Name: cerebellar regional dissection for molecular analysis
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
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우리는 해부 와 RNA 추출 및 RTqPCR에서 문제 해결에 그들의 도움에 대한 Cvetanovic 실험실에서 오스틴 페로와 Juao-Guilherme 로사에 감사드립니다. 이 연구는 M. Cvetanovic에 의해 투자, R01 NS197387; HHS | 건강의 국가 학회 (NIH).

1. 설정
<ol><li>참수 가위, 무딘 집게, 해부 가위, 혈관 가위, 미세 한 미세 한 마우스 뇌 매트릭스, 면도날, 200 μL 파이프 팁, 유리 페트리 접시, 유리 슬라이드 및 얼음 양동이를 포함한 필요한 장비를 수집합니다. 흡수 패드에 모든 장비를 배치합니다.</li>
	<li>페트리 접시, 유리 접시, 뇌 매트릭스를 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>수직 각도에서 면도날을 사용하여 200 μL 파이프 팁 의 끝에서 약 5mm를 다듬습니다. 이것은 팁의 끝에 있는 개구부 크기를 약 1mm 너비로 만듭니다. 이것은 DCN을 펀치하기에 충분해야합니다. 그러나 이것은 또한 해부에 따라 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 쉽게 교체하고 조정할 수 있는 많은 팁을 준비하십시오.</li>
	<li>동물 식별 및 소뇌 지역 (동물 당 4 개의 튜브)을 가진 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브를 라벨.</li>
	<li>냉동 안전 용기를 액체 질소로 채우고 추출 후 조직을 플래시합니다.</li>
</ol>2. 뇌 추출 및 해부
모든 실험은 미네소타 대학의 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.
<ol><li>5% CO2 노출을 사용하여 마우스를 안락사시합니다. 호흡이 중단되면 자궁 경부 탈구를 수행하십시오. 참수 가위로 마우스를 참수하고 적절한 소켓에서 시체를 폐기하십시오.</li>
	<li>코에서 시작하여 다시 계속 머리의 내측 처진 라인을 따라 면도날로 절개를합니다. 피부를 분리하고 중간선의 양쪽으로 이별합니다. 면도날을 사용하여 양쪽의 근육을 잘라내고 외이도를 지나가세요.</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 뇌 줄기가 소뇌와 만나는 척수 영역을 다듬어 소뇌를 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>혈관 가위 블레이드 중 하나를 뇌간과 척추 기둥 사이의 공간에 삽입하고 외이도쪽으로 잘라 내어 가위를 들어 올려 뼈를 깨끗하게 자르지만 조직에 손상을 제한합니다.</li>
	<li>후각 전구쪽으로 두개골 가장자리를 따라 계속 자르고 뇌 조직의 손상을 제한하기 위해 절단하는 동안 계속 들어 올립니다.</li>
	<li>무딘 집게를 사용하여 두개골 뒤쪽을 부드럽게 벗겨 내어 뇌와 소뇌의 후방 부위를 발견합니다.</li>
	<li>방금 잘라낸 두개골 가장자리를 따라 무딘 집게를 사용하여 두개골의 나머지 부분을 뇌 위로 껍질을 벗깁니다. 이 단계는 두개골 모자의 대부분을 제거해야, 뇌를 공개.</li>
	<li>혈관 가위와 무딘 집게로 두개골의 나머지 부분을 다듬어 뇌 의 상단에서 대부분의 두개골을 치우십시오.</li>
	<li>microspatula를 사용하여, 약간 두뇌를 들어 올리고 아래 를 떠서 나머지 두개골에서 후각 전구를 제거하고 광관 섬유를 분리합니다. 뇌는이 시점에서 쉽게 무료로 와야한다.</li>
	<li>얼음 위에 앉아 있는 페트리 접시에 뇌를 넣고 남은 두개골이나 다른 파편을 제거합니다.</li>
	<li>microspatula를 사용하여, 부드럽게 등쪽 측으로 뇌 매트릭스에 뇌를 배치. 시간을 내어 행렬의 레벨이 설정되어 있는지, 특히 중간선이 행렬의 중심이 되는지 확인합니다. 이 매트릭스는 성인 마우스 뇌 조직을 위해 설계, 젊은 또는 병든 동물의 조직은 매트릭스에서 더 낮은 휴식을 취할 수 있지만 여전히 샘플에 걸쳐 재현 가능한 결과를 얻을 수 있어야합니다.</li>
	<li>적중 한 미드라인을 따라 면도날 한 개를 놓고 블레이드가 매트릭스의 바닥까지 밀어넣도록한다(그림 1B).</li>
	<li>첫 번째블레이드(그림 1B)의측면에 다른 면도날 1mm를 놓습니다. 두 개의 블레이드를 서로 1mm 더 놓습니다. 최종 결과는 뇌의 한쪽에 놓인 3개의 블레이드여야 하며, 모두 1mm 떨어져 있어야 합니다. 다른 쪽에서도 마찬가지입니다. 총 7개의 블레이드가 1mm 간격으로 배치됩니다(그림1C).</li>
	<li>조심스럽게 면도날의 앞뒤 끝을 잡고 매트릭스에서 똑바로 들어 올립니다. 면도날 바깥쪽에 있는 조직을 폐기할 수 있습니다.</li>
	<li>천천히, 다른 사람과 한 번에 하나의 면도날을 분리, 조직 섹션을 손상시키지 않도록주의.</li>
	<li>조심스럽게 면도날의 조직 섹션을 밀어 마이크로 스patula와 유리 슬라이드에. 총 6개의 궁극의 뇌 단면도(그림1D)가있을 것이다.</li>
	<li>4개의 가장 측면 섹션에 DCN이 표시됩니다(보라색 상자, 그림 1D). DCN을 격리하려면 다듬어진 200 μL 파이펫 팁을 DCN 을 수직으로 잡고 조직을 단단히 밀어 내고 모든 방향으로 흔들어 주변 조직에서 DCN을 완전히 해부합니다. DCN을 깨끗하게 제거하기 위해 똑바로 다시 들어 올리고 팁에 조직의 존재를 시각적으로 확인합니다.</li>
	<li>한 손가락을 끝 의 상단에 놓고 아래로 밀어 내밀어 조직이 부풀어 오르게합니다. 팁을 올바르게 표지된 미세푸지 튜브에 넣고 조직 펀치가 튜브 바닥에 놓이도록 합니다. 나머지 세 섹션에 대해 2.17을 반복하여 DCN 펀치를 동일한 튜브에 배치합니다. 튜브를 액체 질소에 넣고 플래시를 고정합니다. 도 1E에서각 펀치의 크기를 표현합니다.</li>
	<li>DCN 추출 한 섹션은 소뇌 반구로 자격이 있습니다. 이 단면도에 있는 소뇌의 주위에 두뇌 조직의 나머지 부분을 밀어. 무딘 집게를 사용하고 부드럽게 이러한 반구 소뇌 피질 섹션을 선택하고 각각의 미세 분리 튜브에 배치합니다. 플래시 가 동결.</li>
	<li>마지막 두 개의 상록 섹션 (밝은 파란색 상자, Figure1D)에대 한, 소뇌만 떠나 주변 뇌 조직을 멀리 밀어. 면도날을 사용하여 전방 소구를 후방 소반과 분리하는 절단을 합니다. 절단은 소두 6의 형성 직후이어야하며 소두(10)를포함해서는 안됩니다.</li>
	<li>무딘 집게를 사용하여 전방 소뇌 피질 섹션과 후방 소뇌 피질 섹션을 각각의 미세 분리 튜브에 조심스럽게 놓고 5 분 동안 액체 질소에 튜브를 방치하여 플래시 동결하십시오. 여기에서 RNA 추출으로 전진하거나 -80°C에서 튜브를 저장할 수 있다.</li>
</ol>3. RNA 추출 
참고 : 이 프로토콜은 TRIzol20RNA추출을위한 콜드 스프링 하버 프로토콜에서 수정됩니다. TRIzol은 생물학적 물질을 용해시켜 RNA를 추출할 수 있게 합니다.
<ol><li>마이크로퍼지 튜브를 얼음에 놓고 조직이 너무 빨리 해동되지 않도록 하고, 마이크로퍼지 튜브에 150 μL의 차가운 TRIzol을 적용합니다. 살균 된 페일과 균질화하십시오. 조직이 균질화되면 용액을 위아래로 파이프하여 남은 조직이 손상되지 않도록 하십시오. 또한 인슐린 주사기로 몇 번 당겨서 작은 조직 조각을 분해하십시오.</li>
	<li>TRIzol의 또 다른 350 μL을 추가하고 철저하게 혼합하려면 위아래로 파이펫합니다. 5 분 동안 방 온도에 앉아 보자.</li>
	<li>150μL의 클로로폼을 튜브에 넣고 힘차게 흔들어 서 2-3분간 휴식을 취하십시오. 엽록소형태는 균질화된 조직 용액을 단계(RNA, DNA 및 단백질)로 분리합니다.</li>
	<li>15°C에서 12,000 x g의 원심분리기는 10분 동안 가능합니다. 모든 튜브가 동일한 방향에 있는지 확인합니다.</li>
	<li>조심스럽게 튜브를 제거하고 원심 분리기의 온도를 4 ° C로 설정합니다. 불투명한 간위상(DNA)을 방해하지 않도록 주의하여 새로운 튜브(RNA)로 명확한 수성 상만 제거하십시오.  가장 낮은 단계는 빨간색이 될 것이며 단백질을 함유하고 있습니다. 튜브에 남은 솔루션을 저장하거나 버릴 수 있습니다.</li>
	<li>1:2 비율로 100% 이소프로필 알코올을 추가합니다(수성 상 200ul을 제거하면 이소프로필 알코올 100 μL을 추가). 위아래로 파이프를 통해 완전히 섞으세요. 실온에서 10분간 휴식을 취하십시오. 이소프로필 알코올은 RNA를 용액에서 침전시합니다.</li>
	<li>원심 분리기는 12,000 x g, 4 °C에서 10 분 동안. 펠릿을 쉽게 시각화할 수 있도록 모든 튜브를 동일한 방향으로 배치해야 합니다. 결과 펠릿은 추출된 RNA가 될 것이다.</li>
	<li>조심스럽게 튜브를 제거하고, 펠릿을 방해하지 않도록주의되는 파이프로 상체를 제거합니다. 펠릿은 다소 젤과 같고 보기 어려울 수 있지만 원심분리기의 튜브 방향을 기준으로 하는 위치를 추정할 수 있어야 합니다.</li>
	<li>모든 상체를 제거한 후 75% 에탄올, 소용돌이, 원심분리기 의 500 μL을 4°C에서 7500 x g로 5분간 추가합니다. 에탄올은 펠릿을 더 낭비합니다.</li>
	<li>펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 샘플을 건조하기 위해 캡을 열어 둡니다. 이것은 일반적으로 5-10 분 걸리지만 펠릿에 남은 에탄올의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 지나치게 건조하지 마십시오.</li>
	<li>건조하면 DNase 의 물에서 펠릿을 다시 놓습니다. DCN용 샘플에 20 μL을 추가하고 다른 모든 샘플에 30 μL을 추가합니다.</li>
	<li>다시 중단되면 샘플을 -80 °C에 저장하거나 추가 테스트를 진행할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(RTqPCR)
<ol><li>이 단계 전에 DNase는 어떤 게놈 DNA를 제거하기 위하여 RNA를 취급하고, BioRad에서 iScript를 이용한 cDNA를 생성할 필요가 있을 것입니다. cDNA를 만들기 전에 RNA의 농도를 정상화해야합니다. 또한 qPCR용 프라이머를 최적화하는 것이 중요합니다. 이 단계21을완료하려면 여기에 설명된 메서드를 따르십시오. 아래 qPCR에 대한 간략한 설명.</li>
	<li>프라이머는 모두 IDT에서 구입합니다. 전방 및 역시퀀스는 모두 동일한 샘플 튜브에 있으며 20배 농도로 저장됩니다. Rps18 (제어 유전자): 포워드 – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' 역 - 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' 파르팔알린 (칼슘 결합 단백질, 억제 세포): 포워드 – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTCC-3' 역 - '5-AGCGTCTTTTTTTTTTTTTT타카그-3' Kcng4 (칼륨 채널 하위 단위): 앞으로 – 5'-CTGTCTTTTCCTGTCAGTGA-3' 역 – 5'-GCATTGCCTCAGGTCAG-3' 알돌라제 C (제브린 II, 소뇌 피질에 걸쳐 차별화됨): 포워드 – 아가가카아가타가트GCTG-3' 역 - 5'-TCAGTAGGCATGGTTGC-3'</li>
	<li>qPCR 조건은 다음과 같습니다. 95°C에서 5분 전 배양 기간. 증폭 기간, 50 사이클: 95°C에서 10분, 62°C에서 10분, 72°C에서 10분. 95°C에서 5초, 65°C에서 1분, 97°C의 목표 온도까지 경사로 속도를 .07°C/초로 설정합니다. 그런 다음 냉각 기간을 10분에서 40°C까지 냉각합니다.  모든 qPCR 반응은 트리플리케이트및 유전자 발현에서 수행되었다 2-ΔΔCt를 사용하여 Rs18을 사용하여 로딩 제어로서 유전자 발현을 정상화했다. 대량 소뇌 추출물은 참고로 사용되었다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기서 설명된 방법은 4개의 명백한 소뇌 지역 내의 근본적인 유전자 발현 및 분자 기계장치를 평가할 수 있게 합니다 - 깊은 소뇌 핵 (DCN), vermis의 전방 소뇌 피질 (CCaV), vermis의 후방 소뇌 피질 (CCpV), 및 반구의 소뇌 피질 (CCH). 이 지역을 별도로 평가하는 능력은 특정 소뇌 지역의 이질성에 대한 우리의 지식을 확장하고 다양한 행동에 대한 기여도를 밝힐 것입니다.
전체 뇌 조?...

소뇌는 뇌의 뉴런의 절반 이상을 포함하고 역사적으로 뇌1의모터 제어 및 균형 센터로 언급되었습니다. 최근에는 소뇌가 인지, 보상 처리,2,3,4,5에영향을 미치는 등 다양한 기능에서 핵심적인 역할을 한다는 것을입증했습니다.
소뇌는 잘 설명 된 해부학을 가지고 : 피질 영역은 과립, Purkinje, 및 분자 층으로 구성되어 있습니다. 과립 세포는 과립 세포 층을 형성하고 열등한 올리브에서 유래한 등반 섬유로부터 입력을 받는 분자 층의 Purkinje 세포 모순자로 병렬 섬유를 통해 입력을 보냅니다. Purkinje 세포는 소뇌에서 주요 출력역할을 깊은 소뇌 핵 (DCN)에서 세포에 억제 프로젝션을 보냅니다. 이러한 소뇌 회로의 출력은 골기, 스텔레이트 및 바구니세포(4)를포함하는 소뇌 피질내의 억제 중뉴런의 활성에 의해 더 변조된다. 이 소뇌 기능 단위는 소뇌 피질의 모든 소구에 걸쳐 분포된다. 소뇌에 걸쳐이 상대적으로 균일 한 회로에도 불구하고, 인간의 신경 이미징 문헌 및 환자 연구에서 증거는소뇌의기능이질성을 나타냅니다6,7.
소뇌 피질은 두 가지 주요 영역으로 나눌 수 있습니다: 중간선 정의 된 vermis, 및 측면 반구. vermis는 전방 및 후방 소구로 더 나눌 수 있습니다. 소뇌의 이 명백한 지구는 다른 행동에 기여에 연루되었습니다. 태스크 호출 또는 작업 없는 활동 패턴은 vermis의 전방 영역이 모터 기능에 더 많이 기여하는 반면 후방 vermis는 인식6,7에더 많은 기여를 한다는 것을 암시합니다. vermis는 또한 영향과 감정과 연결되어 있으며, 소뇌 반구는 집행, 시각 공간, 언어 및 기타 mnemonic 함수8에기여합니다. 또한, 해부학 연구는 기능적으로 뚜렷한 소뇌 영역이 다른 피질영역9과연결되어 있다는 증거를 제공했다. 병변 증상 매핑은 전방 비골 (소두 VI로 확장)에 영향을 미치는 뇌졸중환자가 미세 운동 작업에 대한 성능이 좋지 않은 반면, 후방 엽 영역 및 반구에 손상을 입은 환자는 소뇌 운동 증후군10의부재시 인지 적자를 나타냈다는 것을 밝혔다. 마지막으로, 질병의 지역 소뇌 병리학은 기능적으로 뚜렷한 소뇌 부위가질병(11,12)에다르게 취약하다는 것을 나타낸다.
훨씬 덜 탐구하는 동안, 예비 기록은 소뇌 피질 지구에 걸쳐 명백한 유전자 발현 서명을 보여줍니다. 제브린 II의 Purkinje 세포 발현은 후방 로두에 더 많은 제브린 II 양성 세포가 있고 전방외구(13)에서더 적은 수 있도록 vermis에서 영역 특정 패터닝을 나타낸다. 이것은 또한 Zebrin II 음성 Purkinje 세포가 Zebrin II 양성14인Purkinje 세포 보다는 강장성 발사의 더 높은 주파수를 표시하기 때문에 지역적으로 명백한 생리기능과 상관관계가 있습니다.
소뇌 피질 이외에, 소뇌는 소뇌에 대한 1 차적인 출력으로 봉사하는 깊은 소뇌 핵 (DCN)을 포함합니다. 핵은 내측 (MN), 중측 (IN), 및 측면 핵 (LN)으로 구성됩니다. 기능성 이미징 및 환자 연구는 DCN이 또한 다양한 행동에 참여하는 것으로 나타났습니다15,그러나 DCN에 있는 유전자 발현 변경을 검토하는 거의 연구 결과.
분자 기술의 어드밴스는 뇌의 지역 유전자 발현을 평가할 수 있게 되었으며 생리학적 및 질병상태(16)의다른 뇌 영역 을 가로질러 다른 뇌 영역 내에서 이질성을 발견했습니다. 이러한 연구는 소뇌가 다른 뇌 영역과 다르다는 것을 연루시합니다. 예를 들어, 신경교 세포에 대한 뉴런의 비율은 다른 뇌 영역1에비해 소뇌에서 반전된다. 정상적인 생리학적 조건에서도, 선동적인 유전자의 발현은 다른 뇌영역(17)에비해 소뇌에서 강화된다. 분자 기술은 또한 소뇌 질환의 발병에 기여하는 경로를 식별하는 데 매우 유용했습니다. 예를 들어, 전체 소뇌 추출물의 RNA 염기서열분석기는 야생형 대조군과 비교하여 퍼킨제 세포 특이적 형형 마우스 모델인 척추유발실래1(SCA1)에서 변경된 유전자를 확인하였다. 이러한 증거는 소뇌 Purkinje 세포에 있는 기체 발생의 근본적인 중요한 분자 통로를 제시하고 잠재적인 치료 표적18을확인하는 것을 도왔습니다. 그러나, 최근 연구는 소뇌 지역(11,12,19)에걸쳐 질병에 대한취약성에차이가 있음을 시사한다. 이것은 전체 소뇌 추출물로 가려지거나 발견되지 않을 수 있는 뚜렷한 소뇌 지역에서 일어나는 중요한 변경이 있다는 것을 나타낼 수 있었습니다. 따라서, 연구원이 다른 소뇌 지구에 있는 분자 단면도를 검토하는 것을 허용하는 기술을 개발할 필요가 있습니다.
여기에서 제안된 기술은 그 지구에서 RNA를 격리하고 유전자 발현에 있는 지역적 다름을 탐구하기 위하여 마우스 소뇌의 4개의 별개의 지구를 해부하는 재현가능한 방법을 기술합니다. 도 1A에서 마우스 소뇌의 회로도는 파란색의 vermis와 노란색의 반구를 강조합니다. 구체적으로, 이 기술은 4개의 영역을 격리할 수 있게 합니다: 깊은 소뇌 핵 (DCN) (도 1A에있는 빨간 점선 상자), 전방 버미스 (CCaV)의 소뇌 피질 (CCaV) (다크 블루) 도 1A에서),후방 버미스(CCpV)의 소뇌 피질(도 1A에서연한 파란색), 반구(CCH)의 소뇌 피질(도 1A에서노란색). 이 지구의 유전자 발현을 별도로 평가함으로써, 이 다른 지구의 이산 기능의 근본적인 분자 기계장치뿐만 아니라 질병에 있는 그들의 취약성에 있는 잠재적인 다름을 조사할 수 있을 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 Microcentrifuge tubes</td><td>ThermoScietific</td><td>3456</td><td></td></tr><tr><td>100% Isopropyl Alcohol</td><td>VWR Life sciences</td><td>1106C361</td><td></td></tr><tr><td>200 ul Pipet tips</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-200</td><td></td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RBMA-200S</td><td></td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron</td><td>220905</td><td></td></tr><tr><td>Decapitation Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide (for electrophoresis)</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Kimble</td><td>6HAZ6</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringe (.5ml)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td><td>BIORAD</td><td>1725037</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle Nose forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Aldolase C</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58&gt;43415246</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Kcng4</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.56a.9448518</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Parvalbumin</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.7596729</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer Rps18&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.12109666</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Rzor Blades</td><td>Personna GEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile, sigle-use pestles</td><td>FisherScientific</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion by Life technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

소뇌는 운동, 균형, 인식, 보상 및 영향을 제어하는 등 여러 가지 주요 기능에서 중요한 역할을합니다. 이미징 연구는 뚜렷한 소뇌 부위가 이러한 다른 기능에 기여한다는 것을 나타냅니다. 지역 소뇌 차이를 검사하는 분자 연구는 주로 전체 소뇌 추출물에서 수행되어 특정 소뇌 부위에 걸쳐 구별을 마스킹하기 때문에 뒤쳐지고 있습니다. 여기에서 우리는 4개의 다른 소뇌 지역: 깊은 소뇌 핵 (DCN), 전방 및 후방 버피소 피질, 그리고 반구의 소뇌 피질의 4개의 다른 소뇌 지구를 재보적으로 그리고 빨리 해부하는 기술을 기술합니다. 이러한 뚜렷한 영역을 해부하면 균형, 운동, 영향 및 인식에 대한 독특한 기여의 기초가 될 수 있는 분자 메커니즘의 탐사를 허용합니다. 이 기술은 또한 각종 마우스 질병 모형을 통해 이 특정 지역의 병리학 감수성에 있는 다름을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

이러한 실험을 위해, 41주 된 암컷 야생형 C57/Black6 마우스가 사용되었다. 한 마우스는 '대량 소뇌'라고 불리는 전체 소뇌 해부를 실시하는 데 사용되었으며 해부 된 부위의 RNA 수준을 전체 해부에 비교할 수 있었습니다. 다른 3개의 마우스는 이 프로토콜에 기재된 소뇌 해부를 수행하기 위하여 이용되었다. 3개의 마우스를 사용하여 RNA의 수준에서 검출된 동향이 마우스를 통...

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Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

다른 소뇌 영역은 뚜렷한 행동 출력에 있는 역할을 하기 위하여 연루되었습니다, 그러나 근본적인 분자 기계장치는 알려지지 않은 남아 있습니다. 이 작품은 RNA를 분리하고 유전자 발현의 차이를 테스트하여 분자 차이를 조사하기 위해 반구, 전방 및 후방 영역 및 깊은 소뇌 핵의 소뇌 피질을 재현하고 신속하게 해부하는 방법을 설명합니다.

분자 분석을 위한 소뇌 지역 해부

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.0K 조회수.  University of Minnesota. 다른 소뇌 영역은 뚜렷한 행동 출력에 있는 역할을 하기 위하여 연루되었습니다, 그러나 근본적인 분자 기계장치는 알려지지 않은 남아 있습니다. 이 작품은 RNA를 분리하고 유전자 발현의 차이를 테스트하여 분자 차이를 조사하기 위해 반구, 전방 및 후방 영역 및 깊은 소뇌 핵의 소뇌 피질을 재현하고 신속하게 해부하는 방법을 설명합니다.

비디오: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

연구

신경과학

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex (mPFC) or nucleus accumbens. The challenge in this work is to dissect the correct area while preserving the microenvironment to be examined. In this paper, we describe a simple, low-cost method using resources readily available in most labs. This method preserves nucleic acid and proteins by keeping the tissue frozen throughout the process. Brains are cut into 0.5&#8211;1.0 mm sections using a brain matrix and arranged on a frozen glass plate. Landmarks within each section are compared to a reference, such as the Allen Mouse Brain Atlas, and regions are dissected using a cold scalpel or biopsy punch. Tissue is then stored at -80 &#176;C until use. Through this process rat and mouse mPFC, nucleus accumbens, dorsal and ventral hippocampus and other regions have been successfully analyzed using qRT-PCR and Western assays. This method is limited to brain regions that can be identified by clear landmarks.

This procedure describes the collection of discrete frozen brain regions to obtain high-quality protein and RNA using inexpensive and commonly available tools.

다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

정확하고 심도 있는 정량적 프로테아메 분석을 위한 성인 Subependymal 영역의 극저온 단면 해부

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

구조적 자기 공명 영상을 사용하여 인간의 소뇌 회색 물질 Morphometry를 검사하기위한 표준화 된 파이프 라인

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>소뇌 Purkinje 세포: 유기형 배양에서의 DNA 손상 반응

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional activity, making them particularly vulnerable to DNA damage. This necessitates an efficient DNA damage response (DDR) to prevent cerebellar degeneration, often initiated by PC dysfunction or loss. A notable example is the genome instability syndrome, ataxia-telangiectasia (A-T), marked by progressive PC depletion and cerebellar deterioration. Investigating DDR mechanisms in PCs is vital for elucidating the pathways leading to their degeneration in such disorders. However, the complexity of isolating and cultivating PCs in vitro has long hindered research efforts. Murine cerebellar organotypic (slice) cultures offer a feasible alternative, closely mimicking the in vivo tissue environment. Yet, this model is constrained to DDR indicators amenable to microscopic imaging. We have refined the organotypic culture protocol, demonstrating that fluorescent imaging of protein-bound poly(ADP-ribose) (PAR) chains, a rapid and early DDR indicator, effectively reveals DDR dynamics in PCs within these cultures, in response to genotoxic stress.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 운동실조증-모세혈관확장증에서 ATM의 역할 해독 및 관련 소뇌 변성

Cerebellar Purkinje cells (PCs) are particularly sensitive to deficiencies in the DNA damage response. A protocol is presented for the visual evaluation of the dynamics of PC response to DNA damage, which involves staining protein-bound poly(ADP-ribose) chains within cerebellar organotypic cultures.