시작 합니다.</li>
		<li>3D 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 3D 이미지 (그림 4영화 1) 재구성.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC의 시간 경과 영상
	<ol>
<li>실험 전에 적어도 1 시간 현미경 켜고 설정 온도 37 ° c</li>
		<li>40 x 60 x, 또는 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치.</li>
		<li>올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>CO2 소스를 사용할 수 있는 접시 홀더 위에 CO2 배달 장치 (일반적으로 CO2를 제공 하는 튜브에 부착 된 플 렉 시 유리 뚜껑)를 배치 합니다. 5% CO2 수준을 설정 하 고 소프트웨어에서 CO2 컨트롤러를 켭니다. CO2 소스를 사용할 수 없는 경우 20 mM Hepes 미디어 버퍼를 포함 합니다.</li>
		<li>이동 transfected 세포 분야 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 RFP 레이저를 사용 하 여 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.</li>
		<li>다음 단계 4.2.8-4.2.12, RFP 레이저에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 합니다. 가능한 한 낮은 형광 신호를 감지할 수 이러한 값을 유지.</li>
		<li>긍정적인 통제를 사용 하 여 샘플 (예제 표 3 참조 하십시오), 따라 YFP 레이저 빛에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 하려면 단계 4.2.8-4.2.12. 가능한 한 낮은 아직도 금성 신호를 감지할 수 있는 동안 이러한 값을 유지.</li>
		<li>접시의 각 음에 대 한 다양 한 기자를 표현 하는 하나 이상의 셀을 포함 하는 다른 위치를 선택 합니다.</li>
		<li>촬영 프레임의 시간 경과 및 총 수의 각 프레임 사이의 시간 간격을 입력 합니다. 확인 시간 전에 다음 프레임은 받을 것 이다 모든 선택한 위치를 얻으려고 합니다.</li>
		<li>각 위치를 다시 방문 하 고 수정 하 고 필요에 따라 초점을 업데이트.</li>
		<li>온도 또는 외부 진동의 변화에서 발생할 수 있는 초점 드리프트를 수정 하려면 초점 드리프트 보정 시스템 (사용 가능한 경우)를 켭니다.</li>
		<li>시간 시작 하 고 데이터를 저장.</li>
		<li>(그림 5영화 2) 사용할 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜 caspase 유도 근접 측정을 분할 형광 단백질의 사용을 설명 합니다. 때문에 매우 밝은, 높은 photostable는 refolding 이며 빠른 13분할 금성이이 기술을 위해 선택 되었다. 따라서, caspase 유도 근접 시 refolding 비너스의 분석은 caspase 단백질 상호 작용 역동성의 실시간 의견 가까이 제공할 수 있습니다. 금성 금성 (비너스-N 또는 VN) 구성 아미노산 1-173의 N terminus 두 약간 겹치는 ?...

Caspase 프로 테아 제 가족은 apoptosis와 타고 난 면제 1에 그들의 중요 한 역할에 대 한 알려져 있다. 그들의 중요성 때문에 결정 언제, 어디서, 그리고 어떻게 효율적으로 특정 caspases 활성화 활성화 경로 caspase의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 이미징 기반된 프로토콜 caspase 활성화 폭포의 가장 이른 단계 시각화 수 있습니다. 이 기술은 활용 동적 단백질: 단백질 상호 작용의 그 드라이브 caspase 활성화.
Caspases는 두 그룹으로 분할 될 수 있다: 초기자 caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, 및-12)와 사형 집행 caspases (caspase 3-6과-7). 사형 집행 caspases 미리 형성한 이합체로 셀에 존재 하 고 크고 작은 소 단위 2사이 분열에 의해 활성화 됩니다. 활성화 되 면, 그들은 apoptosis 3의 결과로 수많은 구조 및 규제 단백질을 쪼개 다. 초기자 caspases는 통로에서 활성화 될 및 일반적으로 사형 집행 caspases의 활성화를 방 아 쇠를 첫 번째 caspases. 사형 집행 caspases, 달리 초기자 caspases 이합체 화 4,5에 의해 활성화 됩니다. 이 이합체 화 활성화 플랫폼으로 알려진 특정 큰 분자량 단지를 비활성 단위체의 채용에 의해 촉진 된다. 정품 인증 플랫폼의 특정 단백질: 단백질 상호 작용의 일련에 의해 규율 됩니다. 이러한 보존된 단백질 상호 작용 주제 시작자 caspase의 proform에 의해 중재 되 고 죽음 도메인 (DD), 죽음 이펙터 도메인 (DED) 및 caspase 신규 모집 도메인 (카드) 6 (그림 1A)를 포함 합니다. 정품 인증 플랫폼은 일반적으로 수용 체 단백질과 접합 기 단백질을 포함. 수용 체는 일반적으로 수많은 분자의 oligomerization 수 있도록 구조적 변화를 유도 한 ligand의 바인딩 시 활성화 됩니다. 수용 체 다음 중 채용 caspase 직접 또는 어댑터 분자는 차례로 caspase는 복잡 합니다. 따라서, 수많은 caspase 분자 이합체 화를 허용 하는 가까이에 서. 이 유도 근접 모델 7이라고 합니다. 일단, dimerized는 caspase autoprocessing 활성 효소 4,8을 안정화 하는 역할을 겪 습. 예를 들어 Apaf1 apoptosome의 시 토 크롬 c 미토 콘 드리 아 외 막 permeabilization (MOMP) 라는 프로세스에서 미토 콘 드리 아에서 출시를 다음에 의해 트리거됩니다. Apaf1는 차례로 caspase-9 카드 두 단백질 9에 의해 중재 되는 상호 작용을 통해 보충 한다. CD95 죽음의 복잡 한 신호 유도 (디스크) caspase-8 활성화; 리드 어셈블리에 비슷한 단백질 상호 작용 결과 caspase-2;를 활성화할 수 있습니다 PIDDosome 그리고 다양 한 inflammasome 단지 caspase-1 정품 인증 10,,1112을 시작 하는. 따라서, 초기자 caspases는 유도 근접 고 이합체 화 없이 활성화를 발생 하지 것입니다 일반적인 메커니즘에 의해 특정 활성화 플랫폼을 채용.
Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)는 초기자 caspases의 활성화에서이 첫 번째 단계를 측정 하기 위해 개발 된 영상 기반 분석 결과 caspase 유도 근접 다음 활성화 플랫폼의 직접 시각화 어셈블리입니다. 이 방법은 분할 형광 단백질 비너스의 속성 활용합니다. 금성은 더 밝고 비 형광과 약간 겹치는 두 조각으로 분리 될 수 있다 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 더 photostable 버전: 금성 금성 N (VN), 비너스 (금성 C 또는 VC)의 C-말단의 N terminus. 이 파편 refold 될 때 근접 13에 형광을 유지 합니다. 각 비너스 조각 활성화 플랫폼을 caspase의 최소 부분입니다 caspase의 prodomain에 융합 이다. 그러면 그는 caspases 효소 활동을 유지 하지 않습니다 및 따라서 생 이벤트와 관련 된 다운스트림 이벤트의 동시 분석 가능 하다. 금성 파편 refold caspase prodomains 활성화 플랫폼을 채용 하 고 유도 근접을 받 다. (그림 1B)입니다. 결과 금성 형광 정확 하 고 구체적으로 subcellular 지 방화, 활동, 그리고 단일 셀에서 초기자 caspase 활성화 플랫폼의 조립의 효율성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 또는 표준 형광 현미경 검사 법에 의해 취득 될 수 있다 데이터 이미징 및 다른 현미경 방법 등의 숫자에 적응 시킬 수 있다: 실시간으로; caspase 활성화 추적 시간 경과 영상 subcellular 지 방화;의 정확한 결정을 위한 고해상도 이미징 그리고 활성화의 효율성의 끝점 정량화입니다.
이 기술은 caspase-214의 활성화를 조사 하기 위해 처음 개발 되었다. Caspase-2에 대 한 정품 인증 플랫폼은 PIDDosome 생각 된다, 하는 동안 구성 된 수용 체 PIDD (죽음 도메인으로 유도 하는 p53 단백질)와 RAIDD (죽음 도메인 RIP 관련 ICH-1/CAD-3 동종 단백질), 어댑터 PIDDosome-독립적인 caspase-2 정품 인증 보고 되었습니다. 이 caspase-2에 대 한 추가 활성화 플랫폼 존재 15,16나왔다. 모르고 caspase-2 활성화 플랫폼의 전체 구성 요소, 불구 caspase BiFC 기술은 분자 수준 14,17caspase-2 신호 통로의 성공적인 심문을 위해 허용 했다. 우리 또한 성공적으로이 프로토콜 염증 caspases (caspase-1,-4,-5-12)에 대 한 적응 18 , 원칙적으로, 동일한 접근 마찬가지로 나머지 초기자 caspases의 각각을 분석 하는 것을 충분 해야 한다. 이 프로토콜 마찬가지로 적응 될 수 있는 다른 경로 조사 이합체 화는 주요 활성화 신호 했다. 예를 들어, STAT 단백질 이합체 화 Janus 키 니 아 제 (JAK) 19에 따라 인 산화에 의해 활성화 됩니다. 따라서, BiFC 시스템 합계 활성화 뿐만 아니라 많은 다른 경로 동적 단백질 상호 작용에 의해 규제에 대 한 시각화 사용 될 수 있습니다. 다음 프로토콜 이미지 수집 및 분석을 위한 방법론 뿐만 아니라 세포로 기자 들의 도입에 대 한 단계별 지침을 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

프로 테아 제 caspase 제품군 apoptosis와 타고 난 면제에 필수적인 역할을 한다. 이 중, 초기자 caspases로 알려진 네가이 경로에서 활성화 될 먼저 있습니다. 이 그룹 포함 caspase-2,-8, 및-9, 뿐만 아니라 염증 caspases, caspase-1,-4, 그리고-5. 초기자 caspases 모두 다음 모집 활성화 플랫폼 이라고 하는 특정 multiprotein 복합물을 이합체 화에 의해 활성화 됩니다. Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)은 어디 caspases 초기자 caspases 그들의 활성화 플랫폼 및 그 결과의 채용을 시각화 하는 데 사용 되는 시작자를 융합 하는 형광 단백질을 분할 영상 기반 접근 유도 근접입니다. 이 형광 판독을의 초기자 caspase 활성화에 필요한 초기 단계 중 하나를 제공 합니다. 다양 한 다른 현미경-기반 접근을 사용 하 여,이 기술은 caspase 활성화 크기 및 caspase 활성화의 활동 인구 수준에 caspase 활성화의 효율성에 양적 데이터를 제공할 수 있습니다. 셀 당 기초에 있는 복합물

DNA 손상에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC의 예는 그림 3에 표시 됩니다. Camptothecin는 topoisomerase 나 억제제, DNA 손상 및 caspase-2 활성화를 유도 하는 데 사용 되었다. 빨간 형광 단백질 mCherry 셀 BiFC 프로브 표현 게재 하 고 셀의 총 수를 시각화 하기 기자로 서 사용 되었다. 금성 형광 녹색으로 표시 됩니다 및 큰 puncta는 caspase-2 대표 근접을 유도. 이 세포는 금성...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K 조회수.  Baylor College of Medicine. 이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of galectin-3 into the splicing pathway is addressed in this paper. Sedimentation of HeLa cell nuclear extracts on 12%-32% glycerol gradients yields fractions enriched in an endogenous ~10S particle that contains galectin-3 and U1 snRNP. We now describe a protocol to deplete nuclear extracts of U1 snRNP with concomitant loss of splicing activity. Splicing activity in the U1-depleted extract can be reconstituted by the galectin-3 - U1 snRNP particle trapped on agarose beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies. The results indicate that the galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternary complex is a functional E complex leading to intermediates and products of the splicing reaction and that galectin-3 enters the splicing pathway through its association with U1 snRNP. The scheme of using complexes affinity- or immuno-selected on beads to reconstitute splicing activity in extracts depleted of a specific splicing factor may be generally applicable to other systems.

This article describes the experimental procedures for (a) depletion of U1 snRNP from nuclear extracts, with concomitant loss of splicing activity; and (b) reconstitution of splicing activity in the U1-depleted extract by galectin-3 - U1 snRNP particles bound to beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies.

구슬에 갈렉틴-3 - U1 snRNP 복합체에 의한 접합 활동의 보완

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of sphingolipids in the cell membrane, is one of the best-characterized LPLs that regulates a variety of cellular physiological responses via signaling pathways mediated by sphingosine 1-phosphate receptors (S1PRs). This implicated that the S1P-S1PRs signaling system is a remarkable potential therapeutic target for disorders, including multiple sclerosis (MS), autoimmune disorders, cancer, inflammation, and even COVID-19. S1PRs, a small subset of the class A G-protein coupled receptor (GPCR) family, are composed of five subtypes: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, and S1PR5. The lack of detailed structural information, however, impedes the drug discovery targeting S1PRs. Here, we applied the cryo-electron microscopy method to solve the structure of the S1P-S1PRs complex, and elucidated the mechanism of activation, selective drug recognition, and G-protein coupling by using cell-based functional assays. Other lysophospholipid receptors (LPLRs) and GPCRs can also be studied using this strategy.

S1P exerts its diverse physiological effects through the S1P receptors (S1PRs) subfamily. Here, a pipeline is described to expound on the structures and function of S1PRs.

스핑고신 1-인산염 수용체의 구조와 신호전달 경로를 조사하는 파이프라인

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...