이 프로토콜은 파킨슨 병에서 손실되는 도파민성 뉴런에서 칼슘 플럭스를 정량화합니다. 이것은 이상한 칼슘이 파킨슨 병에서 도파민성 뉴런 손실을 일으키는 방법을 이해하는 데 유용합니다. 처음으로, 우리는 배양 된 1 차적인 중뇌 뉴런에서 자발적인 칼슘 플럭스를 보여줍니다.
이 방법은 칼슘 매개 세포사멸에 관여하는 특정 수용체 기여를 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 방법은 파킨슨 병에 대한 구체적이고 효과적인 신경 보호 화합물을 발견 할 수있는 고함량 약물 화면에 대한 길을 제공합니다. 이러한 신경 보호 화합물 도파민 성 뉴런에서 칼슘 매개 석 각멸을 방지 할 것 이다.
요리 당 hSyn-GCaMP6f AAV의 마이크로 리터 1개와 함께 세럼이 없는 DMEM 배지 1밀리리터를 준비하여 시작합니다. 각 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고 준비된 DMEM의 1밀리리터로 hSyn-GCaMP6f로 대체한다. 1시간 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 다시 접시를 넣습니다.
인큐베이션 후, 배지를 AAV로 흡인시키고 세포 배양 배지의 3밀리리터로 대체한다. 5~7일 동안 섭씨 37도에서 요리를 배양합니다. 바이러스 감염의이 기간 동안 매 2 ~ 3 일 마다 매체를 변경.
HEPES 레코딩 버퍼 1리터, 20개의 마이크로몰라 글루타메이트 레코딩 버퍼 200밀리리터, 원고 지시에 따라 10마이크로몰러 NBQX 레코딩 버퍼 200밀리리터를 준비한다. 멸균 35밀리미터 페트리 접시에 레코딩 버퍼 3밀리리터를 채웁니다. 인큐베이터에서 감염된 배양물로 페트리 접시를 가져 간 다음, 조심스럽게 미세 한 팁 집게로 하나의 커버 슬립의 가장자리를 잡고 녹음 버퍼와 접시에 전송합니다.
나머지 커버 슬립을 37도 인큐베이터에 다시 넣고 레코딩 버퍼로 접시를 공초점 현미경으로 운반합니다. 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 초기화하는 동안 연동 펌프를 시작하고 라인을 레코딩 버퍼에 넣습니다.
그런 다음 흐름을 분당 2 밀리리터로 보정합니다. 감염된 커버 슬립을 페트리 접시에서 미세한 집게로 녹음 욕조로 옮기습니다. 10X 수분 침수 목표와 밝은 조명을 사용하여 초점 평면을 찾아 뉴런 세포 체의 밀도가 높은 영역을 찾은 다음 40X 목표로 전환하여 시료에 다시 초점을 맞춥니다.
염료 목록 창에서 AlexaFluor 488을 선택하고 적용합니다. 형광의 과다 노출 및 사진 표백을 방지하기 위해 낮은 HV 및 레이저 전원 설정으로 시작합니다. AlexaFluor 488 채널의 경우 HV를 500으로 설정하고 게인을 1x로 설정하고 오프셋을 0으로 설정합니다.
488 레이저 라인의 전력을 5%로 설정합니다. 핀홀 크기를 300 마이크로미터로 늘리고 초점 x2 스캐닝 옵션을 사용하여 방출 신호를 하위 수준으로 최적으로 조정합니다. 그런 다음 각 채널의 최적의 가시성을 위해 설정을 조정할 수 있습니다.
현미경 설정이 최적화되면 스테이지를 이동하여 GCaMP6f 형광의 자발적인 변화를 표시하는 여러 세포가 있는 영역을 찾고 이미징을 위해 원하는 평면에 집중합니다. 클립 직사각형 도구를 사용하여 이미징 프레임을 1초 미만의 프레임 간격으로 달성할 수 있는 크기로 잘라냅니다. 간격 창을 값1.0값과 Num 창을 600으로 설정합니다.
t 시리즈 동영상을 캡처하려면 시간 옵션을 선택한 다음 Xyt 검색 옵션을 사용하여 이미징을 시작합니다. 이미징 진행률 막대를 보고 HEPES 레코딩 버퍼에서 적절한 시점의 20 마이크로몰러 글루타메이트 레코딩 버퍼로 라인을 이동합니다. 이미징이 완료되면 시리즈 완료 버튼을 선택하고 완성된 t 시리즈 동영상을 저장합니다.
뉴런의 문화가 총 10 분 동안 글루타민에 노출되도록 추가 5 분 동안 글루타민을 퍼프합니다. 각 커버 슬립에 대해 이 프로세스를 반복하여 이미지화합니다. 실험 직후 칼슘 흔적과 신경 세포 체를 볼 수 있다.
타원 도구를 사용하여 신경 소종 주위에 원하는 수의 ROI를 그립니다. 그리고 계열 분석 버튼을 사용하여 추적을 시각화합니다. 글루타민에 추가로 5 분 노출 후, 미세 한 포셉목욕에서 커버 슬립을 제거하고 모든 이미징이 완료 될 때까지 기록 버퍼와 페트리 접시에 다시 배치합니다.
이미징 의 날에, VM 배양은 글루타민트 또는 글루타민산염과 NBQX의 조합으로 취급되었습니다. 두 조건 모두에서, GCaMP6f 꽃에 있는 이기종 및 자발적인 변경은 자발적인 칼슘 플럭스를 나타내는 관찰되었습니다. 글루타민의 응용 프로그램은 자발적으로 활성 및 정지 뉴런 모두에서 강력하고 지속적인 칼슘 반응을 생성했다.
NBQX의 응용 프로그램은 자발적인 활동을 감소시키고 글루타민트 반응을 부분적으로 차단했습니다. 글루타민병 적용이 각 조건에서 칼슘 반응을 자극하는 정도는 곡선 아래 영역, 피크 진폭 및 반응할 대기 시간을 사용하여 정량화되었다. 응답에 대한 대기 시간은 NBQX 및 글루타민트 조건하에서 증가했습니다.
글루타민산 매개 세포사멸을 측정하기 위해 세포는 항 카스파제-3 항체로 고정되고 염색되었다. 평균 caspase-3 강도 치료 되지 않은 컨트롤에 비해 두 치료 조건에서 상당히 높았다. 흥분된 독성 세포 사멸의 보다 철저한 분석은 면역스테인 티로신 하이드록실라제 양성 도파민성 뉴런의 수를 조절 및 글루타민산 처리 상태에서 계산하여 수행될 수 있다.
이 기술은 도파민성 뉴런에서 칼슘 매개 세포사멸에 관여하는 다른 수용체와 철 채널의 상대적 기여를 이해하는 길을 열었습니다.
