Actin은 세포 골격의 주요 구성 요소이며 뉴런을 포함하여 세포 형태학 및 생리학의 여러 측면을 비판적으로 조절합니다. 액틴은 두 가지 형태, 단황 구형 G-actin 또는 중합체 필라멘트 F-actin 사이의 평형에서 발생합니다. actin의 중합 상태는 actin 결합 단백질뿐만 아니라 자체 번역 후 규정에 의해 여러 수준에서 엄격하게 규제됩니다.
신경 간 시냅스 접점에서 F-actin 수준의 동적 변화는 시냅스 전 및 사후 시냅스 터미널 모두에서 신호 및 가소성을 제어하는 주요 규제 이벤트입니다. 당연히, actin 기능 장애는 몇몇 신경 병증 상태에 연결됩니다. 최근 발전은 신경 생리학 및 병리 생리학에 있는 actin의 지식의 부를 지도했습니다.
그러나 많은 아직 알려지지 않았으며 에 초점을 맞출 필요가있다. 이와 관련하여, 폰로이드인의 형광 유사체는 액틴 연구의 주요 도구로 입증되었습니다. 이 남근토신은 특히 필라멘트 액틴에 결합하고, 따라서 F-actin의 수량및 병리학적 상태의 변경의 직접적인 척도로 사용될 수 있다.
이 연구는 뇌 조직에서 도매 균질화 및 생화학적으로 고립된 시냅스 말단과 같은 전 생체 내 생물학적 샘플에서 액틴 중합 상태의 평가를 위한 빠르고 효율적인 형광 분석법을 제시합니다. 참고, 분석은 다른 세포 및 조직 유형 및 관련 생리 현상에 적용될 수 있다. 이 스터디에 사용된 버퍼의 조리법은 자세한 텍스트를 참조하십시오.
쥐 또는 인간 과목에서 뇌 조직 샘플 은 포터-엘베젬 유리 튜브에서 균질화 되었고 10권의 균질화 완충제에서 얼음에 유봉하였다. 시냅토솜 제제를 위해, 호모게네이트는 먼저 느린 속도로 회전한 다음 더 빠른 속도로 회전하여 조잡한 시냅토솜 미토콘드리아 분획을 얻었다. 이 조분획으로부터 의 한농축 시냅토솜은 불연속 자당 그라데이션에 따라 얻어졌다.
시냅토신경소말 제제를 위해 균질화는 2개의 100미크론과 1개의 5미크론 필터를 순차적으로 전달했습니다. 단백질 추정은 브래드포드 시약을 사용하여 수행되었고 샘플은 50 마이크로리터의 최종 부피에서 mL 단백질 당 2 ~ 3 밀리그램의 농도로 크렙스 버퍼에서 희석되었다. 분리된 시냅스 단자, 시냅토좀 또는 시냅토신경좀의 자극은 37도에서 세포외 칼륨의 짧은 30초 증가에 의해 수행되었다.
이를 위해, 1마리의 어금니 칼륨염을 15밀리몰라의 최종 농도로 시료에 첨가하였다. 균질화는 자극되지 않고 탈극성 단편이 2.5%의 글루타랄데히드로 고정되었으며, 25%의 글루타랄데히드 스톡 용액을 첨가하였다. 샘플은 실온에서 2 분, 3 분 동안 배양되었습니다.
고정은 5 분 동안 20, 000 G에서 원심 분리에 의해 제거되었습니다. 샘플은 실온에서 2~3분 동안 0.1%트리톤 X-100 및 mL 나트륨 보로하이드라이드당 1 mg을 함유한 크렙스 버퍼에서 재서스펜션에 의해 투과화를 위해 진행되었다. 투과 완충제 버퍼는 원심분리에 의해 다시 제거되었고 펠릿은 크렙스 버퍼로 피상적으로 세척되었고 1X 알렉사 플루어 647 프할로이드인을 함유한 크렙스 버퍼에서 재장중단되었으며, 이는 500 마이크로 유닛의 판로이드인에 해당한다.
바인딩은 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 진행할 수 있었습니다. 과도한 언바운드 프할로이드인은 20, 000 G에서 원심분리에 의해 시료로부터 5분 동안 제거되었고, 펠릿은 크렙스 버퍼로 표면적으로 세척되었고, 시냅토좀 또는 시냅토뉴모종의 부력을 유지하기 위해 0.32 개의 어어 자당을 함유한 크렙스 버퍼에서 다시 재장정하였다. 형광 판로이드 바운드 샘플은 플레이트 판독기에서 형광 판독을 위해 96 개의 잘 검은 색 판에 분배되었습니다.
각광 및 방출 파장은 각각 645나노미터 및 670 나노미터로 설정되었다. 실험의 각 세트에 대해 우리는 0.32 어어 자당을 포함하는 크렙스 버퍼에서 알렉사 플루어 647 phalloidin의 다른 양을 포함했다. 세척 단계 동안 샘플의 손실을 설명하기 위해 샘플은 검은 색에서 투명 96 웰 플레이트로 전송되었습니다.
샘플을 포획한 다음 440 나노미터에서 검사하였다. 형광 판로이드의 보존은 샘플에서 액틴 필라멘트 또는 F-액틴 수준의 양에 직접 비례한다. 프할로이딘 결합의 선형성은 50 에서 200 마이크로그램 단백질의 범위에서 관찰되었다.
원칙의 증거로, 우리는 또한 라틀컬린 A에 의한 액틴 필라멘트의 약리학적 중단을 이용한 F액틴 분해 모델에서 우리의 분석 효능뿐만 아니라 KCl중재된 시냅스 단말의 자극에 의한 F액틴 형성의 자극을 시험했다. 바운드 판로이드로부터의 형광 방출은 표준 선형 곡선으로부터 생성된 바운드 프할로이드의 어느 단위로도 표현될 수 있으며 제어 시료를 기준으로 한다. 도 4의 경우, F-액틴 수준은 바운드 팔로이드의 마이크로 단위로 표현된다.
한편, 탈극성 시냅스 단편에서 도 5 F-액틴 수준은 제어편광 시료에 따라 발현된다. 우리는 actin 필라멘트, 또는 F-actin의 분석을 위한 견고하고 시간 효율적이며 높은 처리량 분석, 그리고 96 웰 플레이트 형식에 적합한 생리및 병리학 적 상태의 변경에 대해 설명합니다. 분석법은 기존 대체 프로토콜보다 훨씬 빠르며, 단독으로 또는 기존 면역 히스토팅 기반 분석과 함께 액틴 관련 연구에서 필수적인 도구로 작용할 수 있습니다.
