이 작품은 어린이 암 연구 기금 (CCRF)과 NIH R01 AI146009에서 B.S.M에 의해 지원되었습니다.

건강한 기증자로부터 류카페레시스 샘플을 현지 혈액 은행에서 수득하였다. 여기에 설명된 모든 실험은 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 연구를 면제하기로 결정하고 미네소타 대학의 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 모든 실험은 멸균/무균 기술과 적절한 생물안전 수준-2 장비로 혈중 병원체에 대한 보편적인 예방 조치에 따라 수행되었습니다.
1. B 세포 확장 매체에 대한 보충제 를 준비
<ol><li>CpG 올리고뉴클레오티드를 1 mg/mL의 농도로 재구성합니다.</li>
	<li>CD40 리간드(CD40L)를 100 μg/mL의 농도로 재구성합니다.</li>
	<li>재구성 인간 IL-10 (rhIL-10) 50 μg/mL의 농도.</li>
	<li>재조합 인간 IL-15(rhIL-15)를 10 μg/mL의 농도로 재구성한다. 참고: 각 보충제를 -20°C ~ -80°C에서 최대 6개월 동안 작은 알리쿼트에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 기저 매질 준비
<ol><li>B 세포 기저 배지를 체외 면역 세포 확장(예를 들어, CTS 면역 세포 SR) 및 1% (v/v) 페니실린 및 연쇄상 구균신을 위한 배지 보충제를 결합합니다.</li>
	<li>0.22 μm 필터 어댑터를 사용하여 기저 배지를 살균 된 병에 필터 로 살균합니다.</li>
	<li>기초 매체를 최대 1개월 동안 4°C로 유지합니다.</li>
</ol>3. B 셀 팽창 매체 준비
<ol><li>5 × 105 세포/mL에서 B 세포를 배양하기 위해 기저 배지의 필요한 양을 멸균 용기로 이송한다.</li>
	<li>1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10, 및 10 ng/mL rhIL-15로 기저 배지를 보충합니다.</li>
	<li>0.22 μm 필터를 사용하여 B 셀 팽창 매체를 필터링합니다.</li>
	<li>37°C에서 조직 배양 인큐베이터에서 B 세포 팽창 배지를 평형화하고, 5%CO2를 사용 전에 최소 30분 동안 습도를 갖는다. 참고: 신선한 B셀 팽창 매체를 준비하여 하루 동안 사용할 수 있습니다. 며칠 동안 사용할 B 셀 팽창 매체를 준비하지 마십시오. 이 미디어 레시피는 메모리 B 세포의 증식과 1차 인간 B 세포의 활성을 장려합니다.</li>
</ol>4. 인간 B 세포 정화 및 확장
참고: 제조업체의 지시에 따라 온도 조절 냉동 용기에 99-100% 이소프로필 알코올을 추가하고 4.1단계를 시작하기 전에 4°C에서 냉동 용기를 식힙니다.
<ol><li>백혈구 샘플에서 PBMC를 분리
	<ol>
<li>백혈병 시료(약 8-10mL)를 멸균 50mL 원추형 튜브로 옮는다.</li>
		<li>멸균 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 35mL로 볼륨을 키우십시오.</li>
		<li>밀도 그라데이션 배지의 15mL에 35mL 백혈병 샘플을 조심스럽게 층.</li>
		<li>500× g에서 25분 동안 브레이크없이 원심분리기, 버피 코트(PBMC 층)를 방해하지 않고 플라즈마 층을 제거하고, 인터페이스에서 PBMC를 수집하고, 새로운 멸균 50mL 원문 튜브로 이송한다.</li>
		<li>PBMC를 50mL로 1배 PBS로 키우세요.</li>
		<li>500 × g의 원심분리기는 브레이크 없이 5분 동안. 빨간색으로 나타날 수 있는 PBMC 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다.</li>
		<li>7mL의 암모늄 염화물 칼륨 용해 버퍼, 파이펫3번을 넣고 잘 섞어 주며, 실온(RT)에서 3분 동안 배양합니다.</li>
		<li>1배 PBS로 50mL로 볼륨을 올래세요.</li>
		<li>400 × g의 원심분리기는 5분 동안 저저항 브레이크를 장착합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. 펠릿은 분홍빛이 도는 또는 흰색으로 보일 것입니다. 참고: 새로 분리된 B 세포를 계속 배양하려면 B 세포 분리(Step 4.2)를 시작하기 전에 B 세포 팽창 매체를 준비한다.</li>
	</ol></li>
	<li>인간 1차 B세포 음성 격리 키트를 사용하여 PBMC로부터의 B세포 절연
	<ol>
<li>격리 버퍼에서 PBMC를 5× 107 셀/mL의 농도로 재연한다. 참고: 총 PBMC 수가 5× 107셀 미만인 경우 격리 버퍼의 부피를 축소하여 5× 10 7셀/mL을 유지합니다. 셀 서스펜션의 최소 및 최대 볼륨은 각각 0.25 mL 및 8 mL입니다.</li>
		<li>최대 8mL(5 × 10 7셀/mL)을 캡이 있는 멸균, 폴리프로필렌, 라운드 하단 튜브로 옮길 수 있습니다.</li>
		<li>50 μL/mL의 칵테일 인핸서를 PBMC에 추가합니다.</li>
		<li>50 μL/mL의 격리 칵테일을 PBMC에 추가하고 튜브를 캡하고 혼합하려면 2-3번 반전합니다.</li>
		<li>5 분 RT에서 인큐베이션; 인큐베이션의 4분에서, 적어도 30 s에 대한 소용돌이 자기 마이크로 비드.</li>
		<li>PBMC 1mL당 자기 마이크로비드 50μL을 옮기고 튜브를 캡하고 혼합하려면 2-3회 반전합니다.</li>
		<li>격리 버퍼로 최대 10mL를 위로 하고 2~3회 위아래로 부드럽게 파이펫을 올로 합니다.</li>
		<li>튜브를 자기 스테이션에 놓고 RT에서 3 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>자석과 튜브를 함께 잡고 한 번의 동작으로 자석과 튜브를 함께 반전하여 세포 현탁액을 새로운 튜브에 붓습니다. 오래된 튜브를 폐기합니다.</li>
		<li>4.2.8을 반복하고(잠복기 시간을 2분으로 줄이면) B세포 현탁액을 깨끗한 원문 튜브에 붓습니다.</li>
		<li>농축된 B 셀은 사용할 준비가 되어 있습니다. 세포가 즉시 사용되는 경우 4.3(인간 B 세포 확장)을 계속합니다. 유동 세포측정(선택 사항)에 의해 격리된 B 세포의 순도를 확인합니다. 사용 전에 세포를 동결해야 하는 경우 4.2.12 단계를 계속합니다.</li>
		<li>B 세포를 동결하려면 원심분리기가 400 g에서 5분 동안 ×, 펠릿을 방해하지 않고 상퍼탄을 폐기한다.</li>
		<li>107 세포/mL에서 동결 배지에서 세포를 다시 중단하고, 알리쿼트 1 mL/극저온.</li>
		<li>냉장 냉동 용기에 냉동 을 놓고 하룻밤 -80 °C에 보관하십시오. 이어서, 냉동 극저온을 액체 질소 탱크로 이송; 냉동 셀을 최대 1년까지 유지합니다. 참고: 격리된 B 셀의 예상 수율은 총 PBMC의 2%-8%이며, 95%-99%의 생존율이 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>인간 B 세포 확장 참고: 새로 분리된 B 셀을 사용하는 경우 4.3.1-4.3.5 단계를 건너뜁니다. 세포를 계산하고 필요한 수의 세포를 멸균 원문 튜브로 옮기고 4.3.6 단계로 계속합니다.<ol>
<li>B 세포를 해동하기 전에 수조에서 전따뜻한 태아 소 혈청 (FBS). B세포 팽창 배지 20mL를 준비하고, T25 플라스크로 이송하고, 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2,습도)에서 배지를 미리 평형화하여 사용하기 최소 15분 전에 준비한다.</li>
		<li>37°C 수조에서 B 세포를 해동합니다. 기다리는 동안, 멸균 15 mL 원문 튜브로 미리 따뜻워진 FBS의 2mL를 전송합니다.</li>
		<li>B 세포가 완전히 해동된 후 즉시 1mL의 미리 따뜻하게 된 FBS를 샘플에 드롭 와이즈로 추가합니다. 1 분 동안 RT에서 인큐베이션.</li>
		<li>부드럽게 파이펫을 사용하여 시료를 다시 중단하고 전체 부피를 드롭와이즈로, 미리 데워진 FBS 2mL가 들어있는 원적 튜브로 옮킨다.</li>
		<li>멸균 1x PBS, 캡으로 15mL로 볼륨을 가져와 튜브를 부드럽게 2-3번 반전시면 됩니다.</li>
		<li>원심분리기 400 × g에서 5분 동안.</li>
		<li>셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리고, 미리 평형된 B 세포 팽창 배지의 1mL로 세포 펠릿을 재보설하고, 세포를 계산한다. 총 세포 수는 약 107개의 세포여야 합니다.</li>
		<li>미리 평형된 B-셀 팽창 배지의 20mL를 포함하는 플라스크로 세포를 전송한다. 세포의 최종 농도는 약 5 x 105 세포/mL이어야 한다.</li>
		<li>플라스크를 조직 배양 인큐베이터에서 수직으로 배양합니다.</li>
		<li>B 세포의 전체 부피를 멸균 원성 튜브로 이송하고 4.3.6-4.3.9 단계를 반복하여 2일마다 확장 배지를 완전히 새로 고칩니다. 참고: T25 플라스크는 10~20mL의 매체를 보유할 수 있습니다. T75 플라스크는 최대 20-60mL의 매체를 보유할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 1차 인간 B 세포 공학
<ol><li>최적의 결과를 위해 확장/활성화 후 48 ± 2h의 엔지니어 B 셀. B세포 팽창 배지, 알리쿼트 1mL의 배지를 48웰 조직 배양 판으로 준비하고, 사용하기 최소 15분 전에 조직 배양 인큐베이터에서 미리 평형화한다. 참고: 관심 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 sgRNA를 설계할 때 아래에 설명된 단계를 따르십시오. - 온라인 도구(11)를사용하여 sgRNAs를 설계합니다. - 단백질의 모든 동소 형태에 공통적인 엑폰에 sgRNA를 디자인합니다. - 평판 좋은 회사에서 화학적으로 변형 된 sgRNA를 주문합니다. - sgRNA는 일반적으로 lyophilized 형태로 온다; 멸균 DNase/RNase-free Tris-EDTA(TE) 버퍼에서 sgRNA를 1 μg/μL의 농도로 재구성합니다.</li>
	<li>화학적으로 변형된 연쇄상 구균 표진 Cas 9(S.p. Cas9) 핵을 트랜스페션 반응당 1.5 μL(1 μg/μL)로 화학적으로 변형한 sgRNA의 1μL(1 μg/μL)을 혼합하여 CRISPR/Cas9 횡단 기판을 준비한다. 제어를 위해 sgRNA 대신 TE 버퍼 1μL을 사용합니다. 참고: CD19 sgRNA유전자 KO 실험에 사용되는 경우, 결과에 대한 그림 2를 참조하십시오. AAVS1 sgRNA가 유전자 KI 실험에 사용되는 경우, 결과에 대한 그림 5를 참조하십시오.<ul>
<li>모든 구성 요소를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ul></li>
	<li>부드럽게 혼합하고 0.2 mL 8 튜브 스트립의 튜브로 반응 당 기판을 변형 CRISPR / Cas9의 2.5 μL을 전송; RT에 따로 설정합니다.</li>
	<li>핵포펙터(electroporator)를 켜고 표 1에도시된 바와 같이 형질 전환 시약을 준비한다. 참고: 필요한 경우 모든 시약을 얼음에 올려 놓음으로써 일시 중지를 위한 좋은 단계입니다. 실험을 다시 시작할 준비가 되면 모든 시약을 얼음에서 제거합니다. S.p. Cas9 단백질을 사용하는 경우, 조사관은 S.p. Cas9 단백질의 5 μg와 1 μg sgRNA를 혼합하여, 거품을 피하고, 최적의 결과를 사용하기 전에 RT에서 혼합물을 배양하여 사전 복합적인 CRISPR/Cas9-sgRNA 리보뉴클레오프로틴을 사용해야 합니다.</li>
	<li>수축 반응당 106B 세포를 멸균 원문 튜브로 카운트 및 이송한다.</li>
	<li>멸균 1x PBS로 15mL로 볼륨을, 원심분리기는 400 × g에서 5분 동안 드물다. 기다리는 동안 1차 세포 형질 전환 시약을 준비하고(표 2)RT에 따로 둡니다.</li>
	<li>셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.</li>
	<li>멸균 10mL의 멸균 1x PBS및 원심분리기의 10mL로 세포 펠릿을 400 g에서 5분 동안 ×.</li>
	<li>셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 완전히 버리십시오.</li>
	<li>106B 세포당 화학적으로 변형된 GFP mRNA(transfection 리포터로서)의 0.5 μg를 세포 펠릿(선택 사항)으로 이송한다.</li>
	<li>106 B 세포 당 20 μL 1 차 세포 형질 전환 시약으로 세포 펠릿을 다시 일시 중단; 5-6회 파이프팅으로 부드럽게 섞으세요. CRISPR/Cas9 경질 기판의 2.5 μL을 포함하는 8튜브 스트립의 0.2 mL 튜브로 경질 반응당 20.5 μL을 전송한다.</li>
	<li>파이펫을 한 번 위아래로 위아래로 사용하여 전체 부피(23 μL)를 배분 큐벳으로 혼합하고 전송합니다. 뚜껑을 덮고 벤치에 있는 큐벳을 가볍게 눌러 액체가 큐벳 바닥을 덮도록 합니다.</li>
	<li>형질 전환에 대한 핵혈에 인간 1 차 B 세포 프로토콜을 사용합니다. 참고: 핵포펙터(electroporator)를 배치하고 조직 배양 후드 외부에 사용할 수 있다. 큐벳을 캡하여 멸균을 보장합니다.</li>
	<li>15 분 동안 RT에서 큐벳에 전기 폴레이션 된 세포를 휴식.</li>
	<li>조직 배양 판에서 구형 B세포 팽창 배지의 80 μL을 큐벳내의 형질 반응으로 옮기다. 조직 배양 인큐베이터에 큐벳을 30분 동안 배치합니다.</li>
	<li>큐벳으로부터 샘플의 전체 부피를 혼합하여 B-세포 팽창 배지의 1mL를 포함하는 48웰 조직 배양 플레이트의 적절한 우물로 몇 번 부드럽게 파이펫을 한다. 세포의 최종 농도는 106 세포/mL이어야 한다.</li>
	<li>유전자 KI 실험을 수행하는 경우, 500,000개의 복합감염에서 rAAV6 벡터를 전기화 세포를 적절히 함유하는 적절한 우물으로 이송(약 45분 전극 후 전자기분). 도 4A에서예제 rAAV6 벡터 구문 어를 참조하십시오. 참고: 예를 들어, 제어 샘플은 CRISPR/Cas9 또는 rAAV6 벡터 없이 전기포게됩니다. 벡터 전용 샘플은 CRISPR/Cas9 없이 전극된 다음 rAAV6 벡터로 변환됩니다. KI 샘플은 CRISPR/Cas9로 전포된 다음 rAAV6 벡터로 변환됩니다. rAAV6에는 HDR용 대상 DSB 사이트의 상류 및 하류에 동생병 이 포함되어야 합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C, 습도가 5%CO2에 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	<li>셀을 계산하고 1 일째 에 생존력을 기록합니다.</li>
	<li>세포를 계산한 다음 세포의 전체 부피를 깨끗한 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 이송하여 2 일마다 B 세포 팽창 배지를 새로 고칩니다. 원심분리기 는 400 × g에서 5 분 동안, 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 폐기하십시오. 신선한 B 세포 팽창 배지의 100 μL로 세포를 다시 중단하고 24웰 조직 배양 판의 우물로 옮김합니다. 5 × 105 세포/mL에서 최종 세포 농도를 달성하기 위해 중간 부피를 키우십시오. 참고 : 48 웰 플레이트는 최대 1 mL 중간 / 우물을 보유 할 수 있습니다; 24웰 플레이트는 최대 2mL 중간/웰을 보유할 수 있습니다. 12웰 플레이트는 최대 4mL 중간/웰을 보유할 수 있으며, 6웰 플레이트는 최대 8mL 중간/웰을 보유할 수 있습니다.</li>
	<li>유동 세포 분석, TIDE 분석 및 접합 PCR과 같은 다운스트림 분석을 수행하기 전에 엔지니어링 된 셀을 최소 5 일 동안 확장할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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M.J.J. K.L., B.S.M를 발명자로 사용하여 게놈 편집 B 세포를 만들고 사용하는 방법에 대한 특허가 출원되었습니다. B.S.M 는 임무소프트의 주식을 컨설턴트로 운영하고 있으며, B.S.M 연구소에서 연구를 후원하고 있습니다.

1차 인간 B 세포에 있는 정확한 게놈 공학은 최근9,10까지도전적이고 있습니다. 우리는 이전에 CRISPR / Cas9를 사용하여 기본 인간 B 세포9을설계하는 프로토콜을 발표했습니다. 여기서는 CD19의 효율적인 KO 또는 노크인 EGFP를 위해 B-셀 격리, 확장 및 엔지니어링을 위한 향상된 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
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B 세포는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 림프구 계보의 하위 그룹이다. 그(것)들은 면역 도전1에응하여 항체의 다량을 생성하여 적응성 유머 면역 계통에 있는 중요한 역할을 능력을 발휘합니다. B세포는 또한 기억 B 세포의 전구체이며 말단 분화되고 수명이 긴 혈장 세포로, 지속적인 유머 면역2를제공한다. 플라즈마 세포, 특히, 년 또는 수십 년 동안 생존하는 동안 특정 항체의 다량을 생산하는 능력에 면역 세포 중 고유3. 또한, 말초 혈액으로부터의 분리의 용이성은 B 세포 혈통을 새로운 세포 기반 치료에 대한 우수한 후보로 만든다4.
이전에는 렌티바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포슨을 사용하는 것과 같은 임의의 통합 방법이 트랜스진 전달 및 발현5,6,7,8을위해 B 세포를 설계하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이들 접근법의 비특이적 특성은 B 세포에서 특정 유전자의 생물학적 기능을 연구하기가 어렵게 만들고 치료 환경에서 삽입 돌연변이 발생 및 가변 적인 유전자 발현 및/또는 침묵의 본질적인 위험을 수반한다.
CRISPR/Cas9 시스템은 연구원이 수많은 종의 다양한 세포의 게놈을 정확하게 편집할 수 있는 강력한 게놈 엔지니어링 도구입니다. 최근에는 우리 자신을 포함한 두 그룹이 1차 인간 B 세포의 전 생체 확장 및 표적 게놈 공학을 위한 방법을 성공적으로 개발하였다9,10. 우리는 백혈구 샘플에서 1 차적인 인간 B 세포를 정화하는 과정을 설명할 것입니다. 그 후, 우리는 B 세포 확장 및 격리 된 B 세포의 활성화를위한 업데이트 된 프로토콜을 설명 합니다. 그런 다음 CD19 sgRNA와 함께 CRISPR/Cas9 mRNA를 활성화된 B 세포로 도입하기 위해 전기화에 의한 특정 B 세포 수용체 및 B 세포의 특징인 분화 19(CD19)의 클러스터를 노크하는 과정을 설명할 것입니다.
Cas9 mRNA는 변환되고 CRISPR/Cas9-sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 형성하기 위해 CD19 sgRNA에 결합한다. 이어서, 복합체내의 sgRNA는 Cas9를 이끌고 유전자의 엑슨 2에 대한 표적 서열에서 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. 세포는 뉴클레오티드를 도입하거나 삭제하여 "비 동종 종결합"에 의해 DSB를 복구하여 프레임 시프트 돌연변이로 이어지고 유전자가 기절하게 합니다. 그런 다음 유동 세포측정에 의한 CD19의 손실을 측정하고 분해(TIDE) 분석을 통해 인델 형성을 추적하여 인델 형성을 분석합니다.
그런 다음 CRISPR/Cas9를 재조합 AAV6 벡터(rAAV6, 상동성 지향 수리(HDR)를 위한 기증자 템플릿)을 사용하여 아데노 관련 바이러스 통합 사이트 1(AAVS1) 유전자에서 향상된 녹색형광단백질(EGFP)의 사이트별 삽입을 중재하는 과정을 설명합니다. AAVS1 유전자는 알려진 생물학적 기능 없이 활성 궤적이고 인간 게놈에 AAV 바이러스 통합 부위; 따라서 게놈 공학을 위한 "안전한 항구"로 간주됩니다. 여기서, B 세포의 팽창 및 활성화는 배양7일에서 최대 44배의 확장을 허용했다는 것을보고합니다(그림 1). B 세포의 전기기화는 24시간 후 형질전환에서 전체 세포건강(도 2A)의경미한 감소를 보였다. CD19마커(도 2B)의분산 플롯 분석은 편집된 셀(도2C)에서최대 83% 감소하는 것으로 나타났다.
크로마토그래프(도3A)의조류 분석은 %인델이 혈류 세포측정(도3B)에의한 %의 단백질 손실과 유사하다는 것을 밝혔다. KI 실험의 유동 세포 분석분석은 RNP와 함께 AAV벡터(도 4)를받은 세포가 최대 64% EGFP 양성 세포(도5A)까지표현되고 나중에 접합 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)(도5B)에의해 성공적인 통합을 표시한 것으로 나타났다. 셀 카운트는 모든 샘플이 엔지니어링 후 3일 이내에 신속하게 회수된 것으로나타났습니다(그림 5C).

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Cryostor CS10, 100 mL</td><td>STEMCELL Technology</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep human B cells isolation kit</td><td>STEMCELL Technology</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-cell basal medium</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>S11550</td><td>For thawing B cells only</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&amp;reg; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40 Ligand</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B 세포는 조혈 줄기 세포에서 파생된 림프구이며 적응성 면역 계통의 유머 팔의 핵심 성분입니다. 그(것)들은 말초 혈액에서 고립의 그들의 용이성 때문에 세포 기지를 둔 치료를 위한 매력적인 후보자, 시험관에서 확장하는 그들의 기능 및 생체 내의 그들의 장수 때문에. 또한, 그들의 정상적인 생물학적 기능-많은 양의 항체를 생산 하는-감염 을 싸우는 재조합 항체 와 같은 치료 단백질의 매우 많은 금액을 표현 하기 위해 활용 될 수 있다, 또는 효소 의 치료를 위한 효소. 여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 1 차인간 B 세포를 격리하고 시험관 내에서 고립된 B 세포를 활성화/확장하는 상세한 방법을 제공합니다. 그런 다음 B 세포에서 내인성 유전자의 사이트 별 KO를 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 데 관련된 단계를 시연합니다. 이 방법은 관심있는 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 다양한 유전자의 효율적인 KO를 허용합니다. 그런 다음 CrispR/Cas9 시스템을 B 세포에서 트랜스진 발현 카세트의 효율적인 현장 별 통합을 위한 재조합, 아데노 관련, 바이러스(rAAV) 벡터와 함께 사용하는 단계를 시연합니다. 이 프로토콜은 유전자의 생물학적 기능뿐만 아니라 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 1 차 인간 B 세포에서 사용할 수 있는 단계별 엔지니어링 플랫폼을 제공합니다.

업데이트된 확장 및 활성화 프로토콜은 7일 만에 최대 44배까지 B 셀의 급속한 확장을 가능하게하였다(그림 1;n=3 기증자). KO 실험에서, Trypan 블루 염색을 이용한 B 세포 수는 24시간 전기포화에서 대조군 과 CD19 KO 샘플 모두에서 세포 회수가 약간 감소하는 80% 이상의 실행 가능한 세포를보였다(도 2A;p ≥ 0.05, n=3 기증자). 이 결과는 전기기분해가 전반적인 B...

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K 조회수.  University of Minnesota. 여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

비디오: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

연구

암 연구학

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

유전학

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

A Guide to Precise Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived macrophages(원발성 골수 유래 대식세포의 정확한 유전자 파괴에 대한 가이드)

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

저자 스포트라이트: 정확한 유전자 파괴를 위한 골수 유래 대식세포의 효율적인 CRISPR/Cas9 게놈 편집

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

면역학 및 감염병학

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

요약

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이 비디오의 챕터

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산