פרוטוקול זה מכמת שטפי סידן בנוירונים דופאמין, אשר הולכים לאיבוד במחלת פרקינסון. זה שימושי להבנת איך סידן חריג גורם אובדן נוירון דופאמין במחלת פרקינסון. בפעם הראשונה, אנו מדגימים שטפי סידן ספונטניים בנוירונים ראשוניים מתורבתים.
שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח תרומות קולטן ספציפי מעורב אפופטוזיס מתווך סידן. השיטה שלנו מספקת שדרה למסכי תרופות בעלי תוכן גבוה כדי לגלות תרכובות נוירו-הגנה ספציפיות ויעילות למחלת פרקינסון. תרכובות נוירו-פרוטקטיביות אלה ימנעו אפופטוזיס מתווך סידן בנוירון דופאמין.
התחל בהכנת מיליליטר אחד של מדיום DMEM ללא סרום עם מיקרוליטר אחד של hSyn-GCaMP6f AAV למנה. שאפו את מדיום תרבות התאים מכל מנה והחליפו אותו במיליליטר אחד של ה- DMEM המוכן עם hSyn-GCaMP6f. מניחים את הכלים בחזרה לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה, שאפו את המדיום עם AAVs והחלפו אותו בשלושה מיליליטר של מדיום תרבות התא. הדגירה את הכלים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. שינוי המדיום כל יומיים עד שלושה ימים לאורך תקופה זו של זיהום ויראלי.
הכן ליטר אחד של מאגר ההקלטות HEPES, 200 מיליליטר של מאגר הקלטת גלוטמט מיקרומולר 20, ו 200 מיליליטר של 10 מאגר הקלטה micromolar NBQX על פי הוראות כתב היד. מלאו צלחת פטרי סטרילית של 35 מ"מ בשלושה מיליליטר של חיץ ההקלטה. קח את צלחת פטרי עם תרבויות נגועות מן החממה, ואז בזהירות לתפוס את הקצה של להחליק כיסוי אחד עם מטסות קצה בסדר ולהעביר אותו לתוך המנה עם חיץ ההקלטה.
מניחים את החלקת הכיסוי הנותרת במדיום בחזרה לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס ולהעביר את המנה עם חיץ הקלטה למיקרוסקופ confocal. הפעל את תוכנת ההדמיה. בעת האתחול, הפעל את המשאבה הראשונית והצב את הקו במאגר ההקלטה.
ואז לכייל את הזרימה לשני מיליליטר לדקה. מעבירים את החלקת הכיסוי הנגועה מצלחת פטרי לאמבט ההקלטה עם מדפים עדין. באמצעות המטרה טבילת מים 10X ואור שדה בהיר, למצוא את מישור המיקוד ולחפש אזור עם צפיפות גבוהה של גופי תא נוירון, ולאחר מכן לעבור למטרה 40X ולמקד מחדש את המדגם.
בחר והחל את AlexaFluor 488 בחלון הרשימה צבעים. על מנת למנוע תפוקת יתר והלבנת תמונות של הפלואורופורים, התחל עם הגדרות כוח HV ולייזר נמוכות. עבור ערוץ AlexaFluor 488, הגדר את ה- HV ל- 500, את הרווח ל- 1x ואת ההיסט לאפס.
הגדר את העוצמה ל- 5% עבור קו הלייזר 488. הגדל את גודל חור הסיכה ל- 300 מיקרומטרים ושתמש באפשרות הסריקה של המוקד x2 כדי להתאים באופן מיטבי אותות פליטה לרמות תת-תאורציה. לאחר מכן ניתן להתאים את ההגדרות לנראות אופטימלית של כל ערוץ.
לאחר אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ, הזיזו את הבמה לאיתור אזור עם תאים מרובים המציגים שינויים ספונטניים בנורסצנטיות GCaMP6f והתמקדו במישור הרצוי להדמיה. השתמש בכלי תיקון קליפ כדי לגזור את מסגרת ההדמיה לגודל שיכול להשיג מרווח מסגרת של קצת פחות משנייה אחת. הגדר את חלון המרווח לערך של 1.0 ואת החלון Num ל- 600.
כדי ללכוד סרט מסדרת T, בחר באפשרות שעה ולאחר מכן השתמש באפשרות סריקת Xyt כדי להתחיל בהדמיה. צפה בר התקדמות ההדמיה והזז את הקו ממאגר ההקלטות של HEPES למאגר ההקלטות של 20 מיקרומולאר גלוטמט בנקודת הזמן המתאימה. לאחר השלמת ההדמיה, בחר את לחצן סיום הסדרה ושמור את הסרט המוגמר של סדרת T.
המשך לבלבל את גלוטמט במשך חמש דקות נוספות, כך התרבות של נוירונים נחשפו גלוטמט במשך סך של 10 דקות. חזור על תהליך זה כדי שכל שובר כריכה ידמיין. ניתן לראות עקבות סידן וגופי תאים עצביים מיד לאחר הניסוי.
השתמש בכלי אליפסה כדי לצייר את המספר הרצוי של ROIs סביב soma עצבי. ולהשתמש בלחצן ניתוח סדרה כדי לדמיין את העקבות. לאחר החשיפה הנוספים של חמש דקות לגלוטמט, מוציאים את החלקת הכיסוי מהאמבטיה עם מדפים עדיפים וממקמינים אותה בחזרה לצלחת פטרי עם חיץ ההקלטה עד שכל ההדמיה הושלמה.
ביום ההדמיה, תרבות ה-VM טופלו עם גלוטמט או שילוב של גלוטמט ו- NBQX. בשני התנאים נצפו שינויים הטרוגניים וספונטניים בפלורזנס GCaMP6f המצביעים על שטפי סידן ספונטניים. יישום גלוטמט יצר תגובת סידן חזקה ומתמשכת הן בנוירונים פעילים באופן ספונטני והן בנוירונים הרהוי.
היישום של NBQX הפחית את הפעילות הספונטנית, וחסם חלקית את תגובת הגלוטמט. המידה שבה יישום גלוטמט עורר תגובת סידן בכל תנאי היה מכומת באמצעות האזור מתחת לעקומה, משרעת שיא, ו latency להגיב. ההשהיה לתגובה גדלה תחת מצב NBQX וגלוטמט.
כדי למדוד אפופטוזיס מתווך גלוטמט, התאים היו קבועים מוכתמים בנוגדן נגד קפסה-3. עוצמת הקספסה-3 הממוצעת הייתה גבוהה משמעותית בשני תנאי הטיפול בהשוואה לפקדים לא מטופלים. ניתוח יסודי יותר של מוות תאים רעילים נרגש יכול להיעשות על ידי ספירת מספר immunostain טירוסין הידרוקסילאז נוירונים דופאמין חיובי בשליטה ומצב גלוטמט מטופל.
טכניקה זו סללה את הדרך להבנת התרומות היחסיות של קולטנים שונים וערוצי ברזל המעורבים באפופטוזיס מתווך סידן בנוירון דופאמין.
