أكتين هو المكون الرئيسي للهيكل الخلوي وينظم بشكل حاسم عدة جوانب من مورفولوجيا الخلوية وعلم وظائف الأعضاء، بما في ذلك في الخلايا العصبية. Actin يحدث في توازن بين شكليه، أحادية الكبيبة G-أكتين أو بخيوط البوليمرية F-actin. يتم تنظيم حالة البلمرة من actin بشكل صارم على مستويات متعددة سواء عن طريق البروتينات الملزمة actin ، فضلا عن تنظيمها الخاص بعد الترجمة.
في الاتصالات متشابك الداخلي، والتعديلات الديناميكية في مستويات F-actin هي حدث تنظيمي رئيسي، والسيطرة على الإشارات واللدونة في كل من محطات ما قبل وبعد متشابك. ليس من المستغرب، يرتبط الخلل الوظيفي actin إلى العديد من الحالات العصبية. وقد أدت التطورات الأخيرة إلى ثروة من المعرفة actin في فسيولوجيا الخلايا العصبية والفيزيولوجيا المرضية.
ومع ذلك لا يزال هناك الكثير غير معروف ويحتاج إلى التركيز عليه. وفي هذا الصدد، أثبتت النظائر الفلورية لل phalloidin أن تكون أداة رئيسية في البحوث أكتين. يرتبط هذا الفالوتوكين على وجه التحديد بال أكتين الخيطي ، وبالتالي يمكن استخدامه كمقياس مباشر لكميات F-actin ، وتغييره في الحالات المرضية الفسيولوجية.
تقدم هذه الدراسة تقييمافلوريا سريعا وفعالا لتقييم حالة البلمرة actin في العينات البيولوجية السابقة في الجسم الحي ، مثل المتجانسات بالجملة والمحطات المتشابكة المعزولة كيميائيا من أنسجة الدماغ. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق المقايسة على أنواع الخلايا والأنسجة الأخرى وما يرتبط بها من ظاهرة فسيولوجية. للحصول على وصفات المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة، يرجى الرجوع إلى النص التفصيلي.
تم تجانس عينات أنسجة الدماغ من الفئران أو البشر في أنبوب زجاجي بوتر-إلفيهم والحشرات على الجليد في 10 مجلدات من العازلة التجانس. لإعداد النايبتوسوم، تم نسج المتجانسة أولا بسرعة بطيئة ومن ثم بسرعة أعلى للحصول على كسر الميتوكوندريا النابتوسوم الخام. تم الحصول على السنابتوسومات المخصبة من هذا الكسر الخام بعد تدرج السكروز المتقطع.
لإعداد المشبكية، تم تمرير التجانسات بالتسلسل من خلال اثنين 100 ميكرون ومرشح واحد 5 ميكرون. تم إجراء تقدير البروتين باستخدام كاشف برادفورد وتم تخفيف العينات في عازل كريبس بتركيز من 2 إلى 3 ملليغرام لكل بروتين مل في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر. تم تحفيز المحطات المتشابكة المعزولة ، إما النايبوسومات أو synaptoneurosomes ، من خلال زيادة قصيرة 30 ثانية في البوتاسيوم خارج الخلية عند 37 درجة.
لهذا، تمت إضافة كلوريد البوتاسيوم الضرس واحد إلى العينات إلى تركيز النهائي من 15 ملليمولار. التجانسات غير منبهة وتم إصلاح شظايا متشابكة غير ملوثة مع 2.5٪ غلوتارالدهيد، بإضافة الحجم المطلوب من محلول مخزون glutaraldehyde بنسبة 25٪. تم احتضان العينات لمدة دقيقتين أو ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تمت إزالة المثبت عن طريق الطرد المركزي في 20, 000 G لمدة خمس دقائق. ثم تم المضي قدما في العينات لبيرمابيليتيون عن طريق إعادة الإنفاق في العازلة كريبس التي تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 1 ملغ لكل مل بوروهيدريد الصوديوم لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة المخزن المؤقت Permeabilization مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي وغسلت بيليه سطحيا مع عازل كريبس وإعادة إنفاقها في عازل كريبس التي تحتوي على 1X اليكسا فلور 647 phalloidin، المقابلة ل 500 وحدة صغيرة من phalloidin.
وسمح ملزمة للمضي قدما لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تمت إزالة ال phalloidin الزائدة غير المنضمة من العينات عن طريق الطرد المركزي في 20،000 G لمدة خمس دقائق ، وغسلت الكريات سطحيا مع عازل كريبس ، وإعادة إنفاقها مرة أخرى في عازل كريبس التي تحتوي على 0.32 السكروز الضرس للحفاظ على الطفو من النافتوسومات أو synaptoneurosomes. تم الاستغناء عن عينات phalloidin الفلورسنت ملزمة في لوحة سوداء 96 جيدا للقراءة الفلورية في قارئ لوحة.
تم تعيين الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات عند 645 نانومتر و 670 نانومتر على التوالي. لكل مجموعة من التجارب أدرجنا كميات مختلفة من اليكسا فلور 647 phalloidin في العازلة كريبس التي تحتوي على 0.32 السكروز المولار. ولحصر أي خسائر في العينات أثناء خطوات الغسيل، نقلت العينات من اللوح الأسود إلى صفيحة البئر الشفافة 96.
ثم تم فحص التقاط العينات في 440 نانومتر. الاحتفاظ phalloidin الفلورسنت يتناسب مباشرة مع كمية خيوط أكتين أو مستويات F-actin في العينات. لوحظ خطية ربط phalloidin في نطاق 50 إلى 200 ميكروجرام من البروتينات.
كدليل على المبدأ، اختبرنا أيضا فعالية المقايسة لدينا في نماذج لDypolymerization F-actin باستخدام تعطيل الدوائية من خيوط أكتين من قبل Latrunculin A، فضلا عن تحفيز تشكيل F-actin بواسطة KCl بوساطة تحفيز المحطات متشابك معزولة. ويمكن التعبير عن انبعاث الفلورسينس من phalloidin ملزمة إما وحدات من phalloidin ملزمة ولدت من منحنى خطي القياسية ونسبة إلى عينات التحكم. بالنسبة للأرقام 4، يتم التعبير عن مستويات F-actin كوحدات صغيرة من phalloidin المقيد.
ومن ناحية أخرى، بالنسبة لمستويات الشكل 5 F-actin في شظايا متشابكة إزالة الاستقطاب يتم التعبير عنها بالنسبة للعينات غير القطبة التحكم. نحن نصف قوية، كفاءة الوقت وارتفاع الإنتاجية المقايسة لتحليل خيوط أكتين، أو F-actin، وتعديلاته في الدول الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية مناسبة لشكل لوحة بئر 96. إن المقايسة أسرع بكثير من البروتوكولات البديلة القائمة ويمكن أن تكون بمثابة أداة أساسية في الدراسات المتعلقة بال أكتين، إما بمفردها أو بالاشتراك مع الكيمياء المناعية القائمة والمقايسات الغربية القائمة على النشاف.
