골격근은 질산염으로 전환 된 후 운동 중에 NO의 원천 역할을하는 질산염의 주요 저장소 역할을합니다. 여기에서는 근육과 다른 조직에서 이러한 이온을 측정하는 방법론을 제시합니다. 시작하려면 증류수에 890 밀리몰 칼륨 페리시안화물과 118 밀리몰 n- 메틸 말레이 미드를 결합하여 질산염 보존 또는 정지 용액을 준비하고 용액에 결정이 남아 있지 않은지 확인한 다음 비이 온성 계면 활성제를 1 대 9 비율로 첨가하고 거품을 피하기 위해 부드럽게 혼합하십시오.
정지 용액을 증류수로 1 대 9 비율로 희석하고 희석 된 정지 용액을 균질화 튜브에 첨가하십시오. 다음으로, 이전에 분리되고 얼어 붙은 쥐 근육 조직을 얼음 위에서 해동하십시오. 조직이 해동되면 골격근에서 남은 지방과 결합 조직을 제거합니다.
골격근 조각을 잘라 내고 거즈로 닦아서 말립니다. 적절한 양의 골격근 조직의 무게를 측정한 다음 정지 용액이 포함된 균질화 튜브에 사전 중량 조직을 넣습니다. 회전식 균질화기에서 균질화를 위해 미리 계량된 골격근과 미리 측정된 정지 용액이 포함된 M형 튜브를 기계에 넣습니다.
각 샘플을 두 번 균질화하고 각 균질화 후 튜브를 즉시 얼음 위에 놓고 5 분 동안 식힌다. 균질화 후 튜브를 짧게 원심 분리하십시오. 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 15초 동안 볼텍싱하기 전에 적절한 양의 메탄올을 추가합니다.
샘플을 다시 균질화하고 얼음에서 30 분 동안 배양 한 다음 샘플을 원심 분리하고 상청액을 흡입하고 아질산염 및 질산염 수준을 측정합니다. 비드 균질화를 위해 골격근 조직을 비드 함유 튜브에 넣고 기기에서 사용할 수 있는 최고 속도로 45초 동안 두 번 균질화합니다. 각 균질화 후 즉시 튜브를 얼음에 5분 동안 놓아 식힌 다음 튜브를 원심분리하고 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 15초 동안 소용돌이치기 전에 적절한 양의 메탄올을 추가합니다.
샘플을 다시 한 번 45초 동안 균질화한 다음 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리하고 상청액을 흡입하고 아질산염 및 질산염 수준 측정을 진행합니다. 분쇄기 기반 균질화의 경우 희석된 정지 용액이 포함된 튜브를 준비한 다음 튜브의 무게를 측정하고 기록합니다.
드라이 아이스에서 분쇄기 도구를 30 분 동안 냉각 한 후 액체 질소로 식힌 핀셋을 사용하여 미리 계량 된 조직 샘플을 분쇄기로 옮긴 다음 소량의 액체 질소를 추가하여 조직이 액체 질소 온도에 있는지 확인합니다. 액체 질소의 95%가 기화된 후 분쇄 도구를 조직 위에 놓고 단단히 눌러 샘플 분쇄를 느낀 다음 망치를 사용하여 분쇄 도구를 3-5회 칩니다. 전체 샘플이 분쇄되면 액체 질소 냉각 스푼과 핀셋을 사용하여 분쇄 된 조직을 희석 된 정지 용액이 들어있는 사전 칭량 튜브로 직접 옮깁니다.
그런 다음 튜브를 15초 동안 휘젓고 튜브를 열어 뚜껑에 붙어 있는 조직이 있는지 확인합니다. 있다면, 그것을 제거 한 다음 다시 소용돌이치십시오. 샘플을 2-3초 동안 간단히 원심분리합니다.
튜브의 무게를 다시 측정하고 이 새 무게에서 원래 튜브 무게를 공제하여 조직 무게를 계산합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 튜브에 적절한 양의 메탄올을 넣고 15 초 동안 튜브를 완전히 와동시킨 다음 얼음에서 30 분 동안 배양 한 다음 샘플을 원심 분리하고 상청액을 흡인하고 아질산염 및 질산염 수준을 측정합니다.
질산염 수준 및 회전식 균질화기, 비드 균질화기 및 분쇄기를 사용하여 제조된 래트 골격근 균질물은 유사하였다. 흥미롭게도, 아질산염 수준의 경우, 분쇄기에 의해 제조 된 균질 액 샘플이 가장 높은 값을 나타 냈으며, 이는 다른 두 샘플 값과 통계적으로 달랐다. 비드 균질화를 사용하여 20, 50 및 200 밀리그램의 조직으로부터 제조 된 둔근 균질 액의 아질산염과 질산염 수준의 비교는 질산염 또는 아질산염 수준이 근육 샘플 크기간에 유의하게 다르지 않은 것으로 나타났다.
다른 설치류 다리 골격근 조직에서 질산염 수준을 비교한 결과 둔근이 다른 세 근육 조직보다 질산염 수치가 약 2배 더 높은 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 차이는 통계적 유의성에 도달하지 못했습니다. 질산염 수준과 유사하게, 둔근의 질산염 농도도 다른 세 근육 조직보다 높았으며 비복근 샘플보다 훨씬 높았습니다.
당사의 방법은 비교적 간단하고 샘플 준비 중에 질산염과 아질산염을 보존하면서 작은 샘플에 적합합니다.
